專利名稱：一種誘導干細胞向軟骨分化的物質和方法
技術領域：
本發明涉及醫學和生物醫學工程領域，更具體地涉及軟骨細胞或軟骨組織和/或兩者分泌的可溶性物質制備方法及其誘導干細胞向軟骨分化的方法和用途。
背景技術：
先天畸形、外傷、感染、腫瘤或骨軟骨炎等疾病均可以導致軟骨的缺損或損傷。由于軟骨組織損傷后自我修復能力很低，因此，軟骨缺損或損傷的治療一直是修復重建外科面臨的巨大挑戰。目前臨床上常用的治療手段包括自體軟骨的游離或帶蒂移植(主要取自體肋軟骨)、異體軟骨的游離移植、自體或異體軟骨細胞注射移植、骨膜或軟骨膜移植及應用人工假體等。但這些方法均存在明顯的缺點，如自體軟骨移植供體來源少、創傷大、移植后易吸收縮小，還可能出現各供區并發癥。異體和異種軟骨移植物不但具有免疫原性，而且存在傳播艾滋病、肝炎等病原體的危險。雖然人工合成的軟骨組織代用品具有制作簡單，使用方便等優點，但是替代材料只具備充填、支持及維持美觀的作用，缺少軟骨生物學功能，不是真正意義上的結構與功能重建，而且可能發生移植部位疼痛、人工代用品外露等問題，無法滿足患者的治療要求。
組織工程技術的興起為軟骨缺損的完美修復帶來了新的希望。其基本原理是將有特定功能的細胞與一定形狀的可降解生物材料結合，通過體外培養構建出有相應功能的活體組織用于組織缺損的修復，或直接將細胞-材料復合物植入體內組織缺損部位進行修復。軟骨是最早應用組織工程技術構建成功的組織，目前應用軟骨細胞為種子細胞在體內外已經能夠成功地構建出精確形狀的成熟軟骨組織。但獲取軟骨細胞同樣會面臨軟骨移植時存在的供區創傷大、供體來源不足及同種異體免疫排斥反應等問題，而且軟骨細胞體外大量擴增極易發生老化與去分化，常規培養傳代3～4次后即喪失軟骨形成能力。這些問題都是軟骨組織工程遲遲未能應用于臨床軟骨缺損治療的根本原因。因此，探索新的軟骨組織工程種子細胞來源勢在必行。
干細胞(stem cells)包括間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)的軟骨分化潛能已被許多研究充分證實。干細胞來源廣泛(可以來自骨髓、骨膜、軟骨膜、脂肪、皮膚、血管周膜、胚胎中胚層未分化的間充質細胞以及建系的胚胎干細胞等)，體外擴增能力強，免疫原性低，而且自體來源的干細胞取材創傷小、供區廣泛又不必擔心免疫排斥反應，因此，干細胞是目前軟骨組織構建的最佳種子細胞來源。
在干細胞軟骨定向分化及組織工程化軟骨構建的研究與應用中，選擇何種軟骨定向誘導方案一直是研究的難點和關鍵問題。現行的干細胞體外軟骨定向誘導方案主要分為兩大類一類是通過添加外源性誘導因子或細胞外基質成分促進干細胞軟骨分化。這種方法的主要缺點是操作繁復，誘導效率低，更重要的是誘導過程中添加的因子種類多、用量大、價格昂貴，不利于大規模臨床推廣應用。另一類誘導方法是將有軟骨誘導作用的某些蛋白或生長因子的重組DNA通過轉基因技術導入干細胞，誘導其向軟骨定向分化。應用轉基因技術雖然提高了分化效率，降低了成本，但由于存在安全性(致瘤性、表達量的調控)、倫理性等問題，距臨床應用的要求仍有很大的差距。因此，如何建立一種簡便、經濟、安全而又有效的誘導方法，已成為干細胞軟骨定向分化及組織工程化軟骨構建的關鍵所在。
中國專利(申請號02155171.5)揭示將軟骨細胞與BMSCs按一定比例混勻，接種到生物支架材料后植入裸鼠皮下或進行體外培養后，BMSCs向軟骨定向分化并在體內外形成成熟的軟骨組織。然而，這種軟骨細胞/干細胞混合培養的誘導方法最大缺點在于，軟骨細胞必須直接參與干細胞的軟骨定向分化或組織工程化軟骨構建，這就同樣面臨著應用軟骨細胞作為種子細胞所面臨的自體軟骨細胞來源不足、同種異體或異種軟骨細胞的免疫原性、疾病傳播等相關問題。
因此本領域迫切需要解決這些問題，使組織工程化軟骨構建徹底擺脫軟骨細胞來源問題的限制，建立一種真正簡便、經濟、安全、有效而又容易大規模推廣應用的軟骨誘導方法。

發明內容
本發明旨在提供一種能誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑。
本發明的另一目的是提供將所述的誘導劑用于誘導干細胞向軟骨分化的方法。
在本發明的第一個方面，提供了一種軟骨分化誘導劑，它具有以下特征(a)可誘導干細胞(如骨髓基質干細胞或胚胎干細胞)分化形成軟骨細胞；(b)來自體外培養軟骨細胞或軟骨組織的培養液。
所述誘導劑是用以下的制備方法獲得的將體外培養軟骨細胞或軟骨組織所獲得的培養液進行分離(如過濾或離心)，去除軟骨細胞和軟骨組織，從而獲得不含細胞和細胞碎片的溶液。
在另一優選例中，所述誘導劑是用以下的制備方法獲得的將體外培養軟骨細胞或軟骨組織所獲得的培養液通過離心進行分離，去除軟骨細胞和軟骨組織，從而獲得不含細胞和細胞碎片的溶液。
在另一優選例中，所述的培養液是培養軟骨細胞或軟骨組織1天-200天期間所獲得的培養液。
在另一優選例中，培養軟骨細胞的時間為1天-100天，培養軟骨細胞構建的組織工程化軟骨的時間為3天-200天。
在另一優選例中，所述的培養液是在換液后24小時-150小時期間獲得的培養液。
在上述的誘導劑中，所述的軟骨組織包括軟骨細胞與藥學上可接受的生物可降解材料混合所形成的組織工程化軟骨移植物或組織工程化軟骨。
在另一優選例中，所述的組織工程化軟骨為軟骨細胞與藥學上可接受的生物可降解材料形成的固態細胞-材料復合物，且軟骨細胞在復合物中的濃度為1×106個細胞/cm3-1×108個細胞/cm3。
在上述的誘導劑中，所述的制備方法還包括步驟對獲得的不含細胞和細胞碎片的溶液進行濃縮和/或干燥，從而制成濃縮的或固態的誘導劑。
在另一優選例中，所述的方法還包括步驟從所述的不含細胞和細胞碎片的溶液中分離出蛋白質物質。
