專利名稱：檢測突變和/或多態性的方法
技術領域：
本發明涉及檢測核苷酸序列中的突變和多態性的方法。
背景技術：
基因區域的突變可導致伴隨著翻譯氨基酸改變的錯義突變，氨基酸無任何改變的沉默突變，以及因缺失或插入核苷酸而使翻譯框移動的移碼突變。錯義突變還包括無義突變，其中在不正確的位置處產生了終止密碼子。另外，基因區域的突變也具有通過剪接異常等導致基因翻譯異常的潛能。除了沉默突變外，很多這種突變都伴隨著翻譯出的蛋白質的結構或功能改變。
另外，表達調節區域的異常也很可能會影響蛋白質的表達調節機制。
在核酸的核苷酸序列差異中，某一種群內以1％或更高頻率出現的突變被特別地稱為多態性。種群指的是可通過地理分離來區分的群體或亞種。例如，當某一突變在日本人中以低于1％的頻率出現，而在其他人種中以1％或更高的頻率出現時，該突變就不是突變，而是多態性。
在這些多態性中，因插入，缺失或置換單個核苷酸而產生的多態性被特別地稱為單核苷酸多態性(下文簡稱為SNP)。SNP分布很廣，因為它們是人類基因組中最常出現的突變。
由于多態性以固定的頻率廣泛分布于種群中，人們認為它不伴隨著任何表型變化，或者僅伴隨著這樣的表型變化，該變化只影響到被稱為結構的表型，而不會對存活(繁殖)特別不利。例如，有人提出當典型的成人疾病，如糖尿病，風濕癥，變態反應，自身免疫病，肥胖和癌癥受遺傳特征影響時，可以通過多態性來測定這些疾病的誘因。另外，藥物代謝，人白細胞組織相容性抗原(下文簡稱為HLA)等也受多態性的影響。此外，已揭示出大多數的多態性為SNP。
由于多態性具有諸如微衛星多態性之類的特征，可通過染色體作圖，連鎖分析等，用多態性來測定疾病相關基因。每300至600個核苷酸中存在一個SNP。因此，使用SNP能繪制出詳細的圖譜，該圖譜有望促進基因測定。
此外，通過匯集與多態性位置和波動性相關的信息，并分析它們與某些表型的關聯性，即有望獲得更多的信息。例如，通過發現與藥物副作用相關的SNP，即可防止這種藥物副作用。通過克服這些副作用，多種在實際應用中已被放棄的藥物可被重新評價為安全的藥物。
就細菌和病毒而言，丙型肝炎病毒(下文簡稱為HCV)亞型等是基于核苷酸序列特征的分類，所述核苷酸序列常以固定的頻率出現，因此，也可將這些亞型看成是多態性。研究這種多態性的基因型的突變分析被稱為分型。
α-干擾素對HCV的治療效力根據特定亞型的不同而有所區別。因此，定型為選擇治療方法提供了有用的重要信息。另外，還證實了除HCV以外的病原體，如流感病毒，瘧疾病原體和幽門螺桿菌也是根據亞型的不同而具有不同治療效力的病原體。因此，定型也為確定這些病原體的治療模式提供了重要信息。
與多態性形成對照的是，對人而言，以低于1％的頻率出現的突變是不會在人群中廣泛傳播的突變，幾乎所有的突變都可能被提及與某些類型的疾病相關。具體地說，這些突變對應于在遺傳病中發現的突變。此外，一些在個體中發現的突變也與疾病相關，例如已發現的與癌癥相關的突變等。對這些突變的檢測可為診斷相應疾病提供決定性的信息。
通過與互補的核苷酸序列雜交，可以證實某個基因的核苷酸序列是否與推測的核苷酸序列有所不同。更具體地，可以利用與引物或探針的雜交。
例如，當靶核苷酸序列具有與PCR引物互補的核苷酸序列時，該引物只能用作引物。基于這一原理，可使用PCR擴增產物作為指示劑，檢查靶核苷酸序列以確定該序列是否與引物互補。然而，基于PCR進一步證實核苷酸序列的方法存在幾個問題。首先，通過引物檢驗核苷酸序列的機制是不完全的。曾有人考慮過通過PCR法的擴增反應來檢測單核苷酸差異的方法(等位基因-特異性PCR，Nucleic Acids Res.17p.2503，1989；Genomics 5p.535，1989；J.Lab.Clin.Med.114p.105，1989)。然而，據S.Kwok等報道(Nucleic Acids Res.18p.999，1990)，當使用具有單核苷酸差異的引物時，與完全互補的引物相比，反應以每輪擴增循環約0.1％至85％(根據序列差異而有所不同)進行。換句話說，即使核苷酸序列與引物不完全互補，也常會發生互補鏈合成。結果證實為了使用等位基因-特異性PCR區分單核苷酸差異，有必要在另一個位置人工插入另一個錯配。然而，在這種情況下，也應根據序列差異精確地設置條件，而這并不是一項普通的技術。因此，難以在普通條件下通過PCR鑒定單核苷酸差異，如SNP。
換句話說，根據與互補核苷酸序列的雜交來檢測稍有不同的核苷酸序列的方法可能無法準確地進行檢測。根據PCR方法，通過不準確檢測而形成的產物也可以用作完全的模板，因此，這些產物引起指數擴增。使用常規的PCR方法檢測少量核苷酸序列的問題在于盡管存在不準確檢測的可能性，基于不準確的檢測，仍會發生高水平的擴增。
PCR法的第二個問題是原則上，僅能形成針對兩個區域的引物。因此，當同一樣品中存在多個由類似核苷酸序列組成的基因時，如果將PCR擴增產物的存在或缺乏用作指示劑，很難測定基因的突變和多態性。這是因為即使樣品中存在一種具有突變的基因，但是當引物與其中一個基因雜交時，就會進行PCR反應。
例如，將用于檢測家族基因，如人CYP2C19中某個基因的突變的引物也用作其它基因的引物。圖6顯示了在人CYP2C19家族中發現的彼此類似的核苷酸序列。從圖中可以看出，用于檢測某個基因突變的引物也可用作其它野生型基因的引物。在這種條件下，難以同時鑒定類似的基因并檢測僅有的兩個區域的突變。
為了解決上述兩個問題，有人提出所謂的依賴于PCR的突變檢測技術，其中通過PCR特異性擴增靶基因，然后使用探針或引物檢測突變。在這些技術中，DNA芯片法是格外引人注目的檢測技術。在DNA芯片上微小的區室內，可以放置很多相似的核苷酸序列。通過控制DNA芯片上精細空間的反應環境，可以檢測出是否存在基于核苷酸序列細微差別的雜交。然而，使用DNA芯片所獲得的分析數據的再現性是個主要問題。由于精細反應空間的存在，必須精確設置DNA芯片上的雜交條件。為了維持固定水平的再現性，需要復雜精細的技術和最大程度的小心謹慎。另外，由于這是依賴于PCR的技術，需要兩個步驟；DNA芯片的價格昂貴是需要解決的另一個問題。
另一方面，據報道Invader法(Mol.Diagn.4p.135，1999)和RCA法(Nat.Genet.19p.225，1998)是不依賴于PCR的突變檢測技術的例子。然而，這兩種方法的反應特異性都取決于兩個鄰近區域的探針套。正如在提到PCR時所指出的，難以同時鑒定類似的基因并檢測僅有的兩個區域的突變。
如上所述，已知的進一步證實核苷酸序列的方法都存在問題。例如，在一個步驟中無法精確鑒定微量的核苷酸序列。這些方法也難以同時鑒定相似的基因并檢測突變。另外，即使在技術上可以鑒定相似的基因并檢測突變(例如依賴于PCR的技術)，但是由于需要多個步驟，仍難以維持準確性，或者需要復雜的方法。最后，還需在經濟方面進行改善。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的反應原理，它能同時鑒定相似的基因，并準確檢測核苷酸序列中的微小差異。更具體地，本發明的目的是提供通過核酸合成法檢測靶核苷酸序列中的突變和多態性的方法，其中可以重復地檢驗靶核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明人注意到以下事實大多數引物不與靶核苷酸序列雜交，這正是基于已知核酸擴增反應進一步證實核苷酸序列的方法的問題所在。具體地說，在PCR方法中，源自引物的核苷酸序列被直接用作互補鏈合成的模板。因此，通過引物雜交檢驗靶核苷酸序列的機制實際上僅對整個反應中的極小部分起作用。大多數反應通過引物與互補鏈雜交來進行，所述互補鏈只是簡單地拷貝了引物的核苷酸序列。這種系統與檢驗靶核苷酸序列的宗旨相去甚遠。
因此，本發明人希望通過利用核酸合成反應準確地檢測靶核苷酸序列中的細微差異，所述反應含有多個與靶核苷酸序列的核苷酸序列雜交的步驟。然后，本發明人發現利用已完成互補鏈合成的3’末端作為接下去的互補鏈合成的起點，可獲得更精確的靶核苷酸序列檢驗機制，從而完成了本發明。
更具體地說，發明人首次通過互補鏈合成提供了核苷酸序列鑒定所用的引物，并且發現基于核酸合成法可以實現復雜精細的檢驗機制，其中引物被用作利用其自身作為模板的互補鏈合成的起點。本發明的發明人已經報道了這種類型的核酸合成反應(Nucleic Acid Res.2000，Vol.28，No.12，e63，WO00/28082)。本發明基于這種核酸合成方法解決了上述問題。更具體地，本發明涉及下列檢測突變和/或多態性的方法，以及所用的試劑盒[1]檢測靶核苷酸序列特定區域內的突變和/或多態性的方法，它包括以下步驟(1)在允許互補鏈合成的條件下保溫下列組分(a)至(e)，其中將第二和第一引物用作合成的起點；和(2)將利用靶核苷酸序列為模板的互補鏈合成反應所合成的產物的量與特定區域內突變和/或多態性的存在相聯系，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成(a)含有靶核苷酸序列的核酸樣品；(b)催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶；(c)第二引物，其中第二引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；(d)第一引物，其中第一引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；和(e)核苷酸底物；[2][1]的方法，其中第二引物或第一引物的5’末端上排列的核苷酸序列都含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成[3][1]的方法，另外還包括下列組分
