過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法及其應用，所述過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法包括步驟：A）hASCs的獲取、純化及擴增；B）攜帶MT基因的腺相關病毒載體的構建；C）重組腺相關病毒載體感染hASCs，得到MT-hASCs。本發明將干細胞技術與先進的基因載體治療手段相結合，探索提高各項機能的新方法，為傳統臨床醫學技術帶來了革命性變化，具有重要的作用和深遠的意義。
【專利說明】過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，尤其是涉及一種可以過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法及其應用
【背景技術】
[0002]衰老是人類生命過程的必然規律，但自古以來，長命百歲、青春永駐就是人們夢寐以求的美好愿望，也是當今人類共同關心的問題?？顾ダ涎芯恳渤蔀?1世紀生理科學中的熱點課題。隨著人體的衰老，各項機能的退化是不可避免的，如何全面有效提高人體機能進而延緩衰老進程，是目前研究的熱點。
[0003]干細胞在抗衰老領域的應用正開展得如火如荼?？茖W家證實于細胞內含有幾十種人體細胞代謝促分化酶，提高人體的抗氧化能力，維持活細胞數量和死亡的平衡，繼而實現細胞的養生，從而延緩臟器的衰老，也可能通過改善血供等途徑而改善宿主的間質結構，從而為受體的支架細胞服務，延緩機體的衰老過程。
[0004]間充質干細胞(mesenchymal stemcel Is, MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，是目前免疫治療及抗衰老研究的熱點。
[0005]金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是富含半胱氨酸的短肽,對多種重金屬有高度親和性。它是分子質量較低，半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質。與其結合的金屬主要是鎘、銅和鋅，廣泛地存在于從微生物到人類各種生物中，其結構高度保守。有許多研究表明，MT在清除自由基與抗氧化的同時，通過對機體超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶(CAT)及谷朧甘膚過氧化物酶(GSH —` Px)等活性的提高，可明顯增強機體的抗衰老能力(MeydaniM,1998)。
[0006]由于MT具有十分重要的生理學功能，因此如何開發利用MT已成為當前研究的熱點課題。目前國內開展了多項關于MT的研究，在癌癥治療、細胞抗藥性等方面取得了顯著的成果?，F有技術中有將MT運用腺病毒轉基因技術過表達在人臍帶間充質干細胞上，進行除鉛治療，并有一定的療效。但該技術沒有解決其取材的便利性、細胞含量及擴增能力等方面存在的缺陷。
[0007]所以我們亟需一種方法，使其既能克服以上所述的劣勢，又能對人體多方面進行綜合性改善，提高整體機能，進而有效延緩衰老。

【發明內容】

[0008]本發明采用腺相關病毒轉基因技術使脂肪間充質干細胞(humanadipose-derivedstemcells, hASCs)過表達 MT,再將 MT-hADSCs 細胞輸入動物模型體內，從而達到綜合性的延緩衰老效果。腺相關病毒不會整合到宿主細胞基因組，方法安全可靠。
[0009]采用的技術方案為:
[0010]過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法，包括步驟:
[0011]A) hASCs的獲取、 純化及擴增；
[0012]B)攜帶MT基因的腺相關病毒載體的構建；
[0013]C)重組腺相關病毒載體感染hASCs，得到MT-hASCs。
[0014]本發明采用腺相關病毒的高效感染可以提高hASCs細胞中MT的表達效率。hASCs細胞來源廣泛、細胞含量高、取材容易、移植的免疫排斥反應很低，并且無倫理道德等問題，避免了直接注射腺相關病毒入體內，降低移植治療的副作用和風險。因此，本發明的技術是先進的、安全可靠的。
[0015]本發明將干細胞技術與先進的基因載體治療手段相結合，探索提高各項機能的新方法，為傳統臨床醫學技術帶來了革命性變化，具有重要的作用和深遠的意義。
[0016]本發明利用hASCs具有的免疫原性低；具有多向分化能力；增殖能力強，生物學特性穩定；具有免疫調節功能，異體移植不引起免疫排斥反應；無倫理、道德及法律方面的限制；相對純凈，污染機會少等優勢。
[0017]本發明利用腺相關病毒轉基因快速、方便、安全的優點，將MT轉入hASCs中過表達，將兩種最新的治療科技完美結合，進而輸入人體，對多項機能有促進作用。
[0018]本發明開展MT-hASCs促多項機能臨床試驗，建立臨床有效性安全性評價體系，獲得MT-hASCs促機能方案和技術標準。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1所示為為實施例中hASCs培養狀態(圖1A為40X，圖1B為100X)
[0020]圖2所示為為實施例中hASCs成脂分化(圖2A為200X，圖2B為400X)
[0021]圖3所示為為實施例中hASCs成骨分化(圖3A為400X，圖3B為400X)
[0022]圖4所示為為實施例中RT-PCR技術鑒定MT mRNA的表達情況
[0023]圖5所示為實施例中各組小鼠平均總進食量示意圖
[0024]圖6所示為實施例中各組小鼠平均體重的變化示意圖
具體實施例