在另一優選例中，所述的誘導劑包括軟骨細胞和/或軟骨組織培養過程中分泌的可溶性物質(主要的有效成份)。
在上述的誘導劑中，所述的軟骨細胞是人或動物的軟骨細胞。
在另一優選例中，所述的軟骨細胞可來源于關節軟骨、肋軟骨、耳軟骨、氣管軟骨等各種軟骨組織。
在本發明的第二個方面，提供了一種上述誘導劑的用途，就是將它用作體外誘導干細胞定向分化為軟骨細胞的誘導劑。
在本發明的第三個方面，是提供了一種誘導干細胞向軟骨分化的方法，它包括步驟在適合培養的條件下，在培養液中培養干細胞或干細胞-生物可降解材料的復合物，所述的復合物包括干細胞和藥學上可接受的生物可降解材料，且干細胞在復合物中的濃度為1×105個細胞/克-1×108個細胞/克，培養時間為7天-180天，從而誘導干細胞分化為軟骨細胞。
其中，在所述培養液中含有本發明提供的軟骨分化誘導劑。
在另一優選例中，所述的誘導劑為液態或固態形式。
在另一優選例中，干細胞是人或動物的干細胞。
在另一優選例中，所述的干細胞包括各種間充質干細胞(如骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、肌肉干細胞、真皮多潛能干細胞等)和胚胎干細胞。更佳地，所述的干細胞包括間充質干細胞。
在另一優選例中，所述誘導劑的含量為0.1-1.0ml/ml培養液，其中誘導劑按未濃縮的軟骨培養液體積計算。
在另一優選例中，所述的可降解材料為藥學上可接受的、生物相容性良好的可降解材料，可選自下組聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對二氧六環酮、膠原、明膠、透明質酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細胞基質，及其組合。
在本發明的第四個方面，提供了一種用于誘導干細胞分化為軟骨細胞的培養基，所述培養基含有0.1-1.0ml/ml本發明提供的軟骨分化誘導劑(按未濃縮的軟骨培養液體積計算)。此外，所述的培養基還具有其他本領域常規的培養基組分，例如胎牛血清、L-谷氨酰胺、維生素C、青霉素、鏈霉素等。一種制備本發明培養基的方法包括步驟在各種市售的或用常規方法配制的培養基中加入0.1-1.0ml/ml本發明的軟骨分化誘導劑。
在本發明的第五個方面，提供了一種用于誘導干細胞分化成軟骨細胞的培養裝置，它包括以下組件一容器，所述容器內盛有培養干細胞和軟骨細胞的培養液；一隔離裝置，所述隔離裝置將所述容器分割成2個或多個隔離的培養單元，并且所述的隔離裝置不能透過細胞或細胞碎片但可以透過直徑小于0.4微米的大分子物質；
一適合培養干細胞和軟骨細胞的培養液，所述的培養液流動于各培養液單元；其中，在至少一個培養單元中含有不低于105個軟骨細胞或軟骨組織，并且在至少一個培養單元中含有不低于105個干細胞或干細胞與生物可降解材料復合物。
在另一優選例中，所述的隔離裝置是孔徑為0.4-2.0微米的過濾板。
在另一優選例中，所述的軟骨細胞和干細胞來自同一個體或同種異體或不同物種。
本發明提供的誘導劑能有效地在體外模擬軟骨誘導微環境，其制備過程對軟骨細胞的種屬來源和取材部位沒有特別限制，使本發明所需的軟骨細胞來源充足，容易獲取且不必擔心免疫原性等問題。使用本發明提供的誘導劑能有效地誘導干細胞團或干細胞-生物材料復合物向軟骨定向分化或形成組織工程化軟骨組織，該體外軟骨誘導方法操作簡便，誘導效果確切可靠，便于大規模推廣應用。


圖1顯示了體外培養8周時hBMSC-PGA復合物的大體標本；左為誘導組，右為對照組。
圖2顯示了體外培養8周時hBMSC-PGA復合物的HE染色結果；左為誘導組，右為對照組。
圖3顯示了體外培養8周時hBMSC-PGA復合物的Safranin-O染色結果；左為誘導組，右為對照組。
圖4顯示了體外培養8周時hBMSC-PGA復合物的甲苯胺藍染色結果；左為誘導組，右為對照組。
圖5顯示了體外培養8周時hBMSC-PGA復合物的II型膠原免疫組化染色結果；左為誘導組，右為對照組。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，發現軟骨細胞可以不直接參與干細胞的軟骨定向分化或組織工程化軟骨的形成，這樣軟骨細胞就不會影響干細胞構建組織工程化軟骨的免疫原性，其來源也沒有嚴格的限制；進一步地還發現體外培養軟骨細胞或軟骨組織的培養液，由于含有軟骨細胞分泌的可溶性物質，可作用于干細胞團或干細胞-材料復合物，誘導它們向軟骨定向分化并形成組織工程化軟骨。
具體地，將軟骨細胞或軟骨組織與干細胞或干細胞-材料復合物置于同一個培養裝置中，兩者之間通過一個過濾板隔離而不互相接觸，通過隔離共培養的方式將干細胞團或干細胞-材料復合物誘導為軟骨組織；或者應用除去了細胞和細胞碎片的軟骨細胞或軟骨組織的培養液作為誘導因素，或以這些培養液中提取的可溶性物質作為誘導因子，同樣成功地將干細胞團或干細胞-材料復合物誘導為軟骨組織。
據此本發明人建立了一種真正簡便、經濟、安全、有效而又容易大規模臨床推廣應用的軟骨誘導方案，擺脫了干細胞構建組織工程化軟骨過程中對軟骨細胞來源的限制，完成了本發明。
術語術語“軟骨細胞的分離培養”指將存在于人或動物軟骨組織中的軟骨細胞通過酶消化的方法選取出來并進行體外培養的過程。
術語“接種”指將細胞均勻分布于三維支架材料上的過程。
術語“構建”指體外分離培養種子細胞，并將細胞與生物材料混合，通過體外培養和/或體內植入，使細胞-材料復合物形成組織工程化組織的過程。
術語“組織工程化軟骨”指將軟骨細胞或具有軟骨分化潛能的干細胞接種于生物可降解材料，通過體外培養和/或體內植入，生物材料部分或全部降解后所形成的軟骨樣組織。
術語“干細胞”指具有自我更新能力及多向或定向分化潛能的細胞群體，它們主要存在于人或動物的特定組織或胚胎組織中，也可以通過建立細胞系而獲得。
