專利名稱：一種金屬硫蛋白融合表達(dá)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)已成為生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的方法。為了便于重組蛋白質(zhì)的高效表達(dá)及下游的分離純化，目前，已開發(fā)很多融合表達(dá)載體用以在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白。研究表明，和非融合表達(dá)相比，融合表達(dá)的策略可以增加目的蛋白的產(chǎn)量、可溶性和均一性。而且，融合在氨基端的融合標(biāo)簽往往還能提高目標(biāo)蛋白在表達(dá)體系中的穩(wěn)定性。另外，由于融合標(biāo)簽的親和性，可以通過親和層析的方法很方便地純化獲得高純度的目標(biāo)融合蛋白。此外，將外源基因和能在大腸桿菌中高水平表達(dá)、且產(chǎn)物溶解性很好的蛋白質(zhì)(如金黃色葡萄球菌蛋白A，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白malE，大腸桿菌硫氧還蛋白等)構(gòu)建成融合蛋白的形式，借助于溶解性能好，高水平表達(dá)的融合伙伴蛋白使所需要的目標(biāo)蛋白質(zhì)(即外源基因產(chǎn)物)亦獲得可溶性的大量表達(dá)，從而避免包涵體產(chǎn)物的生成。以上這些方法都為國外科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)和建立、并都獲得了發(fā)明專利。其中，當(dāng)前使用最廣泛的兩種親和標(biāo)簽是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和His6-標(biāo)簽，很多商業(yè)化載體被開發(fā)用來表達(dá)具有GST或His6-標(biāo)簽的融合形式的目的蛋白，進(jìn)而使用谷胱甘肽親和層析或Ni柱親和層析得到純化。
金屬硫蛋白(metallothione，MT)是一種小分子量的、30％的氨基酸為半胱氨酸殘基的細(xì)胞內(nèi)蛋白，它的生理作用可能是通過清除氫氧根離子和結(jié)合金屬離子而起到抗氧化的作用。金屬硫蛋白富含半胱氨酸殘基，在生理條件下可以結(jié)合多個鋅離子和銅離子。在單細(xì)胞的真核生物中，金屬硫蛋白優(yōu)先結(jié)合銅離子；而在哺乳動物細(xì)胞中則優(yōu)先結(jié)合鋅離子，而鋅離子也可能被銅離子或鈣離子所取代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種基于金屬硫蛋白融合標(biāo)簽的融合表達(dá)載體，豐富和增強(qiáng)人類通過基因工程技術(shù)表達(dá)、純化重組目標(biāo)產(chǎn)物的手段和能力，類似方法在國內(nèi)外從未見過報道。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到將金屬硫蛋白基因置于常用啟動子的控制下，在金屬硫蛋白基因編碼序列之后插入多克隆位點。將目標(biāo)蛋白基因克隆在多克隆位點中，在金屬硫蛋白和目的蛋白質(zhì)之間設(shè)計有常見的蛋白酶位點，以便將目標(biāo)產(chǎn)物從融合蛋白中釋放出來。當(dāng)金屬硫蛋白-目標(biāo)產(chǎn)物融合蛋白在常用的基因工程表達(dá)體系中表達(dá)之后，利用金屬硫蛋白與二價金屬離子的螯合作用，可以采取金屬螯合層析的方法對融合蛋白進(jìn)行純化，然后利用常見的蛋白酶將目標(biāo)產(chǎn)物釋放和分離。金屬硫蛋白也可以作為融合蛋白標(biāo)簽融合在目標(biāo)產(chǎn)物的羧基端(及目標(biāo)產(chǎn)物的下游)進(jìn)行表達(dá)，融合表達(dá)產(chǎn)物可以利用金屬螯合層析方法進(jìn)行純化，然后利用常見的蛋白酶將目標(biāo)產(chǎn)物釋放和分離。
本發(fā)明的特色在于將金屬硫蛋白作為融合標(biāo)簽引入到常用的基因工程表達(dá)載體中，其結(jié)果可以使得目標(biāo)蛋白得到了穩(wěn)定的、可溶的高效表達(dá)；而且由于金屬硫蛋白本身具有結(jié)合金屬離子的能力，因此可以作為一種親和標(biāo)簽用來表達(dá)和純化目標(biāo)蛋白，并且增加了目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性和可溶性，提高了有生物活性的表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率。
本發(fā)明的用途是能夠?qū)⒔饘倭虻鞍鬃鳛橐粋€通用、有效、簡便的融合標(biāo)簽應(yīng)用于常用的基因工程表達(dá)體系，提高有生物活性的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，方便了目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化，適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
四

圖1.重組表達(dá)質(zhì)粒pT7MT示意圖。
