專利名稱：誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法
技術領域：
本發明屬于干細胞技術領域，具體涉及一種誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法。
背景技術：
目前修復軟骨組織的傳統方法是采用自體軟骨細胞，此法必須在關節鏡下切取非負重區的關節軟骨，對其中的軟骨細胞進行擴增，這種手術唯一的優點為無抗原性，但造成機體損傷很大。另外軟骨組織中絕大部分為基質，軟骨細胞數量少且難分離，體外傳代次數有限，一般最多培養3 4代，所以難以獲得大量細胞。當前，骨髓間充質干細胞誘導成軟骨細胞普遍采取高密度聚團誘導。該方法一般將擴增后的細胞離心成細胞團，再用成軟骨細胞誘導培養基進行微團誘導。但是成軟骨細胞誘導需要大量的骨髓間充質干細胞，為了獲得大量的骨髓間充質干細胞，必須在體外進行長時間的傳代培養，而隨著細胞培養時間的延長，干細胞的多向分化潛能會出現程序性丟失，消化過程中使用的胰酶也會導致細胞活性的降低。間充質干細胞(MSCs)是成體干細胞的一種，它具有多向分化潛能，為類風濕性關節炎，骨關節炎及先天性軟骨發育不良等疾病的細胞治療開辟了一條新的途徑。并且最新研究表明，MSCs可以作用于抑制患者自身的炎癥反應，以及緩解一些退行性疾病的癥狀。目前采用MSCs分化成軟骨細胞的方法一般是將MSCs培養至傳代的MSCs后，再在含有定向誘導為軟骨細胞的因 子的培養基中進行誘導培養，將MSCs誘導成軟骨細胞。但是由于MSCs的定向誘導分化受很多不同信號通路的影響，而且誘導培養MSCs的細胞微環境變化對于MSCs誘導分化及其分子結構有著非常重要的影響。因此。導致現有的MSCs分化成軟骨細胞的方法所需周期都較長，通常需要2-4周，并且誘導后II型膠原的表達效率較低。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種誘導時間短、誘導后II型膠原的表達效率高的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法。為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下:一種誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，包括如下步驟:獲取間充質干細胞和軟骨細胞；將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養；將所述間充質干細胞接種于插入式細胞培養皿中，再將接種有所述間充質干細胞的所述插入式細胞培養皿置于所述軟骨細胞培養液中，并將所述軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基后進行共同培養；其中，所述軟骨細胞誘導分化培養基中含有2X10—7 5X10_7mOl/L的甲狀旁腺激素相關蛋白1-34。上述誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法采用插入式培養皿共同培養軟骨細胞和間充質干細胞，使兩種細胞可以模擬體內環境而發生協同作用，利用誘導MSCs分化成軟骨細胞因子與軟骨細胞分泌的細胞外基質作誘導因子的協同作用，從而顯著的縮短了誘導MSCs分化成軟骨細胞的時間，提高了軟骨細胞增殖率，并且同時提高了誘導分化后細胞的II型膠原的表達率與表達量，誘導分化后細胞的糖胺聚糖(GAG)的分泌也得到了明顯提高。另外，MSCs與軟骨細胞通過插入式培養皿而分隔開生長，有效的避免兩細胞間的交叉污染,保證兩細胞的純度,從而利用MSCs的誘導和軟骨細胞的增值。


圖1是本發明實施例誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法工藝流程示意圖；圖2是本發明實施例1的步驟Sll中分離培養的MSCs的流式檢測結果分析圖；其中，圖2A為傳代培MSCs的CD29、CD34、CD44和CD45表達率柱狀圖，圖2B為MSCs的CD29表達率圖，圖2C為MSCs的CD34表達率圖，圖2D為MSCs的CD44表達率圖，圖2E為MSCs的⑶45表達率圖；圖3是本發明實施例1與對比實例I中MSCs誘導分化為軟骨細胞中的陽性表達II型膠原細胞的流式檢測圖；其中，圖3A為實施例1與對比實例I分別誘導第5和第8天時，MSCs誘導分化為軟骨細胞中陽性表達II型膠原的細胞所占比率的柱狀圖；圖38為實施例I中的MSCs誘導5天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；圖3C為對比實例I中的MSCs誘導5天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；圖3D為實施例1中的MSCs誘導8天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；圖3E為對比實例I中的MSCs誘導8天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；圖4是本發明實施例1、對比實例I中的MSCs分別誘導5天和8天后以及對比實例2中的MSCs中的陽性表達II型膠原的細胞的熒光表達測定結果