術語“誘導”指提供特殊的生化環境，將具有多向或定向分化能力的干細胞等細胞群體轉變為另一種功能特性不同的細胞群體的過程。
軟骨細胞本發明中軟骨細胞的來源沒有特別限制，可以是人或動物的軟骨細胞，可來源于關節軟骨、肋軟骨、耳軟骨、氣管軟骨等各種軟骨組織。一種優選的來源是來自人或動物的關節軟骨。
分離獲得軟骨細胞的方法是文獻多次報道的公認方法。一種優選的方法是全麻或局麻下無菌切取軟骨組織，經磷酸緩沖液(PBS)清洗后，加入5-10倍軟骨體積的膠原酶溶液(濃度一般在0.5-3mg/ml，以PBS或培養液配制)，37℃恒溫振蕩消化4-20小時(依軟骨組織的來源及消化進展程度而定)，過濾收集軟骨細胞懸液，離心、洗滌、臺盼藍染色、顯微鏡下計數，原代軟骨細胞活力一般應在80％以上。
軟骨細胞的培養、傳代方法和培養液也是本領域中熟知的。一種優選的方法是將軟骨細胞在CO2培養箱內培養。合適的培養液包括(但并不限于)1)F-12培養基或DMEM培養基+5％-20％胎牛血清；2)F-12培養基或DMEM培養基+5％-20％自體(或異體)人血清；3)F-12/DMEM培養基(1∶1)+2％-20％胎牛血清或人血清。一類特別優選的軟骨細胞是體外分離培養的原代-第3代的軟骨細胞。此時的軟骨細胞功能和活力均良好，具有很強的軟骨形成能力，經免疫細胞化學染色證明有II型膠原表達，RT-PCR及原位雜交檢測證明有II型膠原及蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表達。
軟骨組織本發明所稱的軟骨組織包括軟骨細胞與藥學上可接受的生物可降解材料混合所形成的組織工程化軟骨移植物或組織工程化軟骨。
軟骨細胞構建組織工程化軟骨的方法是本領域中熟知的。一類優選的方法是將原代-第3代的軟骨細胞接種到可降解生物材料形成軟骨細胞-材料復合物，再進行體外培養，使細胞充分與材料接觸并分泌細胞外基質，同時材料被逐漸降解，最終形成軟骨組織。軟骨細胞-生物材料復合物的細胞接種濃度通常約為1×107/ml至7×107/ml或更高。生物材料的種類和來源沒有特別限制，一類優選的醫學上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原及其多聚物和混合物等。制備細胞-材料復合物時，以培養液調整細胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時培養液與固體性材料的比例也沒有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養液的最大量為準。當支架材料為特殊三維形狀時，如耳廓或鼻背形，按實際體積的大小來進行計算。
軟骨細胞構建組織工程化軟骨的體外培養方法沒有特別限制，一類優選的培養方法是置于培養瓶、培養皿、離心管或生物反應器中培養，培養過程中可以對組織工程化軟骨施加各種物理的或化學的刺激。軟骨細胞構建組織工程化軟骨的體外培養時間沒有特別的限制，優選的體外培養時間為3天-6個月，軟骨組織形成的時間為1周-8周。
可用于構建本發明組織工程化軟骨的材料是醫學上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質酸、聚對二氧六環酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細胞基質等；(c)上述材料的共聚物或復合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復合材料，以及固體材料與可注射性材料的復合材料。
優選的醫學上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。本發明中的材料可預制成各種精確的大小與形狀，以適應不同大小和形狀的軟骨組織構建。當材料為固體型材料時，可以直接將材料預制成需要的大小與形狀，也可以通過計算機輔助及快速成型技術定制的模型對材料進行精確的塑性。
1誘導劑-誘導干細胞向軟骨分化的物質本發明所稱的誘導劑來自體外培養軟骨細胞或軟骨組織的培養液，并且可誘導干細胞(如骨髓基質干細胞)分化形成軟骨細胞。
所述的誘導劑是軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質；或是培養軟骨細胞或軟骨組織時得到的培養液；或是從上述培養液中分離純化得到的，來自軟骨細胞和/或軟骨組織分泌的部分或全部可溶性物質。這些可溶性物質中有些成份是已知的(如胰島素樣生長因子、轉化生長因子等)，有些是未知的，但所有來自軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質(部分或全部)，只要可用于干細胞的軟骨定向誘導分化，均屬于本發明的權利要求范圍之內。
制備本發明所述的誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑，一種優選的方法是直接收集培養軟骨細胞或軟骨組織時的培養液；另一優選的方法是通過蛋白質濃縮純化的方法從上述培養液中提純出軟骨細胞和/或軟骨組織分泌的部分或全部可溶性物質。
軟骨細胞或軟骨組織的體外培養時間沒有特別限制，當培養物為軟骨細胞時，優選的體外培養時間為1天-90天，優選的收集培養液時間為換液后的24小時-120小時。當培養物為軟骨細胞構建的組織工程化軟骨時，優選的體外培養時間為3天-180天，優選的收集培養液時間為換液后的24小時-96小時。
誘導劑的制備方法將體外培養軟骨細胞或軟骨組織所獲得的培養液進行分離(如過濾或離心)，去除軟骨細胞和軟骨組織，從而獲得不含細胞和細胞碎片的溶液。