(1)第三引物，其中第三引物用作互補鏈合成反應的起點，其中將模板上第一引物退火區域的3’側用作起點；和(2)第四引物，其中第四引物用作互補鏈合成反應的起點，其中將模板上第二引物退火區域的3’側用作起點；[4][1]的方法，其中相同樣品中存在一種基因，該基因含有的核苷酸序列類似于靶核苷酸序列的核苷酸序列；[5][4]的方法，其中所含核苷酸序列類似于靶核苷酸序列的核苷酸序列的基因是家族基因和/或假基因；[6][5]的方法，其中家族基因和/或假基因是選自下列的任何基因細胞色素P450家族，人白細胞組織相容性抗原和血小板同種抗原；[7][1]的方法，其中多態性是單核苷酸多態性；[8][1]的方法，其中靶核苷酸序列選自以下任何致病性病毒或致病性微生物基因的核苷酸序列丙型肝炎病毒，流感病毒，瘧疾和幽門螺桿菌；[9][1]的方法，其中在解鏈溫度調節劑的存在下進行保溫；[10][9]的方法，其中解鏈溫度調節劑是至少一種選自下列的化合物甜菜堿，脯氨酸和二甲基亞砜；[11][1]的方法，其中核酸樣品為雙鏈；[12][1]的方法，其中所述方法在核酸檢測器的存在下進行，以根據檢測器信號的變化檢測突變和/或多態性的存在；[13][1]的方法，其中將源自與需檢測突變和/或多態性的生物體相同的生物體，且其序列經證實不包括突變和/或多態性的核苷酸序列用作內部標準，通過與使用該核苷酸序列為模板所得合成產物的量相比較，檢測突變和/或多態性的存在；[14][1]的方法，另外還包括(f)第一種具環引物(loop primer)，其中第一種具環引物在第一引物延伸產物中的源自第一引物的區域和所述第一引物的任意區域之間提供互補鏈合成起點；和/或(g)第二種具環引物，其中第二種具環引物在第二引物延伸產物中的源自第二引物的區域和所述第二引物的任意區域之間提供互補鏈合成起點；[15][1]的方法，當含有所述特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，在與特定區域或其互補鏈退火的過程中，自互補鏈3’末端起的第二至第四個核苷酸中出現錯配，所述互補鏈是使用排列在第一引物和/或第二引物5’末端的核苷酸序列為模板而合成的；[16]含有下列組分，用于檢測靶核苷酸序列中特定區域的突變和/或多態性的試劑盒，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成i)第二引物，其中第二引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；ii)第一引物，其中第一引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；iii)催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶；和iv)核苷酸底物；[17][16]的試劑盒，另外還包括下列組分v)第三引物，其中第三引物通過與模板上第一引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點；和vi)第四引物，其中第四引物通過與模板上第二引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點；[18][16]的試劑盒，另外還包括下列組分vii)擴增內部標準的第五引物，其中第五引物的3’末端與內部標準的一個靶核苷酸序列鏈的3’側區域退火，第五引物的5’側包括與含有互補鏈合成反應之產物的任意區域的核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述反應利用引物為起點；和iix)擴增內部標準的第六引物，其中第六引物的3’末端與內部標準的一個靶核苷酸序列鏈的3’側區域退火，第六引物的5’側包括與含有互補鏈合成反應之產物的區域的核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述反應利用引物為起點；[19][18]的試劑盒，另外還包括下列組分
ix)第七引物，其中第七引物通過與模板上第六引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點；和x)第八引物，其中第八引物通過與模板上第六引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點；[20]檢測靶核苷酸序列特定區域內的突變和/或多態性的方法，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成，所述方法包括下列步驟a)將第一引物與靶核苷酸序列退火，以使用引物為起點，進行互補鏈合成反應，其中第一引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有互補鏈合成反應產物上的區域，所述合成反應利用該引物作為起點；b)使步驟a)中合成的第一引物延伸產物中與第二引物退火的區域處于能讓該區域與第二引物進行堿基配對的狀態，使用第一引物延伸產物為模板，將它們退火以合成互補鏈；其中第二引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有互補鏈合成反應產物上的區域，所述合成反應利用該引物作為起點；c)使用第二引物的延伸產物自身為模板，通過使具有所述推測核苷酸序列的產物的3’末端與所述延伸產物中的第一引物退火，進行互補鏈合成；d)使用步驟c)中合成的互補鏈自身為模板，通過使步驟c)中合成的，具有所述推測核苷酸序列的互補鏈的3’末端與所述延伸產物中的第二引物退火，進行互補鏈合成；和e)將利用第二引物作起點所得的合成產物的量與特定區域內突變和/或多態性的存在相聯系；[21][20]的方法，其中步驟b)包括通過置換將第一引物延伸產物轉變為單鏈的步驟，其中置換是使用第三引物為起點通過互補鏈合成反應而進行的，所述第三引物利用了與模板上的第一引物退火的區域的3’側； [20]的方法，其中步驟c)包括通過置換將第二引物延伸產物轉變為單鏈的步驟，其中置換是使用第四引物為起點通過互補鏈合成反應而進行的，所述第四引物利用了與模板上的第二引物退火的區域的3’側；[23][20]的方法，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成，所述方法還包括下列步驟1)在[20]的方法中，通過使第一引物的3’末端與第二引物延伸產物內的推測核苷酸序列退火，形成能與所述3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對的成環區域，并使用其自身3’末端作為互補鏈合成的起點來進行步驟c)的互補鏈合成反應；2)使第一引物與成環區域退火，利用催化互補鏈合成的DNA聚合酶，使用第一引物為起點進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；3)使用與成環區域退火的引物為起點，通過互補鏈合成反應置換自其自身3’末端開始延伸的產物，以使3’末端和所述推測的核苷酸序列之間能再次發生堿基配對；4)通過置換互補鏈以形成單鏈核酸，所述互補鏈是使用成環區域為起點，通過使3’末端與所述推測的核苷酸序列退火作為互補鏈合成之起點，進行使用其自身為模板的互補鏈合成反應而合成的，其中3’末端處于步驟3)中所述的形成堿基對的狀態；5)通過使3’末端與所述第二引物的推測核苷酸序列退火，并通過互補鏈合成形成成環區域，該區域與第二引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對；6)使第二引物與成環區域退火，通過催化互補鏈合成的DNA聚合酶，使用第二引物為起點進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；7)重復步驟3)至6)；和8)在步驟7)之后和/或與步驟7)平行，檢測單鏈核酸的形成，其中重復連接靶核苷酸序列及其互補鏈，并使所形成核酸的量與突變和/或多態性相聯系； [23]的方法，另外還包括下列步驟9)使用步驟4)中形成的單鏈核酸為模板，通過使其3’末端與所述第二引物的推測核苷酸序列退火，形成能與第二引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對的成環區域，并使用其自身的3’末端作為互補鏈合成的起點，以進行互補鏈合成反應；10)使第二引物與成環區域退火，所述區域是通過使3’末端與其自身的所述特定區域退火而形成的，使用第二引物為起點，通過催化互補鏈合成的DNA聚合酶進