1colE1質(zhì)粒復(fù)制起始點；2Lac I基因；3T7啟動子；4Ω序列；5核糖體結(jié)合位點及SD序列；6金屬硫蛋白2A基因；7多克隆位點；8f1復(fù)制起始點；9氨芐青霉素抗性基因。
圖2.重組MT-GST融合蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析。
(A)MT-GST重組蛋白的表達(dá)和純化1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)自上而下分別為97，66，43，31kDa；2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pT7MT-GST/BL21(DE3)細(xì)胞裂解上清；3.Ni2+親和層析純化的穿過峰；4.250mM咪唑的洗脫峰。
(B)GST-MT重組蛋白的表達(dá)和純化1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)自上而下分別為97，66，43，31，17kDa；2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pTORG-MT/BL21(DE3)細(xì)胞裂解上清；3.谷胱甘肽親和層析10mM GSH的洗脫峰；4.Sephadex G-15去除咪唑后的收集峰。
(C)重組MT-GST蛋白和重組GST-MT蛋白表達(dá)的比較1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)自上而下分別為97，66，43，31，17kDa；2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的GST-MT細(xì)胞裂解上清；3.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的MT-GST細(xì)胞裂解上清。
圖3.pET28a-Tn I和pT7MT-Tn I表達(dá)的比較和MT-Tn I的純化(A)Tn I-His6重組蛋白的表達(dá)1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)自上而下分別為97，66，43，31，17kDa；2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32a-Tn I/BL21(DE3)細(xì)胞的總蛋白質(zhì)；3.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32a-Tn I/BL21(DE3)細(xì)胞的超聲裂解上清；4.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32a-Tn I/BL21(DE3)細(xì)胞的超聲裂解后的包涵體。
(B)MT-Tn I重組蛋白的表達(dá)1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)自上而下分別為97，66，43，31kDa；2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pT7MT-Tn I/BL21(DE3)細(xì)胞的總蛋白質(zhì)；3.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pT7MT-Tn I/BL21(DE3)細(xì)胞的超聲裂解上清；4.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pT7MT-Tn I/BL21(DE3)細(xì)胞的超聲裂解后的包涵體。
(C)MT-Tn I重組蛋白的純化1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)自上而下分別為97，66，43，31kDa；2.重組MT-Tn I蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞裂解上清；
3.Ni2+親和層析純化獲得的重組MT-Tn I。
五具體實施例方式
1.pT7MT的構(gòu)建pT7MT是在pTORG(中國發(fā)明專利ZL01127171.X)原核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。通過NcoI和BamH1雙酶切，原先pTORG載體中的GST編碼序列被去除，進(jìn)而被MT2A的編碼序列所取代。通過PCR方法，原來載體中的thrombin酶切位點被factor Xa所取代。
MT2A的PCR模板為人心臟文庫(Clontech公司)為模板，PCR引物如下上游引物5’-CAT GCC ATG GAC TGC TCC TGC GCC GCC-3’，下游引物5’-CGGGAT CCC ACG ACC TTC GAT GGC GCA GCA G-3’。