一種優選的方法是將體外培養軟骨細胞或軟骨組織所獲得的培養液通過離心進行分離，去除軟骨細胞和軟骨組織，從而獲得不含細胞和細胞碎片的濾液。
所述的培養液是培養軟骨細胞或軟骨組織1-200天期間所獲得的培養液；更優選地，培養軟骨細胞的時間為1天-90天，培養軟骨細胞構建的組織工程化軟骨的時間為3天-180天。
所述的培養液是在換液后24小時-150小時期間獲得的培養液；更優選地，當培養物為軟骨細胞時，收集培養液時間為換液后的24小時-120小時，當培養物為軟骨細胞構建的組織工程化軟骨時，收集培養液時間為換液后的24小時-96小時。
另一個優選的方法是對獲得的不含細胞和細胞碎片的溶液進行濃縮和/或干燥，從而制成濃縮的或固態的誘導劑；或是從所述的不含細胞和細胞碎片的溶液中提取純化出軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質。
干細胞干細胞的分離、培養、體外擴增方法是本領域中熟知的。干細胞的來源沒有特別限制，包括人或動物的各種間充質干細胞(如骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、肌肉干細胞、真皮多潛能干細胞等)和胚胎干細胞。一種優選的干細胞是人或動物的骨髓基質干細胞(bone marrow stem cells，BMSC)，可以通過骨髓密度梯度離心或全骨髓貼壁培養方法獲得。
生物可降解材料可用于本發明的組織工程化軟骨的材料是醫學上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質酸、聚對二氧六環酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細胞基質等；(c)上述材料的共聚物或復合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復合材料，以及固體材料與可注射性材料的復合材料。
優選的醫學上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。本發明中的材料可預制成各種精確的大小與形狀，以適應不同大小和形狀的軟骨組織構建。當材料為固體型材料時，可以直接將材料預制成需要的大小與形狀，也可以通過計算機輔助及快速成型技術定制的模型對材料進行精確的塑性。
干細胞-生物材料復合物干細胞-生物材料復合物的制備方法也是本領域中熟知的。一種優選的制備方法是將干細胞直接接種到可降解生物材料上。干細胞-生物材料復合物的細胞接種濃度通常約為1×107/ml至7×107/ml或更高。生物材料的種類和來源沒有特別限制，一類優選的醫學上可接受的生物可降解材料是固體材料或固體、液體復合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原及其多聚物和混合物等。制備細胞-材料復合物時，以培養液調整細胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時培養液與固體性材料的比例也沒有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養液的最大量為準。
干細胞軟骨定向誘導誘導干細胞或干細胞-生物材料復合物向軟骨定向分化的方法的主要步驟包括(1)將干細胞離心形成干細胞團或與藥學上可接受的生物可降解材料混合形成干細胞-材料復合物；(2)以軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質作為誘導因素，誘導干細胞團或干細胞-生物材料復合物向軟骨定向分化。
誘導因素的施加方式沒有特別限制，以軟骨細胞或軟骨組織作為誘導因素時，優選的施加誘導因素方式是通過隔離共培養的方式誘導干細胞團或干細胞-材料復合物向軟骨定向分化；以軟骨細胞或軟骨組織的培養液作為誘導因素時，優選的施加誘導因素方式是將這些培養液直接作為誘導干細胞團或干細胞-材料復合物向軟骨定向分化的培養液；以軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質部分或全部提取物作為誘導因素時，優選的施加誘導因素方式是將提取物加入到干細胞團或干細胞-材料復合物的培養液中誘導其向軟骨定向分化。
體外誘導的開始時間及持續時間也沒有特別限制，優選的開始誘導時間為干細胞團或干細胞-材料復合物構建完成即刻至28天，優選的體外誘導持續時間為7天-180天。
誘導培養裝置一種常規誘導培養裝置是在常用的培養裝置內(培養瓶、培養皿、離心管及生物反應器等)加入用于誘導干細胞分化為軟骨細胞的培養基，其中含有胎牛血清、L-谷氨酰胺，維生素C，青、鏈霉素等常規的培養成分(劑量和濃度可參考具體實施例和相關文獻報道)和0.1-1.0ml/ml軟骨細胞或軟骨組織的培養液；或在上述常規培養成份的基礎上加入一定量的軟骨細胞或軟骨組織培養液的濃縮液或其可溶性物質提取物。
另一種優選的培養裝置是使其在原位直接產生誘導物質，即通過隔離共培養的方式誘導干細胞團或干細胞-材料復合物向軟骨分化；所述的隔離共培養是指將軟骨細胞或軟骨組織與干細胞團或干細胞-材料復合物置于同一培養孔內培養，兩者之間通過一個隔離裝置隔離使其互不接觸而培養液可以相互流動，軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質可以通過擴散的方式發揮誘導作用。所述的裝置包括容器，所述容器內盛有培養干細胞和軟骨細胞的培養液；隔離裝置，所述隔離裝置將所述容器分割成2個或多個隔離的培養單元，并且所述的隔離裝置不能透過細胞或細胞碎片但可以透過直徑小于0.4微米的大分子物質；和適合培養干細胞和軟骨細胞的培養液，所述的培養液流動于各培養液單元。