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；11)使用與成環區域退火的引物為起點，通過互補鏈合成反應置換自其自身3’末端開始延伸的產物，以使3’末端和所述推測的核苷酸序列之間能再次發生堿基配對；12)通過置換互補鏈以形成單鏈核酸，所述互補鏈是使用成環區域為起點，通過使3’末端與所述推測的核苷酸序列退火作為互補鏈合成之起點，進行使用其自身為模板的互補鏈合成反應而合成的，其中3’末端處于步驟11)中所述的能與所述推測的核苷酸序列形成堿基對的狀態；13)通過使3’末端與所述的推測核苷酸序列退火，并進行互補鏈合成形成成環區域，該區域與第一引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對；14)使第一引物與成環區域退火，通過催化互補鏈合成的DNA聚合酶，使用第一引物為起點進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；15)重復步驟11)至14)；和16)在步驟15)之后和/或與步驟15)平行，檢測單鏈核酸的形成，其中重復連接靶核苷酸序列及其互補鏈，并使所形成核酸的量與突變和/或多態性相聯系；[25][24]的方法，另外還包括下列步驟17)通過使步驟12)中形成的單鏈核酸的3’末端與其自身的所述推測核酸序列退火，形成能與第一引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對的成環區域，并使用其自身的3’末端作為起點，使用其自身作為模板以進行互補鏈合成反應；[26][20]的方法，其中第二引物和第一引物的5’末端上排列的核苷酸序列都含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成。
本發明所用的下列術語分別具有下文所述的含義。
突變本文中的“突變”指的是在相同來源的各個生物(包括病毒)中觀察到的核酸的核苷酸序列差異。關于多細胞生物，在個體的器官，細胞等中觀察到的差異也被稱為突變。突變是由點突變，缺失，插入，重復，倒位和易位造成的。另外，突變也可出現在基因區域(蛋白質編碼區域和內含子序列)或表達調控區域，如啟動子和增強子內。突變還包括在其它基因組序列中發現的核苷酸序列差異。
多態性在上述突變中，以1％或更高頻率出現在某個種群中的突變被特別地稱為“多態性”。在多態性中，由置換，插入或缺失單個核苷酸而組成的多態性被特別地稱為單核苷酸多態性(或“SNP”)。
靶核苷酸序列“靶核苷酸序列”是含有一個或多個待測突變或多態性的核苷酸序列，它含有一個區域，其中該區域的3’側是通過引物測定的。在下文中，術語“5’側”和“3’側”皆指用作模板的鏈的方向。更具體地，與本發明的引物退火的區域所包圍的核苷酸序列含有本發明的靶核苷酸序列。一般說來，從有義鏈的5’側至3’側來描述核酸的核苷酸序列。另外，本發明的靶核苷酸序列不僅包括有義鏈，還包括其互補鏈，即反義鏈的核苷酸序列。更具體地，術語“靶核苷酸序列”至少指的是被合成的核苷酸序列或其互補鏈。靶核苷酸序列含有下文所述的特定區域。
特定區域“特定區域”是上述靶核苷酸序列中包含的區域，其包括一個或多個待測突變或多態性。根據本發明的檢測方法，合成互補鏈，特定區域的推測核苷酸序列的互補鏈能與其5’末端結合。另外，必須加入與特定區域互補的核苷酸序列以包含所合成的互補鏈的5’末端。
推測的核苷酸序列“推測的核苷酸序列”可以是野生型核苷酸序列或含有特定突變的核苷酸序列。當將野生型核苷酸序列用作推測的核苷酸序列時，檢測靶核苷酸序列中是否存在野生型的核苷酸序列，并通過特定突變或多態性的核苷酸序列檢測靶核苷酸序列中是否存在含有特定突變或多態性的核苷酸序列。
3’末端或5’末端術語“3’末端”和“5’末端”不是指任一末端的核苷酸，而是指位于末端的，包括單個末端核苷酸的區域。更具體地，術語“3’末端”和“5’末端”包括自任一末端起的500個核苷酸，優選為100個核苷酸，或至少為20個核苷酸。與之形成對照的是，為了表示單個末端核苷酸或末端附近存在的特定位置處的核苷酸，具體標出了其位置的數值。
模板和互補鏈本發明中所用的術語“模板”指的是在互補鏈合成中被用作模板的核酸。盡管具有與模板互補的核苷酸序列的互補鏈是對應于模板的鏈，但這兩者的關系僅僅是相關。具體地說，被合成為互補鏈的鏈能用作模板。換句話說，互補鏈也可用作模板。
核酸合成和擴增本文所述的核酸合成指的是從用作合成起點的寡核苷酸起延伸核酸。除了合成以外，包括形成其它核酸和延伸所形成的核酸的連續反應的一系列反應被統稱為“擴增”。
退火術語“退火”和“雜交”指的是通過基于Watson-Crick模型的堿基配對形成核酸的雙螺旋結構。因此，即使核酸鏈的堿基配對由單鏈組成，通過分子內的互補核苷酸序列形成堿基對也被認為是退火或雜交。根據本發明，就核酸因堿基配對而形成雙螺旋結構這一點而言，退火和雜交是同義詞。當形成堿基對的核酸的3’末端用作互補鏈合成的起點時，被特別地稱為退火。然而，這不意味著通過雜交形成的堿基對不能用作互補鏈合成的起點。
基本相同的核苷酸序列當使用某序列為模板合成的互補鏈與靶序列退火并用作互補鏈合成的起點時，可以認為該序列與靶序列“基本上相同”。本文所用術語“相同”和“互補”包含不完全相同和不完全互補的情況。更具體地，與某一序列相同的序列也包括能與該序列退火的核苷酸序列的互補序列。另一方面，互補序列指的是能在嚴緊條件下退火，并提供3’末端作為互補鏈合成之起點的序列。更具體地，與某個核苷酸序列具有一般為50％至100％，通常為70％至100％，優選為80％至100％的同一性的核苷酸序列被認為是基本上相同的序列。可根據已知的算法，如BLAST來測定同一性。

在本發明檢測突變和多態性的方法中，根據下文所述的原理檢驗靶核苷酸序列特定區域中的核苷酸序列。首先，在本發明中使用下列第二引物和第一引物。本發明中使用的第二引物和第一引物中的每一個在其3’末端含有能與靶核苷酸序列3’側退火的核苷酸序列，在其5’末端含有與使用引物的3’末端為起點延伸的產物中的任意區域互補的核苷酸序列。引物5’末端上排列的至少一個核苷酸序列被設計成包括與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列。當特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用互補鏈合成的抑制作用檢驗互補鏈的核苷酸序列，所述互補鏈是使用引物5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的。當3’末端與特定區域(或其互補鏈)退火并用作互補鏈合成的起點時，檢驗機制總能發揮作用。因此，能將特定區域核苷酸序列中出現的任何差異清楚地檢測為反應產物的量的差異。
為了根據上述反應原理實際檢測突變和/或多態性，例如，可以使用以下反應。具體地說，本發明涉及檢測靶核苷酸序列特定區域內的突變和/或多態性的方法，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與上述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成，所述方法包括下列步驟a)將第一引物與靶核苷酸序列退火，使用引物為起點，進行互補鏈合成反應，其中第一引物的3’末端與兩條所述靶核苷酸序列鏈之一的3’側的區域退火，第一引物的5’側包括的核苷酸序列含有互補鏈合成產物上的區域，所述合成利用該引物作為起點；b)使步驟a)中合成的第一引物延伸產物中與第二引物退火的區域處于能讓該區域與第二引物進行堿基配對的狀態，使用第一引物延伸產物為模板，將它們退火以合成互補鏈，其中第二引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有互補鏈合成產物上的區域，所述合成利用該引物作為起點；
c)使用第二引物的延伸產物自身為模板，通過使具有所述推測核苷酸序列的產物的3’末端與所述延伸產物中的第一引物退火，進行互補鏈合成；d)使用步驟c)中合成的互補鏈自身為模板，通過使步驟c)中合成的，具有所述推測核苷酸序列的互補鏈的3’末端與所述延伸產物中的第二引物退火，進行互補鏈合成；和e)將利用第二引物作起點所得的合成產物的量與特定區域內突變和/或多態性的存在相聯系。
在本發明中，第二引物和/或第一引物延伸產物的3’末端與其自身的特定區域退火，并用作使用延伸產物自身為模板的互補鏈合成的起點。在此反應中，當特定區域的核苷酸序列是預想的核苷酸序列時，使用3’末端為起點進行互補鏈合成。與之形成對照的是，當核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，3’末端不能用作互補鏈合成的起點，結果，互補鏈合成受到抑制。因此，使用互補鏈合成的產物為指標，可以測定特定區域是否具有推測的核苷酸序列，在所述合成中，將3’末端用作引物，將產物自身用作模板。
此步驟合成的互補鏈延伸至其自身的5’末端以完成延伸。根據本發明，模板的5’末端總含有對應于引物5’末端上所排列核苷酸序列的核苷酸序列。即，與延伸產物中的任意區域互補的核苷酸序列被添加到模板的5’末端。因此，在使用延伸產物為模板而合成的互補鏈的3’末端再次產生與任意區域退火的核苷酸序列。隨后，當3’末端和與3’末端退火的任意區域通過某種方式形成堿基對時，又重新開始互補鏈的合成。