圖5是本發明實施例1、對比實例I中的MSCs分別誘導5天和8天后以及對比實例2中的MSCs不誘導進行培養5天和8天后定量統計陽性表達II型膠原細胞的熒光強度與DAPI的熒光強度的比值柱狀圖；其中，圖5A為實施例1、對比實例I和對比實例2在第5天時陽性表達II型膠原細胞的熒光強度與DAPI的熒光強度的比值柱狀圖，圖5B為實施例1、對比實例I和對比實例2在第8天時陽性表達II型膠原細胞的熒光強度與DAPI的熒光強度的比值柱狀圖；圖6是本發明實施例1、對比實例I中的MSCs誘導分化為軟骨細胞增殖率圖；圖7是本發明實施例1、對比實例I中的MSCs分別誘導5天和8天后以及對比實例2中的MSCs不誘導進行培養5天和8天后軟骨細胞分泌統的GAG含量柱狀圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明實施例提供了一種誘導時間短、誘導后II型膠原的表達效率高的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法。該誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法的工藝流程如圖1所示，包括如下步驟:
步驟SO1.獲取間充質干細胞和軟骨細胞；步驟S02.接種并培養軟骨細胞:將步驟SOl中獲取的軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養；步驟S03.采用插入式細胞培養皿將間充質干細胞與軟骨細胞進行共同誘導培養:將步驟SOl中獲取的間充質干細胞接種于插入式細胞培養皿中，再將接種有所述間充質干細胞的所述插入式細胞培養皿置于所述軟骨細胞培養液中，并將所述軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基后進行共同培養。具體地，上述步驟SOl中的間充質干細胞(MSCs)和軟骨細胞可以是原代培養細胞或/和傳代培養細胞。在優選實施例中，該MSCs和軟骨細胞均選用傳代培養細胞。選用傳代培養細胞只需一次原代培養，而在傳代的過程中能產生大量所需要的軟骨細胞和MSCs，從而能有效避免后續步驟S03繁瑣操作，縮短后續步驟S03中兩細胞共同培養的時間，同時還能有效避免進行原代培養時對原代培養細胞來源的限制。該MSCs和軟骨細胞可以按照現有方法獲取也可以按照 如下經優化后的方法獲取。其中，該MSCs優選按如下方法獲取:原代培養MSCs的獲取:從手術臺取足月正常產健康產婦已離體的臍帶組織，PBS平衡液充分洗滌殘留的血液，去除臍靜脈及動脈及臍帶外膜，剝離Wharton膠，并將其剪碎成小組織塊，反復用DMEM高糖培養液洗去血細胞，將組織塊鋪在培養皿中，組織塊間隔開，放入37°C、5%C02培養箱中貼壁后，在培養皿中加入含5 15v/v%的胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養液，放入37°C、5%C02的培養箱內進行培養，時間為10 15天，待細胞爬出組織，從而獲得原代培養MSCs。傳代培養MSCs的獲取:將上述細胞爬出組織并長滿單層后原代培養MSCs進行傳代培養，獲得該傳代培養MSCs。其中，該傳代培養按照現有方法進行即可。如培養的溫度37°C、5%C02的培養箱內進行培養，時間為4 5天。待MSCs經原代培養或傳代培養后，可以將MSCs采用流式細胞儀檢測細胞表型。以進一步驗證和鑒定該分離得到的細胞為MSCs。當然，上述MSCs的來源除了正常產健康產婦臍帶組織之外，還可以來源于骨髓，脂肪，皮膚等組織。上述步驟SOl中的軟骨細胞優選按如下方法獲取:原代培養軟骨細胞的獲取:(I)無菌條件下取離體的非承重組織軟骨細胞，置于DPBS中漂洗，將軟骨剪碎后繼續用DPBS液漂洗；其中，非承重組織可以來源于離體的耳廓，會厭及呼吸道等處。非承重組織獲取按本領域常規方法進行獲取即可；(2)吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置于37°C、5%C02的培養箱內消化；(3)吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%11型膠原酶溶液，置于37°C、5%C02的培養箱內繼續消化，每Ih更換一次酶溶液；(4)過篩網，去除未被消化的組織塊；(5)用離心管留取各次消化液離心，去除上清液；(6)用PBS液洗，再次離心，獲取原代培養軟骨細胞。傳代培養軟骨細胞的獲取:
將上述獲取的原代培養軟骨細胞用含5% 15%FBS的DMEM/F12培養液制成細胞懸液，調細胞懸液濃渡為(5 8) X IO4個/ml ;將細胞懸液接種于培養瓶中，置于37°C、5%C02的培養箱內培養，獲得培養至傳代的軟骨細胞。上述步驟S02中，軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養的時間優選為0 2天，如I天、2天等。將軟骨細胞先進行培養是為了使得軟骨細胞數量的增值，從而縮短下述步驟S03中共同培養的時間以及提高MSCs誘導成軟骨細胞的效率。當然，軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養的時間為0天，也即是可以不對軟骨細胞進行預先培養，而是將軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中后，直接與接種在插入式細胞培養皿中的間充質干細胞進行同時培養。在優選實施例中，該軟骨細胞的接種量為0.5X IO4 IX IO4個/cm2。和/或在另一優選實施例中，用于培養該軟骨細胞的軟骨細胞培養液為含5% 15v/v%FBS的DMEM/F12培養液，也即是該軟骨細胞的軟骨細胞培養液以DMEM/F12培養基為基礎，添加有占軟骨細胞培養液體積百分比為5% 15%的胎牛血清。在一具體實施例中，該軟骨細胞的培養可以在細胞培養多孔板中進行，如將軟骨細胞培養液加入細胞培養多孔板中，然后將軟骨細胞接種至該軟骨細胞培養液中，并在37°C、5%C02的條件下進行培養2天。其中，細胞培養多孔板可以根據實際需要靈活選用，如24孔細胞培養板。當然也可以根據實際需要而選用6孔細胞培養板、12孔細胞培養板或96孔細胞培養板等。上述步驟S03中，將接種在插入式培養皿中的MSCs與經上述步驟S02中培養后的軟骨細胞在軟骨細胞誘導分化培養基中共同培養過程中，MSCs與軟骨細胞通過插入式培養皿而分隔開生長，且兩者通過插入式培養皿的微孔膜結構共用軟骨細胞誘導分化培養基，并使得軟骨細胞誘導分化培養基中含有的誘導MSCs分化成軟骨細胞因子與軟骨細胞分泌的細胞外基質作誘導因子對MSC s發生協同誘導的增效作用，即使得該兩種細胞能夠模擬體內環境而發生協同作用，從而實現顯著縮短誘導MSCs分化成軟骨細胞的時間，提高了軟骨細胞的增殖率的目的。在優選實施例中，MSCs接種于插入式細胞培養皿中的量為2X104 5X104個/cm2。該接種量能使得該軟骨細胞外基質作誘導因子與誘導MSCs分化成軟骨細胞因子更好的發揮協同作用，實現進一步縮短誘導MSCs的時間，提高軟骨細胞的增殖率的目的。在另一優選實施例中，該插入式細胞培養皿的微孔膜結構的孔徑為0.22