本發明的主要優點在于(1)本發明提供的誘導方法能有效地誘導干細胞團或干細胞-生物材料復合物向軟骨定向分化或形成組織工程化軟骨組織，這些誘導產物可以用于各種軟骨組織工程相關的實驗研究，也可以用于修復病人的各種軟骨缺損或軟骨損傷。
(2)以軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質作為誘導因素，有效地在體外模擬了軟骨誘導微環境，并避免了以往報道的誘導方法的諸多不足，如應用生長因子誘導時因子用量大、種類多、價格昂貴且誘導效果不穩定及通過轉基因技術誘導時的安全性等。
(3)本發明的誘導劑制備過程中雖然應用了軟骨細胞，但軟骨細胞不直接參與干細胞的軟骨分化與軟骨形成，對軟骨細胞的種屬來源和取材部位沒有特別限制，因此，發明中所需的軟骨細胞來源充足，容易獲取且不必擔心免疫原性等問題。
(4)軟骨定向誘導劑制備方法簡單易學，成本低廉，便于大規模推廣應用，還可以開發出產業化的產品。
(5)體外軟骨誘導方法操作簡便，誘導效果確切可靠，便于大規模推廣應用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照文獻報道的常規條件，例如實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
實施例1制備誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑I一、分離、培養軟骨細胞實驗動物幼豬5頭，體重約10kg，雌雄不限。
實驗方法1.動物以氯氨酮10～20mg/kg、阿托品0.5～1mg肌注麻醉誘導及抑制腺體分泌，耳緣靜脈緩慢靜推水合氯醛(10％)1ml/kg或戊巴比妥鈉(2.5％)1ml/kg麻醉；2.常規消毒鋪巾，無菌切取膝關節軟骨組織，剪成2mm×3mm大小碎片，磷酸鹽緩沖液沖洗兩遍；3.按改良的Klagsbrun法，加入5倍體積的1mg/mlII型膠原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒溫搖床內消化8-12小時，過濾，離心；4.沉淀細胞用PBS洗滌2次，以含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C 50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml的DMEM培養液制成細胞懸液，計數，臺盼藍染色檢查軟骨細胞活力，一般活力＞85％；5.根據計數結果以2.5×104個細胞/cm2密度接種于培養皿；6.在37℃，5％CO2及飽和濕度的培養箱中連續培養48小時后更換培養液，以后隔日換液；7.當軟骨細胞生長達到80％以上的融合狀態時，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA(PBS配制)消化，收集細胞，計數，按2.5×104個細胞/cm2密度接種于培養皿，進行傳代培養，隔日換液；8.當細胞生長再次達到80％以上的融合狀態時，按上述相同的方法進行傳代培養，直到傳代培養至第3-4代。
二、收集培養過軟骨細胞的培養液收集體外培養軟骨細胞過程中得到的培養液，制得誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑I，-80℃冷凍保存備用。
實施例2制備誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑II
一、軟骨細胞-材料復合物構建(1)聚羥基乙酸(PGA)三維支架制備無紡PGA纖維購自Albany公司(Albany，NY，USA)，真空保存。纖維直徑13-15μm，將PGA纖維精確稱量為20mg/塊，用特制的模具分別壓制成直徑13mm、厚2mm的圓柱體小塊，待形狀固定后，將材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分鐘。PBS沖洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培養基浸泡10分鐘，吸干后準備接種細胞。
(2)軟骨細胞-材料復合物構建1.單層培養的第一代軟骨細胞達到90％匯合時，應用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，收集細胞，計數；2.2000rpm離心8min使細胞沉淀，棄去上清液，振蕩分散細胞；3.按5×107個細胞/cm3的密度將軟骨細胞懸液均勻地接種到支架材料上，每塊支架材料接種細胞總量約1.5×107個；4.接種完成后，將細胞-材料復合物置于37℃、5％CO2、飽和濕度的環境中靜態培養4-5小時，待細胞與PGA纖維充分粘附后，補足培養液；5.培養24小時后首次更換培養液，以后每隔36-48小時更換培養液，體外持續培養3個月。
二、收集培養過軟骨細胞-材料復合物的培養液收集體外培養軟骨細胞-材料復合物過程中得到的培養液，制得誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑II，-80℃冷凍保存備用。
實施例3制備誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑III濃縮純化實施例1和2所獲得的誘導劑I和II，制得誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑III。主要的濃縮純化方法和步驟包括(1)冷凍干燥法濃縮誘導劑I和II將實施例1和2所獲得的誘導劑I和II轉移到玻璃培養皿內，置于冷凍干燥機內真空冷凍干燥24小時-48小時，初步濃縮誘導劑I和II。