根據本發明，與延伸產物上的特定區域(或其互補鏈)互補的核苷酸序列排列于它的5’末端，所述產物是使用第二和第一引物中的至少一個的3’末端為起點合成的。在下文中，在某些場合下，將5’末端含有與特定區域(或其互補鏈)互補的核苷酸序列的第二或第一引物特別地稱為檢驗引物。
因此，每當使用檢驗引物的5’末端為模板而合成的延伸產物的3’末端與特定區域(或其互補鏈)退火時，所述3’末端即可檢驗特定區域(或其互補鏈)的核苷酸序列。因此，互補鏈合成的恢復取決于特定區域是否含有推測的核苷酸序列。從上述描述中可以清楚地看出，本發明的重要特征是當不斷重復地檢驗特定區域的核苷酸序列時，可進行使用其自身為模板而進行的互補鏈合成反應。因此，即使在互補鏈合成中產生錯誤的產物，在下一輪將產物用作模板的互補鏈合成中，檢驗核苷酸序列錯誤的機制會發揮作用。結果，在隨后一輪互補鏈合成中，使用錯誤產物的互補鏈合成受到抑制，因此，根據本發明，可以顯著降低由錯誤的互補鏈合成導致的“噪聲”。
僅通過在適當條件下保溫下列組分即可進行上述反應，所述反應實際上是為了根據本發明的原理檢測突變和/或多態性。更具體地，本發明提供了使用檢驗引物作為第二引物或第一引物中的至少一個，以檢測突變和/或多態性的方法，所述方法包括下列步驟在允許使用第二和第一引物為起點進行互補鏈合成的條件下，保溫下列組分(a)至(e)；和將利用靶核苷酸序列作為模板的互補鏈合成反應產物的量與特定區域內突變和/或多態性的存在相聯系(a)含有靶核苷酸序列的核酸樣品；(b)催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶；(c)第二引物第二引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側含有與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成的產物上的區域；(d)第一引物第一引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側含有與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；和(e)核苷酸底物。
使用第二和第一引物的核酸-擴增方法是本發明人以前報道過的“LAMP法”(Nucleic Acid Res.2000Vol.28，No.12e63；WO00/28082)。然而，本發明提供的新發現實際上是在檢測突變和多態性的方法中，使用LAMP法中所用的至少一個引物作為檢驗引物，可以提供高度準確的核苷酸序列檢驗機制。
上述反應中所用的第一引物含有下列區域X2含有與X2c互補的核苷酸序列的區域，該區域能測定靶核苷酸序列的3’側；和X1c位于上述X2c5’側的區域，該區域含有與區域X1的推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，所述X1區域存在于第一引物的延伸產物上。X1是第一引物延伸產物上的任意區域的序列，所述任意區域位于第一引物的3’末端和特定的核苷酸序列之間。X1c還包括具有與任意區域X1c的推測核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的區域。
下文將參照

圖1至4描述LAMP法的反應原理和該方法在本發明中的應用。在下文的描述中，FA指的是第一引物，RA指的是第二引物。FA由F2和F1c組成，它們分別對應于上述的X2和X1c。FA中包含的F1c還含有與F1c具有基本上相同的核苷酸序列的那些F1c。根據本發明，例如，任選的區域(如上述F1)可與含有與該區域互補的核苷酸序列的多核苷酸退火，只要使用多核苷酸為合成起點而合成的互補鏈具有本發明所需的功能，即可從任何任意區域選擇出該區域。
另一方面，由分別對應于上述X2和X1c的R2和R1c組成的引物可用作本發明的第二引物RA。在此情況下，例如，當將RA用作檢驗引物時，R1c含有FA延伸產物中的特定區域R1c的推測核苷酸序列，所述特定區域含有待測的突變和/或多態性，R2含有與核苷酸序列R2c互補的核苷酸序列，它構成FA延伸產物中的任意區域。
當在本發明的檢測方法中使用檢驗引物RA時，FA可被用作另一個檢驗引物。在如下所述使用檢驗引物RA進行互補鏈合成反應的過程中，FA延伸產物的3’末端時刻準備進行堿基配對，因此，可以使用產物自身為模板重復進行互補鏈合成反應。另一方面，還連續產生單鏈形式的RA延伸產物。另外，與FA一樣，RA的延伸產物也因其3’末端而將它們自身作為模板來進行互補鏈合成。在此反應循環中，通過使用FA的檢驗引物可提供檢驗FA延伸產物的核苷酸序列的機制。根據與上文所述的，通過RA檢驗核苷酸序列的機制相同的原理，進行本發明使用FA的檢驗機制，所述機制可用于檢驗互補鏈合成中特定區域的核苷酸序列。即將相同的原理應用于特定區域的互補鏈。
下文將更詳細地描述將檢驗引物用作FA和RA的反應。當檢驗引物用作RA時，使用R1作為起點的互補鏈合成[圖4-(9)]受到抑制。類似地，當檢驗引物用作FA時，使用F1作為起點的互補鏈合成[圖3-(8)]受到抑制。然而，與PCR中一樣，在實踐中不可能利用多核苷酸退火的特異性檢測核苷酸序列中的微小差異。對于本發明的反應而言同樣如此。即使當特定區域不含有推測的核苷酸序列，本發明中的互補鏈合成受到抑制，較為現實的做法是設想反應不能完全被抑制。
下文將討論盡管特定區域不是推測的核苷酸序列，但互補鏈合成不受抑制的情況。在圖1至4中，分開圖示了F1和R1c(或R1和F1c)。這些圖中闡明的反應代表使用檢驗引物作為FA或RA的反應。
另一方面，當檢驗引物被用作FA和RA時，與特定區域互補的核苷酸序列從兩個方向上與鏈退火。因此，與R1退火的R1c的至少一部分與F1重疊。同時，身為F1互補鏈的F1c的至少一部分與R1重疊。
首先，將在下文中討論使用F1為起點的互補鏈合成反應[圖3-(8)]，即具有錯誤的互補鏈合成的反應。第一步，R1與錯誤合成的延伸產物的特定區域退火，然后，合成互補鏈。檢驗引物為RA，使用RA為模板合成的3’末端R1與含有原先為FA3’末端的區域的區域退火。即，該區域含有推測的核苷酸序列以進行不具檢驗功能的互補鏈合成。然而，當互補鏈合成至5’末端時，其3’末端是檢驗引物FA5’末端的互補鏈。因此，通過使合成的互補鏈的3’末端與特定區域退火即可發揮檢驗機制的作用。
如上所述，還存在下列情況，即當FA檢驗機制在檢驗引物采用FA和RA的反應中起作用時，RA檢驗機制不起作用。然而，當靶核苷酸序列是雙鏈核酸時，RA和FA按照圖1至4中所示的順序反應的實際的可能性理論上是1/2。剩下的一半反應按照與圖1至4所示相反的順序進行。更具體地，在圖1至4中，“R”必須讀作“F”才能解釋剩下的一半反應，因為RA和FA各自與構成靶核苷酸序列的兩條鏈退火，并按照相同的方式進行隨后的反應。
或者，在基于圖1至4解釋本發明的反應時，還需提到RA(或FA)不代表與靶核苷酸序列的任一條鏈退火的特定引物。即，為了便于說明，圖僅僅將首先退火的引物解釋為RA。
因此，人們可以容易地認識到檢驗引物作為FA以及RA的重要性。具體地說，由于與上述FA互補鏈相似的檢驗機制對RA的互補鏈也起作用，在整個反應系統中，總共有更多的檢驗機制在起作用。因此，本發明的優選實施方案是將檢驗引物用作FA和RA。
下文將更詳細地討論基于本發明的檢驗機制。盡管本發明將檢驗引物用作FA和RA，但在有些反應中本發明的檢驗機制不起作用，這在理論上是確實存在的。具體地說，引物延伸產物的3’末端不與特定區域退火，而與源自任一引物的核苷酸序列退火，所述引物與環部分退火，該環部分鄰近于含有源自檢驗引物5’末端的核苷酸序列的區域。當3’末端不與特定區域退火，而與源自引物的核苷酸序列退火時，檢驗機制不起作用。然而，根據本發明，重要的是檢驗機制能多次起作用，直至產生檢驗機制對其不起作用的產物。
將產生檢驗機制對其不起作用的產物的可能性X表示為An。在本文中，A是盡管特定區域不包括推測的核苷酸序列，反應進行的可能性；n是產生檢驗機制對其不起作用的產物之前起作用的檢驗機制的數目。例如，甚至在以5％的比例產生檢驗機制對其不起作用的反應產物的情況下，如果檢驗機制工作3次，可能性X僅為0.053＝0.000125(0.01％)。即，與檢驗機制僅工作1次的情況相比，風險降低約1/500。因此，顯而易見的是，相對于檢驗機制僅工作1次的反應而言，本發明中產生檢驗機制對其不起作用的產物的可能性顯著降低。
上述靶核苷酸序列是檢測靶或得自檢測靶的核酸的一部分或全部。靶核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈序列。當它是雙鏈核酸時，測定靶核苷酸序列和靶核苷酸序列內的特定區域的每條鏈的3’末端的至少一部分核苷酸序列是已知的，或者是可預測的。或者，當靶核苷酸序列是單鏈核酸時，測定靶核苷酸序列3’側，互補鏈3’側的核苷酸序列和靶核苷酸序列內的特定區域的至少一部分核苷酸序列是已知的，或者是可預測的。上述3’末端X2c和位于其5’側的特定區域X1c的核苷酸序列是核苷酸序列應被測定的區域。本發明的特定區域含有潛在被突變的核苷酸，和/或含有一個或多個多態性。應設計本發明的檢驗引物，使得當特定區域內潛在被突變和/或具有多態性的核苷酸與推測的核苷酸不同時，互補鏈合成受到抑制。