擴(kuò)增獲得的MT2A基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，然后進(jìn)行Nco I和BamH I雙酶切，再與經(jīng)同樣處理后的pTORG連接后，經(jīng)轉(zhuǎn)化和篩選獲得表達(dá)載體pT7MT，如圖1所示，其序列為T7啟動子-LacO-TCTAGATATTTTTACAACAATTACCAACAACACAAACAACAAACAACATTACAΩ 前導(dǎo)序列起始密碼子ATTACTATTTACAATAACAATGGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAA核糖體結(jié)合位點及SD序列ACAGTATTC-MT2A編碼基因- GGGATCCCCGGGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGC因子Xa識別位點編碼序列 多克隆位點TTGCGGCCGCACTCGAG ---T7終止子終止密碼子2.融合表達(dá)載體pT7MT-GST和pT7MT-Tn I的構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增得到GST和人肌鈣蛋白(Troponin I，Tn I)的編碼序列，插入到pT7MT中得到相應(yīng)的融合表達(dá)載體pT7MT-GST和pT7MT-Tn I。GST基因的PCR引物如下上游引物5’-CGCGGATCCATGGCCAGCTACCGAC-3’，下游引物5’-TCCCTCGAGTTATACGACAAAGCGGG-3’；Tn I的PCR引物如下上游引物5’-CGCGGATCCAAATGGGAGATGAGGA-3’，下游引物5’-GCCCTCGAGCTATTGTGAGGTCGGAGA-3’。獲得的PCR片段經(jīng)過BamH I和Xho I雙酶切后插入到pT7MT中，經(jīng)篩選獲得MT-GST和MT-Tn I融合表達(dá)載體pT7MT-GST和pT7MT-Tn I。同時，我們構(gòu)建了GST-MT/pTORG表達(dá)載體。以人心臟文庫(Clontech)為模板擴(kuò)增得到MT2A基因，引物如下上游引物5’-CCGGGATCC TCA TAT GGC CAT GGA-3’，下游引物5’-CGG CTC GAG TCA CAT TAT TTC ATA GA-3’。將MT2A基因經(jīng)過BamH I和Xho I處理后、插入到pTORG中獲得pTORG-MT。另外一個非融合表達(dá)載體pET28a-Tn I由本實驗室早先構(gòu)建并保存[東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，24(1)36-38，2005]。
3.MT-GST、MT-Tn I和GST-MT重組蛋白的表達(dá)重組蛋白的表達(dá)挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm振搖過夜。第二天按1∶100轉(zhuǎn)接到加有100μg/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm振搖3-4小時，直到OD600約1.0左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，總誘導(dǎo)時間4小時，6000rpm離心5分鐘收獲菌體。
4.MT-GST、MT-Tn I和GST-MT重組蛋白的純化對于MT-GST和MT-Tn I兩個蛋白質(zhì)，將來自1升培養(yǎng)基的總菌體重新懸浮于50ml 50mM PBS，pH8.0，超聲30分鐘破碎細(xì)胞。12000g離心20分鐘，分離超聲上清。純化根據(jù)His-Select TM HC Ni2+親和介質(zhì)(Sigma公司)的使用說明進(jìn)行。首先將Ni2+親和介質(zhì)用平衡緩沖液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)進(jìn)行平衡，然后將超聲上清上樣。上樣后再用平衡緩沖液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)洗至基線，最后用洗脫緩沖液(50mM PBS，pH8.0，250mM咪唑)進(jìn)行洗脫。洗脫峰組分中的咪唑通過Sephadex G-15凝膠過濾得以去除。最后純化得到的蛋白凍存于-70℃。
按照GST親和層析介質(zhì)的使用方法進(jìn)行純化，得到純化的GST-MT蛋白。來自1升培養(yǎng)基的總菌體重新懸浮于50ml PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4and 2mM KH2P04；pH 7.4)，超聲30分鐘破碎細(xì)胞。12000g離心20分鐘，分離超聲上清。然后將超聲上清上親和層析柱。上樣后再用平衡緩沖液PBS洗至基線，最后用洗脫緩沖液10mM谷胱甘肽(用50mM Tris-HCl，pH 8.0配制)進(jìn)行洗脫。
純化過程中所有組分的蛋白濃度采用BSA為標(biāo)準(zhǔn)品作為參照、用BCA試劑盒進(jìn)行定量，同時用考馬斯亮藍(lán)染色的12％SDS-PAGE進(jìn)行分析。
