專利名稱：造紙廢液作底物的特異培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用造紙廢液培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物學和生物化學等。
二.技術(shù)背景以物質(zhì)轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的化學加工業(yè)是國民生產(chǎn)的重要支柱之一，但傳統(tǒng)的化學加工過程是以人造的化學品和化學催化劑為媒介，其過程污染環(huán)境和效率低下是最突出的問題。因此，近年利用微生物的生物催化和生物轉(zhuǎn)化功能生產(chǎn)人類需要的物質(zhì)是研究開發(fā)非常活躍的領(lǐng)域，涉及食品加工，維生素，抗菌素的生產(chǎn)，生物新材料如，3-丙二醇，長鏈二元酸，乳酸等，酶制劑等領(lǐng)域。在酶制劑中，蛋白酶作為工業(yè)用酶廣泛用在工業(yè)加工過程中，如洗滌，制藥，食品，制革和絲綢等。其中，洗滌用酶是最主要的工業(yè)用酶。由于洗滌條件的特殊性，在堿性環(huán)境中能起作用的堿性蛋白酶是最為重要的工業(yè)用酶，占了全球酶產(chǎn)量的25％以上。
利用微生物的生物催化和生物轉(zhuǎn)化功能生產(chǎn)人類需要的物質(zhì)通常有六大營養(yǎng)要素碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水。常用的人工培養(yǎng)基是由葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵等組成，再加瓊脂使液體培養(yǎng)基固化。目前，堿性蛋白酶的生產(chǎn)可以通過芽孢桿菌發(fā)酵制得，研究發(fā)現(xiàn)，采用骨膠制成的半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)芽胞桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶比傳統(tǒng)的液體發(fā)酵可顯著提高堿性蛋白酶的單位產(chǎn)量。造紙廢液中含有大量的碳水化合物，通常具有很高的化學耗氧量和很強的堿性，可以用作培養(yǎng)微生物制備堿性蛋白酶的基本培養(yǎng)基。
我國目前造紙業(yè)每年產(chǎn)生的廢液超過25億噸，其中達標排放的僅有3億噸，其廢水排放量居輕工行業(yè)之首，占全國工業(yè)總排放量的11％，僅次于化學工業(yè)及鋼鐵工業(yè)的年排水量，居第三位。由于運行成本高，我國大多數(shù)造紙企業(yè)都只對中段水以下的廢水進行處理，而占總廢水排放量20％的黑液基本沒有處理，企業(yè)或者要么在污水暫存池存放廢水，要么偷偷將不合規(guī)格的廢水直接排入河流和湖泊。造紙廢水對環(huán)境的污染已嚴重影響我國公眾的身體健康。
微生物處理造紙廢水黑液的研究領(lǐng)域被譽為“從根本上降低能耗和消除污染的有效途徑”。目前限制微生物處理技術(shù)推廣應用的關(guān)鍵技術(shù)難點在于1)現(xiàn)有的微生物菌株要求廢液的pH6-9，化學耗氧量COD值不超過10000mg/升，使微生物處理還不能成為廢液處理的主要技術(shù)；2)缺乏能促進微生物快速在廢液中增殖的培養(yǎng)基。
通過基因工程或改良培養(yǎng)基等現(xiàn)代技術(shù)，可以使一些微生物能夠在極端環(huán)境中生長。如日本采用電極法處理培養(yǎng)基后，細菌Escherichia coli可以在pH大于10.5的強堿性條件下生長并分解殘留的有毒化合物。
三.

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是通過改良造紙廢液提供一種微生物培養(yǎng)基的配方，這種配方利用造紙廢液為原料制成了一種特異培養(yǎng)基，一方面可以廢物利用，解決造紙廢液處理存在的問題，另一方面可提供一種特殊的價格低廉的微生物培養(yǎng)基，使利用微生物進行的生物轉(zhuǎn)化如堿性蛋白酶的生產(chǎn)更具競爭力。
技術(shù)方案本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，微生物的生長需要的基本養(yǎng)分通常有六大營養(yǎng)要素碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水。
造紙廢液中含有大量的碳水化合物，無機鹽和水等。同時，由于廢液中的有機物含量極高，化學耗氧量(COD)和溶液的pH值很高，廢液基本不適合微生物生長。前期的一些研究發(fā)現(xiàn)在COD值在4028~10000mg/升，pH為7.5-8.5的造紙黑液中，微生物可以生長并部分去除COD。當廢液的pH高于9時，微生物基本不能生長。
本發(fā)明通過向造紙廢液中添加含氮化合物和生長因子提供一種促進細菌在廢液中快速增殖的培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基為造紙廢液加含氮化合物和生長因子，造紙廢液是造紙過程中產(chǎn)生的造紙黑液或中段水，COD值從10001到350000mg/升，pH從9.1到14。含氮化合物和生長因子是選自一種或多種無機和有機化合物如磷酸二氫鉀，尿素，酵母提取粉，海藻糖氨，麥芽提取粉，菇類多糖氨，蛋白質(zhì)，氨基酸，脂肪胺，芳胺，碳酸氫銨，碳酸銨，硫酸銨，磷酸銨(磷酸一銨，磷酸二銨)，硝酸，亞硝酸，硝酸鈣，硝酸銨，氨，氯化銨等。