例如，可按下述設計本發明的檢驗引物。具體地說，當使用檢驗引物為模板合成互補鏈時，設計引物，使得與所合成的互補鏈的3’末端鄰近的區域對應于與潛在被突變和/或具有多態性的核苷酸殘基互補的位點。當用作互補鏈合成之起點的3’末端或其相鄰區域存在錯配時，核酸的互補鏈合成反應明顯地受到抑制。更具體地，當距離用作互補鏈合成之起點的3’末端10個堿基，特別優選距離3’末端2至4個堿基的區域內存在錯配，更優選第2或第3個核苷酸為錯配時，互補鏈合成反應明顯地受到抑制。因此，優選設計檢驗引物5’側的核苷酸序列，以在此部分誘導錯配，所述錯配是由于存在(或缺乏)本發明的待測突變和多態性引起的。
根據本發明，如果起始于反應早期產生的產物的末端結構的反應不能被重復多次，就無法獲得廣泛的擴增。因此，即使發生錯誤的合成，由于錯配仍無法獲得廣泛的擴增，因為在某些階段，擴增中的互補鏈合成受到抑制。結果，錯配有效地抑制了擴增，給出正確的結果。即根據本發明的核酸擴增具有較完美的核苷酸序列檢驗機制。這些特征提供了優于諸如PCR的方法的優點，在這些方法中僅擴增了兩個區域之間的序列。
另外，當合成互補序列時，身為本發明所用引物之特征的區域X1c僅用作起點，互補序列與相同序列內新合成的X1退火以進行合成反應，所述反應使用鏈自身為模板。因此，即使產生所謂的引物二聚體，本發明的引物仍不會形成環，而這在現有技術中常常是個嚴重的問題。因此，本發明中不會發生由引物二聚體所致的非特異性擴增，從而改善了反應的特異性。
兩個區域X2c和X1c(或用作靶核苷酸序列的核酸的X2和X1)可以彼此連接，或者獨立存在。通過產物核酸的自身退火形成的環部分的狀態取決于兩個區域的相對位置。另外，優選這兩個區域必須分開，使得相對于退火兩個分子而言，更優先進行產物核酸的自身退火。因此，這兩個區域之間間隔核苷酸序列的優選長度一般為0至500個核苷酸。然而，在一些情況下，兩個區域彼此靠得太近不利于通過自身退火形成合乎需要的環。更具體地，能退火新引物并平穩地開始包括鏈置換的互補鏈合成反應的結構是環所需要的。因此，更優選將引物設計成使區域X2c和位于X2c 5’側的區域X1c之間的距離為1至100個核苷酸，進一步優選該距離為10至70個核苷酸。距離值不含有X1c和X2的長度。環部分的核苷酸長度進一步包括對應于X2的長度。
一般將構成本發明所用引物的區域X2和X1c彼此不重疊地連續排列于含有上述特定核苷酸序列的核酸內。或者，如果X2和X1c享有共同的核苷酸序列，可放置它們，使得它們彼此部分重疊。應將X2置于3’末端，一律用作引物。另一方面，如下所述將X1c置于5’末端，為使用X1c為模板而合成的互補鏈的3’末端提供引物功能。在下一步驟中，將使用引物為合成起點所得的互補鏈用作反向互補鏈合成的模板，最終，引物部分也被當成是互補鏈的模板而被拷貝。被拷貝的3’末端含有核苷酸序列X1，并與位于相同鏈內的X1c退火以形成環。在本文中，當模板5’末端的引物是檢驗引物時，X1c與特定區域退火。
本發明中所用的引物是符合兩個要求的寡核苷酸(1)能形成互補的堿基對，和(2)能在堿基對的3’末端提供-OH基團以用作互補鏈合成的起點。引物的骨架不局限于由磷酸二酯鍵組成的那些骨架。例如，引物可以是硫代磷酸酯，其含有S替代O作為骨架。另外，核苷酸可以是任何核苷酸，只要它能形成互補的堿基對即可。通常，有五種類型的天然核苷酸，即A，C，T，G和U；然而，還包括類似物，例如溴脫氧尿苷。本發明所用的寡核苷酸不僅用作合成的起點，還優選用作互補鏈合成的模板。
本發明所用的引物由核苷酸組成，所述核苷酸具有適當的長度，能在下述多種類型的核酸合成反應中的給定條件下，通過維持所需的特異性與互補鏈進行堿基配對。具體地說，引物含有5至200個核苷酸，更優選為7至50個核苷酸。催化依賴于序列的核酸合成的已知聚合酶所識別的最小引物長度為5個核苷酸左右。因此，優選退火部分的長度大于5個核苷酸。另外，為了確保核苷酸-序列特異性，引物一般含有6個或更多個核苷酸，優選含有7個或更多個核苷酸。另一方面，難以化學合成過長的核苷酸序列。因此，舉例說明的上述引物長度為優選范圍。例舉的引物長度僅對應于與互補鏈退火的部分。如下所述，本發明的寡核苷酸可獨立地與至少兩個區域退火。因此，應將上文例舉的引物長度理解為所述長度對應于構成引物的每個區域的長度。
另外，可用已知的標記物標記本發明所用的引物。所述標記物包括具有結合能力的配體，如地高辛和生物素；酶；熒光物質和發光物質；和放射性同位素。另外，將寡核苷酸中的核苷酸轉變為熒光類似物的技術是已知的(WO95/05391；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，6644-6648，1994)。
另外，可將本發明所用的引物固定于固相上。或者，用具有結合能力的配體，如生物素標記引物的任意部分，然后經由結合配對物，如固定化的親和素間接固定該部分。當將固定化的引物用作合成起點時，合成的核酸產物被固定于固相上，因此易于分離該產物。通過核酸-特異性指示劑或通過與標記探針進一步雜交，即可檢測分離的產物。或者，通過用任意限制性酶消化核酸以回收所需的核酸片斷。
除了上述兩個區域以外，本發明所用的引物還可含有其它區域。X2和X1c分別位于3’末端和5’末端，任意序列可位于這兩個區域之間。所述任意序列包括例如限制性酶識別序列，由RNA聚合酶識別的啟動子，編碼核酶的DNA等。通過插入限制性酶識別序列，可將本發明的合成產物單鏈核酸消化成兩個長度相同的雙鏈核酸，在所述單鏈核酸中，互補的核苷酸序列交替相連。通過插入由RNA聚合酶識別的啟動子序列，使用本發明的合成產物為模板，可將該產物轉錄成RNA。另外，通過額外安排編碼核酶的DNA，可以建立轉錄物的自身-裂解系統。上述所有額外的核苷酸序列僅當序列形成雙鏈核酸時才起作用。因此，在形成環的本發明單鏈核酸中，這些序列不起作用。這些額外的序列首次僅在核酸延伸得以進行，序列與互補的核苷酸序列退火而未形成任何環之后才起作用。
下文將要更具體地描述本發明的上述反應步驟(a)至(f)。
首先，使用第一引物進行將靶核苷酸序列用作模板的互補鏈合成，其中引物具有與靶核苷酸序列5’側任意區域相同的序列。然后，使用延伸產物為模板，用第二引物進行互補鏈合成。使與引物退火的區域處于準備進行堿基配對的狀態，使得能用第二引物進行互補鏈合成。具體地說，通過伴隨著互補鏈合成的置換即可達到此目的，所述互補鏈合成使用第三引物為起點，該引物與位于與第一引物退火之區域的3’側的靶核苷酸序列區域退火。根據本發明，第三引物與位于與第一引物退火的3’側的區域退火，并用作互補鏈合成的起點，所述合成針對與第一引物退火的區域進行。該步驟由DNA聚合酶催化，所述酶催化包括鏈置換的互補鏈合成。另外，通過諸如熱-變性的方法，可將第一引物的延伸產物轉變為單鏈。
然后，第二引物的延伸產物使用其3’末端為引物，產物自身為模板，啟動互補鏈合成。將核苷酸序列添加于在使用第二引物的互補鏈合成中用作模板的第一引物的5’末端，所述序列與第一引物延伸產物的任意區域中的推測核苷酸序列互補。因此，使用第一引物為模板而產生的第二引物延伸產物的3’末端含有與上述任意區域基本上相同的核苷酸序列。
在此步驟中，第二引物延伸產物的3’末端和與3’末端退火的區域應制備成準備進行堿基配對的狀態。通常，通過將延伸產物轉變為單鏈即可完成該步驟。具體地說，通過例如使用第四引物為起點，進行與互補鏈合成相關聯的置換，可將延伸產物轉變為單鏈，其中所述引物與同第二引物退火的區域的3’側退火。在本文中，將置換所用的引物，例如上述第三引物和此步驟所用的第四引物稱為外部引物。
第二引物在其5’末端含有與特定區域內的推測核苷酸序列互補的核苷酸序列。即，第二引物是檢驗引物。通過引物導入互補的核苷酸序列。因此，使用第二引物為模板合成的序列在其3’末端含有與其自身的特定區域互補的核苷酸序列。因此，系統處于準備檢驗特定區域中的核苷酸序列的狀態。接著，在隨后的反應步驟中，實際“檢驗”核苷酸序列。
按下述進行核苷酸序列的檢驗反應。首先，將上文合成的單鏈多核苷酸的3’末端和特定區域制備成準備進行堿基配對的狀態。優選按下述完成此步驟。具體地說，經由互補鏈合成置換3’末端，所述合成使用具有發夾結構的成環區域為起點。
根據本發明優選的實施方案，將形成環所需的核苷酸序列置于單鏈多核苷酸的互補核苷酸序列之間。形成環所需的序列在本文中被稱為成環序列。上述單鏈多核苷酸基本上由經由成環序列相連的互補核苷酸序列組成。一般說來，在堿基對解離之后不會解離成兩個或多個分子的核苷酸序列被稱為單鏈，而不用管它是否仍含有部分堿基配對。即使互補的核苷酸序列存在于相同的鏈上，它們也能形成堿基對。通過允許上述單鏈多核苷酸在相同的鏈內形成堿基對而獲得的，具有分子內堿基配對的產物含有雙鏈區域和不含堿基配對的環部分。