我們通過PCR獲得了MT2A基因，并將之克隆到pTORG載體中，取代原來的GST得到一個新的表達(dá)載體pT7MT(圖1)。使用這個載體，我們構(gòu)建了pT7MT-GST和pT7MT-Tn I表達(dá)載體，并表達(dá)了MT-GST和MT-Tn I蛋白。轉(zhuǎn)化了pT7MT-GST質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)以后，在分子量34kDa的位置出現(xiàn)一條明顯的MT-GST蛋白誘導(dǎo)條帶(圖2)。經(jīng)過Ni2+柱親和層析以后，得到了穩(wěn)定的、純度達(dá)到87％的MT-GST融合蛋白，產(chǎn)量達(dá)到30mg/L培養(yǎng)液。為了便于比較，我們同時也表達(dá)并純化了GST-MT蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)后的GST-MT在用GST柱親和層析進(jìn)行純化的過程中發(fā)生了嚴(yán)重的降解，最后幾乎完全降解只剩下GST，因此產(chǎn)量只有1mg/L培養(yǎng)液。通過這兩個蛋白的比較表明，放在C端表達(dá)很不穩(wěn)定的MT蛋白，置于N端以后穩(wěn)定性大大提高，不但沒有出現(xiàn)蛋白的降解(圖2A)，而且可能由于MT蛋白本身內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其表達(dá)水平和可溶性都大大提高了(圖2C)。
為了表明pT7MT對于其它蛋白的表達(dá)同樣有效，我們嘗試了Tn I的融合表達(dá)。根據(jù)以前的報道和我們先前的研究表明，Tn I蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時容易聚集而形成包涵體。我們之前的研究表明，在Tn I蛋白的羧基端加上一個His6-標(biāo)簽進(jìn)行表達(dá)時，蛋白的可溶性僅占全部表達(dá)量的10％(圖3A)；大量有活性的Tn I蛋白的制備最后是通過體外包涵體變復(fù)性的方法獲得的(中國發(fā)明專利申請?zhí)?00410014859.4)。而當(dāng)我們在Tn I的氨基端加上了MT2A的融合標(biāo)簽后，融合蛋白的可溶性達(dá)到了60％(圖3B)，通過Ni2+柱親和層析一步純化后的產(chǎn)量達(dá)到28mg/L培養(yǎng)液(圖3C)。這表明MT2A可以作為一種替代的融合表達(dá)伴侶提高目的蛋白表達(dá)的可溶性和產(chǎn)量，同時還能夠方便其純化。
從上述實例中可以清楚看出，我們以MT2A蛋白為伴侶分子和親和標(biāo)簽構(gòu)建了一個新的融合表達(dá)載體pT7MT，外源基因在該表達(dá)載體中表達(dá)時可以得到可溶的、高產(chǎn)的穩(wěn)定表達(dá)。MT2A因為其本身內(nèi)在的金屬離子結(jié)合能力，可以作為一種金屬螯合親和層析的融合標(biāo)簽幫助目的蛋白的純化。
權(quán)利要求
1.一種基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)的方法，其特征在于利用金屬硫蛋白作為融合標(biāo)簽，和外源基因一起進(jìn)行融合表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)的方法，其特征是能夠可溶性地、高產(chǎn)地穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)的方法，其特征是能夠通過金屬螯合親和層析方便地進(jìn)行目的蛋白的分離純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)的方法在基因工程或生物工程制備、生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
5.一種大腸桿菌基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)載體pT7MT，其特征在于利用金屬硫蛋白作用融合標(biāo)簽，和外源基因一起進(jìn)行融合表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種大腸桿菌金屬硫蛋白基因工程融合表達(dá)載體pT7MT，其特征是能夠在大腸桿菌中可溶性地、高產(chǎn)地穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種大腸桿菌基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)載體pT7MT，其特征是能夠通過金屬螯合親和層析方便地進(jìn)行目的蛋白的分離純化。
8.一種大腸桿菌基因工程金屬硫蛋白融合表達(dá)載體pT7MT在基因工程或生物工程制備、生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，所述一種利用金屬硫蛋白作為融合標(biāo)簽，和外源基因一起進(jìn)行融合表達(dá)的新方法，其特點在于能夠可溶性地、高產(chǎn)地穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物；能夠通過金屬螯合親和層析方便地進(jìn)行目的蛋白的分離純化。該融合表達(dá)體系適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。融合表達(dá)載體pT7MT，是一個能夠在大腸桿菌中可溶的、高產(chǎn)的穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物的金屬硫蛋白高效融合表達(dá)載體。
文檔編號C12N15/65GK1844398SQ200610040179
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者華子春, 范奕自 申請人:南京大學(xué)