本發(fā)明的實施步驟為1)固體培養(yǎng)基取造紙廢液1000毫升，加1克海藻糖氨，20克瓊脂，經(jīng)滅菌消毒后，取未消毒滅菌的造紙廢液劃線接種，在30℃下培養(yǎng)48小時后，獲得了一種周邊光滑，中心微凹陷，乳黃色的細菌菌落。
2)菌種制備取上述培養(yǎng)基上生長的菌落，用步驟1的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)48小時，制得菌種。
3)液體培養(yǎng)基取造紙廢液1000毫升，分別加入1克海藻糖氨和1克磷酸二氫鉀，經(jīng)滅菌消毒后，取步驟2的菌種接種，在30℃下?lián)u床上培養(yǎng)48小時，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵完成后制得菌液。
由于造紙廢液化學耗氧量(COD)和溶液的pH值很高，廢液基本不適合微生物生長。通過添加營養(yǎng)成分改良的造紙廢液培養(yǎng)基，使分離獲得的細菌微生物可以在造紙廢液培養(yǎng)基中快速生長，一方面可以降解造紙廢液中的COD，另一方面通過利用造紙廢液培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物制備有用物質(zhì)如堿性蛋白酶。本發(fā)明對于解決造紙廢液帶來的環(huán)境污染，降低微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，具有重要意義。
具體實施例方式
取造紙廢液200毫升，分別加入0.2克海藻糖氨和0.2克磷酸二氫鉀，經(jīng)滅菌消毒，接種菌種后在30℃下?lián)u床上培養(yǎng)48小時，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵完成后制得富含菌量的菌液，菌液中的菌體數(shù)達到3.9×106cfu/ml。
權(quán)利要求
1.一種用造紙廢液為主要原料配制而成的微生物培養(yǎng)基，其特征在于選擇造紙過程中產(chǎn)生的造紙廢液，與含氮化合物和生長因子配合而成的堿性微生物培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的造紙廢液包括但不局限于造紙黑液和中段水，化學耗氧量COD值從10001到350000mg/升，pH從9.1到14。最適造紙廢液COD值55000mg/升，pH9.5。
3.如權(quán)利要求1所述含氮化合物和生長因子包括但不局限于選自一種或多種無機和有機化合物如磷酸二氫鉀，尿素，酵母提取粉，海藻糖氨，麥芽提取粉，菇類多糖氨，蛋白質(zhì)，氨基酸，脂肪胺，芳胺，碳酸氫銨，碳酸銨，硫酸銨，磷酸銨(磷酸一銨，磷酸二銨)，硝酸，亞硝酸，硝酸鈣，硝酸銨，氨(氨氣，氨水)，氯化銨等。
4.如權(quán)利要求1所述微生物培養(yǎng)基，其特征在于所述配方的半固體培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度為海藻糖氨0.0001-50％，造紙廢液0.001-100％。最適配方為海藻糖氨1％，造紙廢液100％。
5.如權(quán)利要求1所述微生物培養(yǎng)基，其特征在于所述配方的固體培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度為含氮化合物和生長因子0.0001-50％，造紙廢液0.001-100％，瓊脂0.001-20％。最適配方為酵母提取粉0.1％，造紙廢液100％，磷酸二氫鉀0.1％，瓊脂2％。
6.如權(quán)利要求1所述微生物培養(yǎng)基，其特征在于所述配方的液體培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度為含氮化合物和生長因子0.0001-50％，造紙廢液0.001-100％。最適配方為酵母提取粉0.1％，造紙廢液100％，磷酸二氫鉀0.1％。
7.如權(quán)利要求4所述組分質(zhì)量濃度，按配方制成的溶液的化學耗氧量COD值為10到350000mg/升，pH值為7.1-14之間，最適COD值55000mg/升，最適pH值為9.5。
8.如權(quán)利要求5所述組分質(zhì)量濃度，按配方制成的溶液的化學耗氧量COD值為10到350000mg/升，pH值為7.1-14之間，最適COD值55000mg/升，最適pH值為9.5。
9.如權(quán)利要求6所述組分質(zhì)量濃度，按配方制成的溶液的化學耗氧量COD值為10到350000mg/升，pH值為7.1-14之間，最適COD值55000mg/升，最適pH值為9.5。
全文摘要
一種利用造紙廢液培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，使分離獲得的細菌微生物可以在造紙廢液培養(yǎng)基中快速生長，一方面可以降解造紙廢液中的化學耗氧量COD，另一方面通過利用造紙廢液培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物制備有用物質(zhì)如堿性蛋白酶等。本發(fā)明對于解決造紙廢液帶來的環(huán)境污染，降低微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，具有重要意義。
文檔編號C12N1/00GK101078002SQ20061002089
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月25日
發(fā)明者黃永 申請人:黃永