即，單鏈多核苷酸也可被定義為單鏈核酸，它含有在相同鏈內彼此退火的互補核苷酸序列，其退火產物在彎曲的絞鏈部分含有不具有堿基配對的環。具有互補核苷酸序列的核苷酸可與不含堿基配對的環退火。成環序列可以是任意核苷酸序列。成環序列可形成堿基對以啟動互補鏈合成，用于進行鏈置換，優選成環序列含有與其它核苷酸序列有所不同的序列，從而進行特異性退火。例如，在優選實施方案中，成環序列含有與第一引物互補的核苷酸序列。圖5顯示了示意圖，其中FA與成環區域退火。
通過第一引物與成環區域退火而進行的互補鏈合成置換單鏈多核苷酸的雜交部分，以制備準備進行堿基配對的特定區域和單鏈多核苷酸的3’末端。特定區域和單鏈多核苷酸的3’末端一起退火，3’末端提供3’-OH用作互補鏈合成的起點。在此階段，其核苷酸序列應被檢驗的特定區域與3’末端退火。因此，當此區域的核苷酸序列與推測的核苷酸序列相同時，使用3’末端為起點進行互補鏈合成。或者，當序列不是推測的核苷酸序列時，互補鏈合成受到抑制。
本發明最重要的特征是通過利用LAMP法，核苷酸序列檢驗機制在隨后的反應中一次又一次地發揮作用。例如，即使不論核苷酸序列與推測的核苷酸序列的差異，仍進行互補鏈合成，使用本發明的單鏈多核苷酸為模板的互補鏈合成反應產物的3’末端含有與特定區域互補的鏈。甚至在重復幾次互補鏈合成之后，由于產物自身在5’末端的特定區域內具有推測的核苷酸序列，產物的結構不會改變。另一方面，使用靶核苷酸序列為模板拷貝與3’末端退火的特定區域，因此，這兩者的退火仍含有錯配。因此，在包括第二輪反應的隨后幾輪反應中，還會發生抑制作用。可以認為根據本發明的核苷酸序列檢驗機制是使錯誤互補鏈合成的影響最小化的機制。
如上所述，當在靶核苷酸序列的存在下，使用具有特定結構的引物，和催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶進行合成時，具有核苷酸序列檢驗機制的互補鏈合成反應得以進行。結果，如果特定區域的核苷酸序列是推測的核苷酸序列，即開始連續產生互補鏈合成產物。另一方面，當序列不是推測的核苷酸序列時，本發明的核苷酸序列檢驗機制顯著抑制互補鏈合成。因此，當在固定的一段時間之后檢測擴增產物時，可以得出以下結論即樣品中的特定區域具有推測的核苷酸序列。
通過本發明的互補鏈合成獲得的核酸是在單鏈上含有交替相連的互補核苷酸序列的核酸。根據本發明，將所產生核酸的量與特定區域內推測核苷酸序列的存在相聯系。即，相對于當特定區域的序列是推測的核苷酸序列時，所產生的具有該構象的核酸的量而言，當序列不是推測的核苷酸序列時，所產生的相應的量有所減少。本文所用的，含有以單鏈形式交替相連的互補核苷酸序列，被用作指標的核酸指的是含有兩個彼此互補，交替相連于單鏈上的核苷酸序列的核酸。
通過本領域已知的方法可以檢測互補鏈合成的產物。例如，通過用凝膠電泳分析反應溶液，可將本發明的特定擴增產物測定為不同的帶。本發明的擴增產物由重復的靶核苷酸序列構象及其互補鏈為單位組成。產物的電泳結果給出以固定間隔排列的梯形帶。或者，也可通過已知方法監測反應過程中互補鏈合成的進程。例如，可使用特異于雙鏈核酸的熒光染料，如溴化乙錠和SYBR Green，將互補鏈合成產物的積累監測為熒光強度變化。可以使用下述內部標準當內部標準發出的信號增強或到達平臺期，而樣品發出的信號基本上未增強時，表示樣品中的特定區域不具有推測的核苷酸序列。
根據本發明的檢測方法，可將互補鏈合成所合成的產物的量與內部標準的相應量進行比較。例如，可將源自相同的核酸樣品，但不合突變或多態性改變的核酸用作內部標準。為了分析基因組核苷酸序列，將已知不存在突變或多態性的基因組核苷酸序列用作內部標準。或者，當使用mRNA為模板進行本發明的檢測方法時，例如可將在多種細胞中以幾乎相同的水平表達的基因用作內部標準。將上述任何內部標準的核苷酸序列用作靶核苷酸序列，在與本發明相同的條件下進行互補鏈合成反應。將產物的量用作對照，與需檢測突變的樣品的核苷酸序列的相應量進行比較。當產物的檢測量與內部標準的差不多時，證明特定區域的核苷酸序列具有推測的核苷酸序列。反之，當特定區域的核苷酸序列不是推測的核苷酸序列時，互補鏈合成產物的量小于內部標準的相應量。
另外，當出乎意料地未檢測到內部標準的互補鏈合成產物時，或者當檢測到的產物的量小于期望值時，懷疑反應自身出了問題。在大多數情況下，在與試驗引物相同的反應溶液中進行內部標準的反應。然而，在本發明中可以分開檢測內部標準，只要在同一條件下，使用相同樣品進行反應即可。例如，甚至當在第一反應系統和第二反應系統中，分別使用相同樣品檢測標準和樣品核酸時，標準也被稱為內部標準。
根據本發明，當特定區域含有推測的核苷酸序列時，合成的核酸中的互補核苷酸序列數目至少為一對。根據本發明優選的實施方案，該數目有時是整倍數。在這種情況下，理論上對本發明的上述核酸中互補核苷酸序列對的數目沒有上限。當作為本發明的產物被合成的核酸由多對互補核苷酸序列組成時，核酸由相同核苷酸序列重復組成。無需多說，反應產物可包括那些在沿著模板進行互補鏈合成反應的過程中，預-成熟終止而未到達5’末端的產物。
根據本發明合成的，含有以單鏈形式交替相連的互補核苷酸序列的核酸不總是必須具有與天然核酸相同的結構。已知在具有DNA聚合酶的核酸合成中，可通過使用核苷酸衍生物為底物合成核酸衍生物。所述核苷酸衍生物包括由放射性同位素標記的核苷酸，以及由具有結合能力的配體，如生物素和地高辛標記的核苷酸衍生物。使用這種核苷酸衍生物可標記作為產物的核酸衍生物。或者，使用熒光核苷酸為底物，可獲得作為熒光核酸衍生物的產物。另外，產物可以是DNA或RNA。產生的是DNA還是RNA，取決于核酸聚合化中所用的引物結構，聚合化底物的類型和聚合化試劑的類型組合。
本發明中所用的核酸可以是DNA，RNA或其嵌合分子。核酸可以是天然核酸，以及人工合成的核酸。另外，本發明的核酸還包括具有部分或完全人工結構的核苷酸衍生物，只要它可形成堿基對或能在互補鏈合成中用作模板即可。對本發明核酸中的核苷酸數目沒有限制。術語核酸等同于術語多核苷酸。另一方面，本文所用術語寡核苷酸特別地指在多核苷酸中具有較少數目的核苷酸的多核苷酸。一般說來，術語寡核苷酸指的是含有2至100個核苷酸殘基，更優選約2至50個核苷酸殘基的多核苷酸，但并不局限于此。
本發明的檢測方法可用于所有類型的核酸。具體地說，例如，所述核酸包括原核和真核細胞的基因組DNA；病毒基因組DNA和RNA；細胞內寄生蟲，如支原體和立克次氏體的基因組；由這些物種的mRNA轉變而來的cDNA；由這些基因來源構建的文庫；分離自文庫的克隆等。當需檢測突變和多態性改變的基因是RNA時，可使用具有逆轉錄酶活性的DNA聚合酶將其轉變為cDNA。用作本發明樣品的核酸一般包含于生物樣品中。所述生物樣品包括動物和植物組織，微生物細胞，細胞，培養物，排泄物及其提取物。根據本發明，得自生物體的生物樣品和源自宿主生物體中生活的傳染性寄生蟲，微生物和病毒的生物樣品中所含的核酸可用作檢測的靶。本發明的核酸也可得自上述生物樣品的核酸。例如，在本發明的檢測方法中，可將由mRNA合成的cDNA和由得自生物樣品的核酸擴增的核酸用作樣品。這些基因在按下文所述變性成單鏈，或保持為雙鏈之后，可用作本發明檢測方法中的樣品。
當在適于引物退火和使用引物為起點進行互補鏈合成的條件下保溫時，含有本發明的靶核苷酸序列的雙鏈形式的核酸可用作樣品。一般說來，通過變性轉變為單鏈的步驟是通過與探針或引物雜交以分析核酸樣品所必需的。然而，本發明人已發現在使雙鏈核酸去穩定化的條件下，由引物進行互補鏈合成的過程中則可省去轉變為完全單鏈的步驟(2000年4月7日提交的日本專利申請2000-111939)。
具體地說，在僅使雙鏈核酸去穩定化的條件下，難以進行有效的互補鏈合成，但是，通過聯合使用合成與起初在等溫條件下進行的核酸擴增反應，即可進行效率類似于使用單鏈核酸模板所獲得的效率的擴增。當使用的模板核酸為單鏈時，本發明所用的核酸擴增方法在等溫下進行。該方法基于等溫條件下互補鏈合成反應循環的原理，所述反應循環由以下步驟組成自身退火，隨后進行互補鏈合成，更新的引物與環退火，隨后再使用DNA聚合酶進行互補鏈合成，所述聚合酶催化包括鏈置換的互補鏈合成。因此，根據本發明，雙鏈核酸可用作靶核苷酸序列。
本文描述了將雙鏈核酸直接用作本發明的模板以檢測突變和多態性的方法。下列描述解釋了當特定區域的核苷酸序列就是推測的核苷酸序列時啟動的互補鏈合成過程。當特定區域的核苷酸序列與推測的核苷酸序列有所不同時，在鏈自身的3’末端與特定區域退火之后，使用鏈自身為模板進行的互補鏈合成反應的抑制步驟被摻入下文所述的一些類型的互補鏈合成反應中。
本發明的雙鏈核酸包括例如cDNA和基因組DNA。另外，其中已插入這些DNA的多種載體也可用作本發明的雙鏈核酸。本發明的雙鏈核酸可以是純化的或粗的核酸。另外，本發明的方法也適用于細胞中的核酸(原位)。使用細胞中的雙鏈核酸為模板，即可進行原位基因組分析。
當本發明中將cDNA用作模板時，可在相同條件下進行本發明的cDNA合成步驟和核酸合成方法。當使用RNA為模板進行cDNA的第一鏈合成時，形成DNA-RNA雜合體的雙鏈核酸。可使用雙鏈核酸作為本發明的模板進行合成核酸的方法。當本發明合成核酸的方法中所用的DNA聚合酶具有逆轉錄酶活性時，在相同條件下使用單個酶即可完成核酸合成。例如，Bca DNA聚合酶是具有鏈-置換活性以及逆轉錄酶活性的DNA聚合酶。顯然，在通過第二鏈合成形成完全雙鏈cDNA之后，也可使用本發明的合成核酸的方法。