(2)鹽析法濃縮沉淀蛋白質在上述冷凍干燥法得到的初步濃縮液中加入足量(一般要加入原濃縮液體積2倍以上)的飽和硫酸銨溶液并充分攪拌，直至絮狀的沉淀物不再增加，將混合液體轉移至離心管，在3500轉/分、4℃條件下離心5分鐘，吸棄上層澄清液體，下層絮狀沉淀物保留繼續進行下一步的純化與濃縮。
(3)透析法除鹽純化蛋白質將鹽析法得到的絮狀沉淀物轉移至透析袋內，置于3000毫升去離子水中在4℃恒溫室內透析24小時-48小時，透析期間每隔4小時更換一次去離子水，除去沉淀物中的大部分鹽離子及小分子物質。
(4)冷凍干燥制得誘導劑III將透析后得到的產物再次進行冷凍干燥，根據需要可以制備成高蛋白濃度的濃縮液或凍干粉，即為誘導干細胞向軟骨分化的誘導劑III，-80℃冷凍保存備用。
實施例4人骨髓基質干細胞(hBMSCs)的分離、培養與hBMSC-材料復合物構建骨髓來源骨髓取自捐獻者的髂骨，供體年齡5-20歲，無惡性腫瘤、傳染性疾病及血液系統疾病。
(1)hBMSCs的獲取與培養取材部位局麻，常規消毒鋪巾，16號穿刺針于髂前上脊穿刺，抽取骨髓5～8ml，置于肝素化的離心管中。
將抽取的骨髓先后用5ml和1ml一次注射器反復抽吸數次，轉移至另一離心管內，加入少量的無血清DMEM培養液，混勻，3000rpm離心10分鐘，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，注意不要攪動下方的沉淀物，重新振蕩混勻，在另一15ml離心管內加入新鮮配制的Percoll分離液(Pharmacia公司)，分離液表面輕輕加入上述的骨髓細胞懸液(體積為分離液的一半)，900g離心30分鐘，此時離心管內液體分為四層第一層主要是血清和少量的培養液，第二層為有核細胞層，第三層為Percoll分離液，第四層主要是沉淀下來的紅細胞。輕輕吸取第二層的有核細胞轉移至另一離心管內，加入適量的無血清DMEM培養液洗滌離心二次，沉淀細胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)培養液制成細胞懸液。取少量細胞懸液用4％乙酸等體積稀釋破壞殘存的紅細胞，常規計數有核細胞。根據計數結果，按2.5×105/cm2的細胞密度接種于培養皿。
將接種好的培養皿置于37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2培養箱內，培養48小時后首次換液，此時在低倍鏡下可清楚地見到多個克隆形成。吸除舊培養液，PBS洗滌2-3次，加入新鮮培養液，繼續在相同的條件下培養，隔日更換三分之二量的培養液，一般7-9天后可達到融合狀態，可繼續傳代培養。傳代時吸除培養液，以少量PBS洗滌一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，鏡下見大部分細胞胞質回縮、形態變圓后，輕輕吸除消化液，加入適量的含血清的DMEM條件培養液中止消化，收集細胞懸液、計數，以1.5×104/cm2細胞密度接種于新的培養皿內，繼續在相同的條件下培養。隔日更換三分之二量的培養液，一般4-5天后又可達到融合狀態，可繼續傳代培養或直接用于實驗。本實例中應用的是體外培養第2-3代的細胞。
(2)PGA三維支架的制作將無紡PGA纖維(來源同前)精確稱量為5mg/塊，用特制的模具分別壓制成直徑5mm、厚1.5mm的圓柱體小塊，待形狀固定后，將材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分鐘。PBS沖洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培養基浸泡10分鐘，吸干后準備接種細胞。
(3)hBMSC-材料復合物構建單層培養第2～3代的hBMSCs達到90％匯合時，以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化收集細胞，計數。1500rpm離心5min使細胞沉淀，棄去上清液，振蕩分散細胞，按5×107個細胞/cm3的密度將hBMSCs懸液均勻接種到材料支架上。每塊支架材料接種細胞總量約2×106-3×106個細胞。接種完成后，將細胞-材料復合物置于37℃、5％CO2、飽和濕度的環境中靜態培養4-5小時，待細胞與PGA纖維充分粘附后，補足培養液。培養24小時后首次更換培養液，以后每36-48小時換液一次。
實施例5hBMSC-材料復合物的誘導培養(1)隔離共培養將接種72小時后的實施例4所得的hBMSC-PGA復合物與實施例2中所得的軟骨細胞-PGA復合物置于同一培養孔內共培養，但兩者之間通過一個孔徑0.4um的Transwell insert(購自Falcon公司)隔離使其互不接觸，軟骨細胞-PGA復合物分泌的可溶性物質可以通過擴散的方式作用于hBMSC-PGA復合物。其中含有1到3個軟骨細胞-PGA復合物，含有1到3個hBMSC-PGA復合物。為保證營養和軟骨細胞-PGA復合物分泌的可溶性物質濃度，共培養體系每隔36-48小時半量換液。
(2)以實施例1所得的誘導劑I作為誘導因素先收集體外培養2天-20天的軟骨細胞培養液，即誘導劑I，離心去除細胞及細胞碎片等雜質成份，然后作為條件誘導液，直接用于hBMSC-PGA復合物的誘導培養，誘導劑I在誘導培養液中的含量為0.7-0.9ml/ml。為保證培養液的營養條件，可以添加10％的胎牛血清，并每24-36小時全量換液。所有構建的復合物在體外培養或誘導培養4-12周后取材，分別從大體外觀、重量、體積、蛋白多糖含量、組織學及免疫組織化學等方面對誘導后的hBMSC-PGA復合物進行軟骨特異性相關的評價。