0.8um,在更優選實施例中，該插入式細胞培養皿的微孔膜結構的孔徑為0.4 y m。該優選孔徑的插入式細胞培養皿更能有效的避免兩細胞間的交叉污染，保證兩細胞的純度，從而更加利用MSCs的誘導和軟骨細胞的增值。在優選實施例中，上述軟骨細胞誘導分化培養基配方是以DMEM高糖培養液為基礎，以及含有如下組分:
權利要求
1.一種誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，包括如下步驟: 獲取間充質干細胞和軟骨細胞； 將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養； 將所述間充質干細胞接種于插入式細胞培養皿中，再將接種有所述間充質干細胞的所述插入式細胞培養皿置于所述軟骨細胞培養液中，并將所述軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基后進行共同培養；其中，所述軟骨細胞誘導分化培養基中含有2X10—7 5X10_7mol/L的甲狀旁腺激素相關蛋白1-34。
2.根據權利要求1所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:在所述將軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基進行共同培養的步驟中，所述軟骨細胞誘導分化培養基還包含如下配方組分: 作為基礎成分的DMEM高糖培養液
3.根據權利要求1所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:在將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液的步驟中，所述軟骨細胞的接種量為0.5X104 I X IO4 個/cm2。
4.根據權利要求1所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:在將所述間充質干細胞接種于插入式細胞培養皿中的步驟中，所述間充質干細胞的接種量為2X104 5X104 個/cm2。
5.根據權利要求1 4任一項所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:在將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液的步驟中，所述軟骨細胞培養液以DMEM/F12培養基為基礎，添加有占所述軟骨細胞培養液體積百分比為5% 15%的胎牛血清。
6.根據權利要求1 4任一項所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:在所述將軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基進行共同培養的步驟中，所述共同培養的條件為37° C、5%C02。
7.根據權利要求1 4任一項所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:所述插入式細胞培養皿的濾膜孔徑為0.22 0.8 ii m。
8.根據權利要求1 4任一項所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:所述間充質干細胞為原代培養間充質干細胞或/和傳代培養間充質干細胞。
9.根據權利要求1 4任一項所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:所述軟骨細胞為原代培養軟骨細胞或/和傳代培養軟骨細胞。
10.根據權利要求1 4任一項所述的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，其特征在于:在將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液進行培養的步驟中，所述軟骨細胞在軟骨細胞培養液進行培 養0 2天。
全文摘要
本發明提供了一種誘導間充質干細胞(MSCs)成為軟骨細胞的方法，包括的步驟有獲取MSCs和軟骨細胞；將軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養；將MSCs接種于插入式細胞培養皿中，再將所述插入式細胞培養皿置于所述軟骨細胞培養液中，并將軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基后進行共同培養。該誘導方法能使得MSCs與軟骨細胞可以模擬體內環境而發生協同作用，使得誘導MSCs分化成軟骨細胞因子與軟骨細胞分泌的細胞外基質作誘導因子的協同作用，從而顯著縮短誘導MSCs分化成軟骨細胞的時間，提高了軟骨細胞增殖率，并且同時提高了誘導分化后細胞的II型膠原的表達率與表達量和糖胺聚糖(GAG)的分泌量。
文檔編號C12N5/077GK103146645SQ20131008115
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月14日 優先權日2013年3月14日
發明者趙文卓, 王涵, 劉韜 申請人:深圳市博泰生物醫學科技發展有限公司