使用聚合酶檢測本發明的突變和多態性，所述聚合酶催化包括鏈置換的互補鏈合成。與SDA等所用的聚合酶類型相同的聚合酶可用作本發明的DNA聚合酶。在使用引物作為合成起點的互補鏈合成過程中，通過置換模板5’側的雙鏈區域(如果模板上存在任何雙鏈區域的話)來合成互補鏈的特定聚合酶是本領域已知的，其中所述引物與某個核苷酸序列3’側的區域互補。模板的5’側代表位于引物3’側的區域。因此，模板的5’方向是進行互補鏈合成反應的方向。根據本發明，還需添加互補鏈合成所需的底物。
在本發明中，將任意引物與雙鏈核酸混合，在確保使用引物為起點進行互補鏈合成的條件下保溫混合物。使用本發明的任意引物，使與FA退火的區域作好堿基配對的準備。因此，任意引物需要具有與模板雙鏈核酸的核苷酸鏈的互補鏈退火的能力，其中所述核苷酸鏈與FA退火。另外，使用本發明的任意引物作為復制起點的互補鏈合成中的鏈延伸應該針對與FA退火的區域進行。換句話說，引物可與區域的任意部分退火，所述區域用作使用FA為起點的互補鏈合成的模板。可從任意區域中選擇符合標準的任意引物。例如，在RA或模板內與RA退火之區域的3’側退火的外部引物(將在下文中描述)也可用作任意引物。使用外部引物是本發明的一個優選實施方案，因為必需的反應組分的數目有所減少。
通過在使用任意引物為起點的互補鏈合成中置換兩條雙鏈核酸鏈中的一條，即可確保與FA進行堿基配對。通過選擇這種條件，甚至在將雙鏈核酸用作樣品時，也可在不改變溫度的情況下進行本發明的方法。能確保任意引物和雙鏈核酸退火，并使用該引物為起點進行互補鏈合成的條件實際上是在不改變反應條件的情況下完成下列多個步驟的條件i)使引物與雙鏈核酸模板退火；和ii)使用退火引物為復制起點進行互補鏈合成。
通常，人們相信僅當與引物退火的區域為單鏈時，引物才能與核酸鏈退火。因此，當將雙鏈核酸用作模板時，以前核酸還需要經過以下步驟，即在引物退火之前，先通過變性將核酸轉變為單鏈。然而，在通過某種方式使雙鏈去穩定化，而不是將雙鏈完全轉變為單鏈的條件下，通過保溫模板與引物也可達到與引物退火的目的。將雙鏈核酸加熱至接近解鏈溫度(下文簡稱為Tm)的條件可被舉例為雙鏈去穩定化條件。或者，加入Tm調節劑也有效。
在以下組分的存在下進行包括一系列步驟的反應，所述組分是提供適于酶反應的pH的緩沖液，引物退火和維持酶催化活性所需的鹽，酶的防腐劑，另外必要時還包括解鏈溫度(Tm)調節劑等。本發明中使用了具有緩沖作用的緩沖液，其pH范圍為中性至弱堿性，如Tris-HCl。根據所用DNA聚合酶的類型來調節pH。為了維持酶活性和改動核酸解鏈溫度(Tm)而加入的鹽的例子包括KCl，NaCl，(NH4)2SO4等。酶的防腐劑包括牛血清白蛋白和糖。
另外，常用的解鏈溫度(Tm)調節劑包括甜菜堿，脯氨酸，二甲基亞砜(下文簡稱為DMSO)和甲酰胺。當使用解鏈溫度(Tm)調節劑時，可在有限的溫度范圍內調節上述寡核苷酸的退火。另外，甜菜堿(N，N，N，-三甲基甘氨酸)和四烷基銨鹽因其等穩定化作用而能有效改善鏈置換的效率。在反應溶液中加入濃度約為0.2至3.0M，優選約為0.5至1.5M的甜菜堿有望能增強本發明的核酸擴增。由于這些解鏈溫度調節劑降低了解鏈溫度，通過考慮反應條件，如鹽濃度和反應溫度，憑經驗選擇能提供所需嚴緊度和反應性的條件。
通過利用Tm調節劑，可以容易地選擇酶反應所需的適當溫度條件。根據引物與靶核苷酸序列的關系改變Tm。因此，優選調節Tm調節劑的量，使得維持酶活性的條件與符合本發明標準的保溫條件一致。根據本發明的內容，本領域技術人員可以根據引物核苷酸序列容易地選擇待加入的適當量的Tm調節劑。例如，可根據退火核苷酸序列的長度和GC含量，鹽濃度和Tm調節劑的濃度來確定Tm。
引物與雙鏈核酸在這種條件下退火被認為是不穩定的。然而，當DNA與催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶一起保溫時，使用不穩定退火的引物作為復制起點以進行互補鏈合成。一旦合成互補鏈，隨著時間的流逝，引物退火變得更加穩定。下文列出的DNA聚合酶在確保引物與雙鏈核酸退火的條件下催化互補鏈合成。
催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶在本發明檢測突變和多態性的方法中起著至關重要的作用。所述DNA聚合酶包括下文所列的那些。另外，本發明還可以使用這些酶的多種突變體，只要它們具有依賴于序列的互補鏈合成活性和鏈置換活性即可。所述突變體包括截短的酶或突變的酶，前者僅具有具催化活性的結構，后者的催化活性，穩定性或熱穩定性已通過氨基酸突變得以修飾。
Bst DNA聚合酶Bca(exo-)DNA聚合酶DNA聚合酶I的Klenow片斷Vent DNA聚合酶
Vent(Exo-)DNA聚合酶(無外切核酸酶活性的Vent DNA聚合酶)DeepVent DNA聚合酶DeepVent(Exo-)DNA聚合酶(無外切核酸酶活性的DeepVent DNA聚合酶)Φ29噬菌體DNA聚合酶MS-2噬菌體DNA聚合酶Z-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)KOD DNA聚合酶(TOYOBO)在這些酶中，特別優選Bst DNA聚合酶和Bca(exo-)DNA聚合酶，因為它們是具有一定程度的熱穩定性和高催化活性的酶。根據本發明，在相同條件下進行引物與雙鏈核酸的退火和互補鏈合成。由于所述反應經常需要一些加熱，因此優選使用熱穩定性的酶。通過熱穩定性的酶，可在多種條件下完成反應。
例如，Vent(Exo-)DNA聚合酶是具有鏈置換活性的高度熱穩定的酶。據報道，加入單鏈-結合蛋白可促進使用DNA聚合酶進行的，包括鏈置換的互補鏈合成反應(Paul M.Lizardi等，Nature Genetics 19，225-232，1998年7月)。通過將此方法應用于本發明，有望通過加入單鏈-結合蛋白來促進互補鏈合成。當使用Vent(Exo-)DNA聚合酶時，T4基因32可有效地用作單鏈-結合蛋白。
由于使用了缺乏3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，本領域已知這樣一種現象即甚至當反應到達模板的5’末端，已合成的鏈中添加了多余的核苷酸時，互補鏈合成仍未終止。本發明不優選此現象，因為接下來的互補鏈合成從合成的3’末端互補鏈序列開始。然而，由DNA聚合酶添加至3’末端的核苷酸很有可能是核苷酸“A”。因此，應選擇互補鏈合成的序列，以從3’末端的A開始合成，從而避免因錯誤添加單個-dATP核苷酸所致的問題。或者，甚至當3’末端在互補鏈合成的過程中為突出端時，可通過3’→5’外切核酸酶活性將其消化成平端。例如，可以聯合使用具有這種活性的天然Vent DNA聚合酶與Vent(Exo-)DNA聚合酶以克服上述問題。
與上述DNA聚合酶不同，諸如常用于PCR的Taq聚合酶PCR之類的DNA聚合酶在一般的條件下幾乎不表現出鏈置換活性。然而，當在確保能進行鏈置換的條件下使用這種DNA聚合酶時，所述酶也可用于本發明。
根據本發明，可在LAMP法中使用具環引物來改善擴增效率。具環引物是在上述FA延伸產物中的源自FA的區域和對應于FA的任意區域(即含有與FA5’末端互補的核苷酸序列的區域)之間提供互補鏈合成起點的引物。對RA而言情況類似，可以使用具環引物，在上述RA延伸產物中的源自RA的區域和對應于RA的任意區域(即含有與RA5’末端互補的核苷酸序列的區域)之間提供互補鏈合成起點。本文為了方便起見，將對應于FA的具環引物稱為具環引物F；將對應于RA的具環引物稱為具環引物R。根據LAMP法的產物經常包括不能與RA或FA退火的環這一事實來設計具環引物。本發明人提交了有關使用具環引物的LAMP法的專利申請(2000年9月19日提交；日本專利申請號為2000-283862)。通過聯合使用具環引物和LAMP法，反應效率顯著改善。在使用具環引物時，在加入具環引物F和/或具環引物R以及RA，FA，必要時還加入外部引物之后，開始反應。甚至通過在反應進行之后僅加入具環引物，具環引物也有望能發揮作用，然而，為了改善反應效率，更為理性的做法是在開始反應之前加入它們。
根據本發明，試劑盒可作為本發明上述反應的一套預先組合好的組分被提供。更具體地，本發明涉及用于檢測突變和/或多態性的試劑盒，其含有由兩種內部引物組成的引物套，催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶，以及核苷酸底物，其中上述引物套中至少任一種內部引物是檢驗引物。本發明的試劑盒中還可摻入對應于上述內部引物的外部引物和另一個內部標準引物套。另外，試劑盒也可含有具環引物以改善反應效率。另外，試劑盒中還附有標準樣品作為陽性或陰性對照，操作說明書等。此外，試劑盒可含有指示劑組分用于檢測擴增產物。所述指示劑包括例如熒光染料，如EtBr；識別擴增產物的核苷酸序列時可產生信號的探針等。
另外，通過聯合使用兩套針對野生型和突變型的引物作為上述內部引物套，可以提供用于測定雜合子/純合子的基因定型試劑盒。當用基因定型試劑盒檢測不同類型的突變時，通過使用數目相當于突變類型數目的多個引物套進行基因定型，可以辨別所有突變型的純合子和雜合子。在家譜分析和基于基因型的表型預測中，測定純合子和雜合子是至關重要的。