(3)以實施例2所得的誘導劑II作為誘導因素先收集體外培養3天-28天的軟骨細胞-PGA復合物的培養液，即誘導劑II，離心去除細胞及細胞碎片等雜質成份，然后作為條件誘導液，直接用于hBMSC-PGA復合物的誘導培養，誘導劑II在誘導培養液中的含量為0.6-0.8ml/ml。為保證培養液的營養條件，可以添加10％的胎牛血清，并每24-36小時全量換液。所有構建的復合物在體外培養或誘導培養4-12周后取材，分別從大體外觀、重量、體積、蛋白多糖含量、組織學及免疫組織化學等方面對誘導后的hBMSC-PGA復合物進行軟骨特異性相關的評價。
(4)以實施例3所得的誘導劑III作為誘導因素將實施例3所得的誘導劑III(蛋白濃縮液或凍干粉)直接添加到hBMSC-PGA復合物的培養液中，使誘導劑III可以直接作用于hBMSC-PGA復合物。誘導劑III的加入量可根據其總蛋白含量進行計算，本實例誘導培養液中誘導劑III的含量為2-4毫克/ml。所有構建的復合物在體外培養或誘導培養4-12周后取材，分別從大體外觀、重量、體積、蛋白多糖含量、組織學及免疫組織化學等方面對誘導后的hBMSC-PGA復合物進行軟骨特異性相關的評價。
為充分證實軟骨細胞或軟骨細胞-PGA復合物分泌可溶性因子的軟骨定向誘導作用，本實例中還特別設立了幾個對照組進行證明。主要包括(1)單純應用含10％胎牛血清的DMEM培養液培養hBMSC-PGA復合物對照組；(2)以hBMSCs替代上述誘導方法中的軟骨細胞，應用hBMSCs自身分泌的可溶性因子作為誘導因素的對照組。(3)以人皮膚成纖維細胞替代軟骨細胞，應用人皮膚成纖維細胞分泌的可溶性因子作為誘導因素的對照組。
結果根據本實例的研究結果，這些對照組中的hBMSC-PGA復合物均未形成明顯的軟骨組織，也未檢測到軟骨特異性細胞外基質的表達。
以下代表性地列舉了實施例5(1)所示的以軟骨細胞-PGA復合物分泌的可溶性因子作為誘導因素，在體外誘導培養8周時的誘導結果(誘導組)以及與其相對應的以人皮膚成纖維細胞-PGA復合物分泌的可溶性因子作為對照誘導因素(對照組)的培養結果。
(a)體外培養8周時hBMSC-PG A復合物大體觀察體外培養8周時，見圖1。
結果顯示誘導組hBMSC-PGA復合物能夠保持原有的大小和形狀，呈半透明的乳白色，外觀類似軟骨組織，質地柔韌并有一定彈性；對照組hBMSC-PGA復合物體積明顯縮小，呈不透明的暗黃色，質地柔軟無彈性。
(b)體外培養8周時hBMSC-PGA復合物組織學及免疫組化檢查HE染色體外培養8周時，見圖2。
結果顯示誘導組復合物可見大量典型的軟骨陷窩樣結構，細胞外基質著色深，PGA纖維已大部分降解，均質的軟骨樣組織已基本形成；對照組復合物主要為纖維性組織，未見典型的軟骨陷窩樣結構。
Safranin-O染色體外培養8周時，見圖3。
結果顯示誘導組復合物Safranin-O染色呈陽性，可見大量染成紅色的細胞外基質分布于軟骨陷窩周圍，表明誘導組有大量的軟骨特異性基質沉積；
對照組復合物未見明顯的紅染基質，表明無明顯的軟骨基質沉積。
甲苯胺藍染色體外培養8周時，見圖4。
結果顯示誘導組復合物甲苯胺藍染色呈陽性，可見大量染成藍色的細胞外基質分布于軟骨陷窩周圍，表明誘導組有大量的軟骨特異性蛋白多糖沉積；對照組復合物未見明顯的藍染基質，表明無明顯的蛋白多糖沉積。
II型膠原免疫組化體外培養8周時，見圖5。
結果顯示誘導組復合物II型膠原免疫組化呈陽性，可見大量染成棕黃色的細胞外基質分布于軟骨陷窩周圍，表明誘導組有大量的軟骨特異性II型膠原沉積；對照組復合物未見明顯的棕黃基質，表明無明顯的II型膠原沉積。
結果表明，以軟骨細胞構建的組織工程化軟骨分泌的可溶性因子作為誘導因素，能夠有效地誘導hBMSC-PGA復合物向軟骨定向分化并最終形成成熟的軟骨樣組織。從附圖中還可以看出，應用本發明所提供的物質和方法誘導hBMSC-PGA復合物形成的組織工程化軟骨具有接近正常軟骨的外觀和組織學特征，并能分泌大量的軟骨特異性細胞外基質和特征性蛋白，誘導效果好。而在應用hBMSCs或人皮膚成纖維細胞替代軟骨細胞作用的相應對照組中，干細胞-材料復合物均明顯縮小，且未形成軟骨特征性的組織學結構，也未檢測到軟骨特異性的細胞外基質表達。這表明本發明提供的誘導方法所具有的軟骨定向誘導作用，是軟骨細胞或軟骨組織所特有的性質。當然，這些實施例和實驗例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例6-8hBMSC-材料復合物的誘導培養實施例5(2)-5(4)所示的以實施例1-3所制得的誘導劑I-III作為誘導因素，誘導hBMSC-材料復合物軟骨定向分化的誘導結果(誘導組)以及與其相對應的以人皮膚成纖維細胞-PGA復合物作為對照誘導因素(對照組)的培養結果，與實施例5(1)的結果相似，表明以培養軟骨細胞、軟骨細胞構建的組織工程化軟骨的培養液，以及由該培養液濃縮提純的可溶性物質作為誘導因素，同樣能夠有效地誘導hBMSC-PGA復合物向軟骨定向分化并最終形成成熟的軟骨樣組織。
討論發明人在嚴謹的實驗工作中發現，關節微環境能夠誘導干細胞向軟骨定向分化并在關節軟骨缺損表面形成軟骨組織。根據這一科學現象，本發明人提出假設軟骨細胞能夠提供一種軟骨微環境誘導干細胞向軟骨定向分化。為證實這一設想，我們將軟骨細胞與BMSCs按一定比例混勻，并以此混合細胞作為種子細胞，接種到可降解生物支架材料后植入裸鼠皮下或進行體外培養，使軟骨細胞與BMSCs充分接觸并為其提供軟骨微環境。研究結果發現只需少量的軟骨細胞就能誘導多量的BMSCs向軟骨定向分化并在體內外形成成熟的軟骨組織，表明軟骨細胞能作為一個良好的綜合誘導因素，為BMSCs向軟骨定向分化提供誘導因子或誘導微環境。