[0025]下面結合實施例和附圖對本發明做進一步詳細說明。
[0026]實施例1hASCs的獲取、純化及擴增
[0027]( I) hASCs的分離和原代培養
[0028]脂肪標本來自美容整形門診接受抽脂術的健康供者。取20ml抽脂術獲得的脂肪組織，用膠原酶消化法分離hASCs，并通過貼壁培養的方法對其進一步純化。
[0029]hASCs流式檢測指標和表達的指標標準為:
[0030]CD105 不得低于 85%
[0031]CD73 不得低于 70%
[0032]CD9O不得低于％%[0033]CD45 不得過 2%
[0034]CD79a 或 CD19 不得過 2%
[0035]HLA-DR 不得過 2%
[0036]CD34 不得過 2%
[0037]CD14 不得過 2%
[0038]制備得到的細胞完全符合上述8個指標的標準，并且在第二代的時候就達到了很高的純度(95%以上)和很好的穩定性。成體細胞傳代次數越低，越有利于保證細胞的生物學活性和遺傳穩定性。
[0039](2 ) hASCs的傳代培養與擴增
[0040]觀察原代培養細胞貼壁生長至80%以上融合時，胰蛋白酶消化細胞，按1:3比例傳代培養，計為第I代(passagel，Pl)hASCs0待細胞生長至80%以上融合時，重復上述操作進行P2、P3代細胞培養擴增。
[0041](3) hASCs的誘導分化
[0042]取達到80%以上融合的hASCs，胰蛋白酶消化，完全培養基重懸后接種于24孔板，細胞達到60%融和時，分別換用成骨誘導培養基及成脂誘導培養基誘導分化，設置對照組。誘導分化21天后，固定細胞， 顯微鏡下觀察、記錄結果。
[0043]實驗獲取了較好活性的hASCs。圖1顯示hASCs培養狀態。分離出的MSC具有很強的干性，能被誘導分化成脂、成骨細胞等(圖2、3)。
[0044]實施例2構建攜帶MT基因的腺相關病毒體系
[0045]通過DNA重組技術將MT序列導入腺相關病毒載體，采用磷酸鈣共沉淀法，將重組腺相關病毒載體rAAV-hMT、包裝質粒、輔助質粒共轉染到宿主細胞中，完成腺相關病毒包裝和擴增。確定腺相關病毒感染的合適滴度、多次感染的間隔時間、感染持續時間和感染次數。最終，完成腺相關病毒的鑒定和基因測序。
[0046]AV (腺病毒)和AAV (腺相關病毒)都可以作為基因治療的載體，目前有技術應用AV整合MT進行除鉛。AV載體較易制備和操作，理化性質穩定，遺傳毒性較低，但不能整合到靶細胞基因組DNA中，且可能誘發機體的免疫反應，故其介導的轉基因表達時間短。AAV載體既可以轉染分裂細胞，也可以轉染非分裂細胞，在宿主體內以定向整合的方式存在，對人體無致病性，故AAV重組體在細胞內能長期穩定地表達，還可避免隨機整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危險。
[0047]實施例3重組腺相關病毒rAAV-hMT感染hASCs，得到MT-hASCs
[0048]采用RT-PCR技術，鑒定MSC中MT mRNA的表達情況。待細胞長至80%密度，用PBS洗3遍后，加Iml TRIzol試劑提取細胞總RNA。核酸檢測儀檢測RNA質量和濃度，取2 μ g的總RNA，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，獲得cDNA。熒光實時定量PCR鑒定hMT mRNA水平。同時設置6個濃度梯度，制作標準曲線。根據標準曲線，計算細胞株1、細胞株2和細胞株3中hMT mRNA和內參基因β -actin mRNA的相對含量。重復檢測3次。
[0049]結果顯示細胞株3中hMT mRNA表達水平較細胞株1、細胞株2增高約8倍(圖4)。
[0050]實施例4MT_hASCs細胞移植動物模型實驗
[0051]采用小鼠模型進行尾靜脈注射，對與衰老評估相關的一些實驗結果進行全面系統的分析。所有結果均使用Mcirosotf Execl2007軟件進行統計分析。[0052]選取雌性小鼠40只，5周齡，體重20.5±lg。隨機平分為4組，分組方案見表1。所有動物處于同一環境，10只/籠，條件為室溫25°C士 2V，相對濕度40 — 70%,保持良好通風，自然光照明，正常飼喂至30d。
[0053]表1小鼠模型分組方案
【權利要求】
1.一種過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法,包括步驟: A)hASCs的獲取、純化及擴增； B)攜帶MT基因的腺相關病毒載體的構建； C)重組腺相關病毒載體感染hASCs，得到MT-hASCs。
2.如權利要求1所述的過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法，其特征是:所述的步驟A)包括: ADhASCs的分離和原代培養； A2) hASCs的傳代培養與擴增； A3) hASCs的誘導分化。
3.如權利要求1所述的過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法，其特征是:所述的步驟B)包括: BI)將MT序列導入腺相關病毒載體得到rAAV-hMT ； B2)采用磷酸鈣共沉淀法，將重組腺相關病毒載體、包裝質粒、輔助質粒共轉染到宿主細胞中，完成腺相關病毒包裝和擴增。
4.一種生物制品，包括`米用權利要求1-3任一項所述的過表達金屬硫蛋白的hASCs構建方法制備得到的MT-hASCs。
【文檔編號】C12N5/10GK103695467SQ201310693542
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】姜舒, 羅朝霞, 劉穎斐, 曹娜, 黃文婷 申請人:深圳市茵冠生物科技有限公司