本發明所提供的干細胞軟骨定向誘導物質和方法，經過系統的研究和論證，充分證實了其有效性和實用性。例如，我們以軟骨細胞或軟骨細胞構建的組織工程化軟骨作為誘導因素，通過隔離共培養的方式(軟骨細胞不再與干細胞相互接觸，不直接參與干細胞的軟骨定向分化及組織工程化軟骨形成)，成功地將干細胞團或干細胞-材料復合物誘導為軟骨組織。在進一步的研究中，我們應用軟骨細胞或軟骨細胞構建組織工程化軟骨的培養液作為誘導因素，或以這些培養液中提取的蛋白成份作為誘導因素，同樣成功地將干細胞團或干細胞-材料復合物誘導為軟骨組織。
本發明所提供的干細胞軟骨定向誘導的物質和方法，誘導效果穩定而特異，這為干細胞作為種子細胞構建組織工程化軟骨并應用于臨床軟骨缺損的修復提供了堅實的研究基礎和技術條件，其所涉及的方法、試劑及誘導產物有希望成為產業化生產的關鍵技術或進一步開發成為組織工程化軟骨產品。
本發明為應用干細胞構建組織工程化軟骨提供了一個確實可行的技術體系，并提供了其中關鍵的誘導物質及其制備方法。本發明提供的誘導方法能有效地誘導干細胞團或干細胞-生物材料復合物向軟骨定向分化或形成組織工程化軟骨組織，這些誘導產物可以用于各種軟骨組織工程相關的實驗研究，也可以用于修復病人的各種軟骨缺損或軟骨損傷，具有廣闊的應用前景和實用價值。而且，以軟骨細胞或軟骨組織分泌的可溶性物質作為誘導因素，有效地在體外模擬了軟骨誘導微環境，并避免了以往報道的誘導方法的諸多不足，如應用生長因子誘導時因子用量大、種類多、價格昂貴且誘導效果不穩定；通過轉基因技術誘導時的安全性等。
更重要的是，在這一技術體系中，軟骨細胞不直接參與干細胞的軟骨定向分化及組織工程化軟骨形成，而是通過軟骨細胞或軟骨細胞構建的組織工程化軟骨分泌的可溶性物質作用于干細胞團或干細胞-材料復合物，誘導它們向軟骨定向分化并形成組織工程化軟骨，對軟骨細胞的種屬來源和取材部位沒有特別限制。也就是說，本發明所提供的誘導方法中，軟骨細胞不會影響干細胞構建組織工程化軟骨的免疫原性，其來源可以是自體、同種異體甚至其它種屬，因此，本發明所提供的誘導方法既簡便、經濟而又安全、有效，因為動物來源的軟骨細胞很容易得到，只要大量收集這些軟骨細胞或軟骨組織的培養液，從中提純出由軟骨細胞或組織工程化軟骨所分泌的可溶性物質，即可大規模地應用于干細胞的軟骨定向分化或組織工程化軟骨構建。
此外，本發明所提供的干細胞軟骨定向誘導方法操作簡單易學，所提供的試劑制備方法簡單，成本低廉，誘導效果確切可靠，便于大規模推廣應用。而且本發明所提供的誘導方法和試劑也為應用干細胞構建組織工程化軟骨并應用于臨床軟骨缺損修復提供了堅實的研究基礎和技術平臺，其所涉及的方法、試劑及誘導產物很有希望發展成為產業化生產的關鍵技術或進一步開發成為組織工程化軟骨相關產品。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種軟骨分化誘導劑，其特征在于，它具有以下特征(a)可誘導干細胞分化形成軟骨細胞；(b)來自體外培養軟骨細胞或軟骨組織的培養液。
2.如權利要求1所述的誘導劑，其特征在于，所述誘導劑是用以下的制備方法獲得的將體外培養軟骨細胞或軟骨組織所獲得的培養液進行分離，去除軟骨細胞和軟骨組織，從而獲得不含細胞和細胞碎片的溶液。
3.如權利要求2所述的誘導劑，其特征在于，所述的軟骨組織包括軟骨細胞與藥學上可接受的生物可降解材料混合所形成的組織工程化軟骨移植物或組織工程化軟骨。
4.如權利要求2所述的誘導劑，其特征在于，所述的制備方法還包括步驟對獲得的不含細胞和細胞碎片的溶液進行濃縮和/或干燥，從而制成濃縮的或固態的誘導劑。
5.如權利要求1所述的誘導劑，其特征在于，所述的誘導劑包括軟骨細胞和/或軟骨組織培養過程中分泌的可溶性物質。
6.如權利要求1所述的誘導劑，其特征在于，所述的軟骨細胞是人或動物的軟骨細胞。
7.一種如權利要求1所述的誘導劑的用途，其特征在于，用作體外誘導干細胞定向分化為軟骨細胞的誘導劑。
8.一種誘導干細胞向軟骨分化的方法，其特征在于，包括步驟在適合培養的條件下，在培養液中培養干細胞或干細胞-生物可降解材料的復合物，所述的復合物包括干細胞和藥學上可接受的生物可降解材料，且干細胞在復合物中的濃度為1×105個細胞/克-1×108個細胞/克，培養時間為7天-180天，從而誘導干細胞分化為軟骨細胞。其中，在所述培養液中含有權利要求1所述的誘導劑。
9.一種用于誘導干細胞分化為軟骨細胞的培養基，其特征在于，它含有0.1-1.0ml/ml權利要求1所述的誘導劑，按未濃縮的軟骨培養液體積計算。
10.一種用于誘導干細胞分化成軟骨細胞的培養裝置，其特征在于，它包括以下組件一容器，所述容器內盛有培養干細胞和軟骨細胞的培養液；一隔離裝置，所述隔離裝置將所述容器分割成2個或多個隔離的培養單元，并且所述的隔離裝置不能透過細胞或細胞碎片但可以透過直徑小于0.4微米的大分子物質；一適合培養干細胞和軟骨細胞的培養液，所述的培養液流動于各培養液單元；其中，在至少一個培養單元中含有不低于105個軟骨細胞或軟骨組織，并且在至少一個培養單元中含有不低于105個干細胞或干細胞與生物可降解材料復合物。
全文摘要
本發明公開了一種誘導干細胞向軟骨分化的物質和方法，它可以有效地將干細胞誘導為軟骨表型的細胞或誘導干細胞－可降解材料復合物形成組織工程化軟骨。本發明使組織工程化軟骨構建擺脫了軟骨細胞來源問題的限制，并且建立了一種真正簡便、經濟、安全、有效而又容易大規模推廣應用的軟骨誘導方法。
文檔編號C12N5/08GK101029303SQ20061002420
公開日2007年9月5日 申請日期2006年2月28日 優先權日2006年2月28日
發明者周廣東, 曹誼林, 劉霞, 劉偉, 崔磊 申請人:上海國睿生命科技有限公司