下文將參照圖1至4描述通過聯合使用上述內部引物RA和FA，和具有鏈-置換活性的DNA聚合酶進行雙鏈核酸擴增反應的基本原理。根據實施例，擴增引物套由內部引物RA和FA組成，另外，RA還用作任意引物，可以使與FA退火的雙鏈靶核苷酸序列區域作好堿基配對的準備。當特定區域，即R1含有推測的核苷酸序列時，如下所述的擴增反應將在本發明中進行。另一方面，如果特定區域不具有推測的核苷酸序列，每當3’末端R1c與R1退火時，互補鏈合成反應即受抑制，因此，理論上，擴增反應不會進行。或者，甚至在有可能使用R1c為起點，錯誤地進行互補鏈合成時，最終的影響也可以忽略不計，原因是產物的量非常少。
上述任意引物(圖1-(1)中的RA)首先與模板雙鏈核酸上的X2c退火(對應于R2c)以用作互補鏈合成的起點。在這種條件下，雙鏈核酸是不穩定的，引物直接用作雙鏈核酸上的互補鏈合成的起點。在圖1-(2)中，使用RA為起點合成的互補鏈置換了模板雙鏈核酸的一條鏈，與內部引物FA退火的區域F2c已作好堿基配對的準備(圖1-(2))。
通過使FA與已作好堿基配對準備的區域F2c退火，進行互補鏈合成。在本文中，由FA 3’側啟動互補鏈合成的外部引物F3也與該區域退火(圖2-(4))。設計外部引物，以在每個內部引物的3’側啟動互補鏈合成，相對于內部引物而言，外部引物的使用濃度較低。因此，與內部引物相比，外部引物更有希望啟動可能性較低的互補鏈合成。
聯合使用具環引物和內部引物RA和FA的本發明突變檢測方法中的檢驗機制的嚴緊度主要取決于F1/F1c的Tm。通過在可允許的范圍內使F1/F1c的Tm最小化，即可獲得嚴緊的核苷酸序列-檢驗機制。然而，在F1/F1c的Tm低于可接受的限度的情況下，甚至當特定區域的核苷酸序列是推測的核苷酸序列時，也不能進行有效的擴增。例如，在下述實施例中，當F1/F1c的Tm為45℃時，在反應溫度為60℃時會發生有效的合成。通常，當反應溫度比Tm高15℃時，不同多核苷酸分子的雜交不能進行。換句話說，在這種情況下，無法進行有效的互補鏈合成。然而，由于在本發明中F1/F1c的退火發生在單個分子上，因此，甚至當Tm比反應溫度低很多時，也可在不犧牲反應效率的情況下獲得嚴緊度足夠高的核苷酸序列檢驗。因此，對本發明而言較為有利的條件是設計F1/F1c的Tm，使得不同類型的多核苷酸不能彼此雜交，但可以進行分子內雜交。例如，下文所述實施例5中所用的各個引物的Tm值如下外部引物F3(R3)60℃具環引物FL56℃
具環引物RL58℃內部引物FA3’側的F2(或RA3’側的R2)55℃內部引物FA5’側的F1c(或RA5’側的R1c)45℃當根據本發明聯合使用具環引物時，整體反應效率有所增加。因此，甚至在將F1c(R1c)的Tm設置得較低時，也有望在短時間內進行廣泛擴增。因此，根據本發明可縮短引物的長度。
使用外部引物F3作為起點進行的互補鏈合成的結果是使用內部引物FA為起點合成的延伸產物被置換和釋放成單鏈(圖2-(5))。使用所述單鏈為模板，RA和對應于RA的外部引物R3彼此退火，并啟動互補鏈合成(圖3-(6))。結果，RA延伸產物具有能使3’末端F1與其自身進行分子內退火的結構(圖3-(8))。
在圖3-(6)中，鏈的5’末端在分子內與其自身退火。然而，此結構不能啟動擴增反應，因為5’末端不能用作互補鏈合成的起點。僅當合成了圖3-(6)所示鏈的互補鏈，隨后提供在其3’末端與其自身退火的結構(圖3-(8))時，才能啟動擴增反應。可將這些反應步驟稱為本發明擴增反應的準備步驟。
下文將參照附圖中所示的示意圖，具體描述本發明的核酸擴增和特定區域R1c的核苷酸序列檢驗機制。將自身-退火的3’末端F1(圖3-(8))用作互補鏈合成的起點。與3’末端的退火發生在F1和F1c之間，因此，也可能發生下述情況，即所述退火與也含有F1c的FA競爭。然而，實際上，存在于相同鏈上的相鄰區域的互補核苷酸序列F1/F1c優先互相退火。因此，優先啟動使用其自身鏈為模板的互補鏈合成反應。通過此反應合成核酸，其中靶核苷酸序列在單鏈上交替相連。另外，在通過3’末端F1自身退火而形成的成環區域中存在能與內部引物FA退火的F2c。FA與此部分退火之后，啟動互補鏈合成(圖3-(8))。圖5顯示了與內部引物FA退火的環部分的位置關系。自與環退火的FA起的互補鏈合成置換了使用其自身為模板，自3’末端起始的互補鏈合成的產物，3’末端R1再次作好自身退火的準備(圖4-(9))。隨后的反應包括使用其自身3’末端為起點，其自身鏈為模板的互補鏈合成，以及使用環部分為起點和內部引物RA為起點的互補鏈合成的交替步驟。如上所述，核酸擴增反應包括使用其自身鏈為模板的重復3’末端延伸，以及新啟動的由與環部分退火的引物開始的延伸的交替步驟。
另一方面，關于所合成的，使用其自身鏈為模板，使用與其環部分退火的寡核苷酸為起點而延伸的，與單鏈核酸互補的核酸鏈，也在合成的核酸鏈上進行具有交替相連于單鏈上的互補核苷酸序列的核酸的合成。具體地說，例如，如圖4-(9)所示，自環部分起的互補鏈合成當到達R1時即告完成。然后，使用被核酸合成置換的3’末端作為起點，新啟動另一輪互補鏈合成(圖4-(9))。逐漸地，反應再次到達在先前的步驟中被用作合成起點以啟動置換的環部分。因此，自環部分啟動合成的核酸也被置換，結果，產生在鏈自身上退火的3’末端R1(圖4-(11))。該3’末端R1在與相同鏈上存在的R1c退火之后，啟動互補鏈合成。當該反應中的F為R，而R為F時，反應與圖3-(8)中所示的相同。因此，將圖4-(11)中所示的結構用作新核酸，繼續自我-延伸和另一輪核酸合成。
如上所述，根據本發明的方法，可連續提供能啟動另一輪延伸的核酸的反應與核酸的延長一起進行。由于鏈被進一步延伸，在鏈的末端和相同的鏈內都產生了多個成環序列。當這些成環序列通過包括鏈置換的合成反應作好堿基配對的準備時，內部引物與成環序列退火，并用作合成起點以產生新的核酸。通過聯合使用由鏈的內部區域起始的合成與自鏈末端起始的鏈合成，即可獲得更有效的擴增。
另外，通過在本發明中同時采用RA和FA作為檢驗引物，可以增加檢驗機制的檢驗頻率。或者，甚至當僅用使用RA為模板產生的3’末端來檢驗特定區域內的核苷酸序列時，也可通過檢驗特定區域內的核苷酸序列來進行互補鏈合成反應。結果，相對于特定區域具有推測的核苷酸序列的情況而言，特定區域不具有推測的核苷酸序列的互補鏈合成所產生產物的量大大減少。因此，本發明提供了檢測突變和/或多態性的方法，根據該原理，所述方法具有極好的S/N比率。
如上所述，通過使用具有特定結構的引物，即可完成伴隨新核酸合成的鏈延伸。另外，根據本發明，新產生的核酸自身延伸，導致新產生其它核酸。理論上，這一系列反應永無休止地持續，因此，可獲得極為有效的核酸擴增。另外，可在等溫的反應條件下進行本發明的方法。
當在本發明中將RA和FA用作內部引物時，重要的特征是僅當多個區域的相互位置保持不變時，才能進行這一系列的反應步驟。另外，在聯合使用外部引物的實施方案中，反應至少涉及到6個區域。由于這一特征，即可有效防止伴隨著非-特異性互補鏈合成的非-特異性合成。具體地說，該特征使甚至當發生了一些非-特異性反應時，產物用作隨后的擴增步驟的起始物質的可能性降低。
另外，可通過多個不同的區域控制反應過程這一事實給人們構建檢測系統提供了靈活性，所述系統能精確地分辨相似的核苷酸序列。檢測諸如人CYP2C19的基因的相似核苷酸序列之間的SNP是一項重要的任務。然而，通過根據常規的基因擴增技術，如PCR和其它已知的信號擴增技術，如Invader法進行單輪擴增反應，難以檢測到相似核苷酸序列中的細小突變。根據本發明，當多個區域含有推測的核苷酸序列并維持特定的位置關系時，可設計引物以確保進行廣泛地擴增。
因此，本發明可在例如定型HLA和血小板同種抗原或致病性微生物的過程中，用于檢測含有類似核苷酸序列的多個基因之間核苷酸序列的微小差異。測定基因型的基因的大多數部分是基因所共有的，基于一些區域內的突變模式進行定型。在這種分析中適于使用本發明的方法，在所述方法中，僅當多個區域的核苷酸序列與推測的相同時，才會產生一定量的擴增產物。
另外，基于本發明，通過聯合使用一種引物與另一種引物分析同一樣品的基因組DNA，可以清楚地分辨雜合子和純合子，其中前一種引物在特定區域的核苷酸序列與野生型的相同時可確保擴增所述核苷酸序列，而后一種引物能確保擴增與突變型相同的序列。具體地說，當僅通過任一種引物擴增樣品時，樣品是野生型或突變型的純合子。另一方面，當通過兩種引物進行擴增時，樣品是由突變型和野生型序列組成的雜合子。
另外，本發明也可用作一項分析參與藥物代謝的基因的技術，它可能對特制的藥物有用。在測定個體的藥物-敏感性時，參與藥物代謝的基因是至關重要的。據推測藥物對個體的活性差異是由基因核苷酸序列中的微小差異引起的，所述基因編碼參與藥物代謝的酶。人類基因組計劃揭示出標準的人類基因。該計劃成果的一項實際應用是分析參與藥物代謝的基因，這已成為人們主要的興趣。因此，本發明提供了一項在后基因組時代非常有用的技術。
本文所提及的描述現有技術的所有出版物都列入本文作為參考。
附圖簡述圖1描述了闡明本發明優選實施方案的反應原理(1)至(2)部分的示意圖。
圖2描述了闡明本發明優選實施方案的反應原理(3)至(5)部分的示意圖。
圖3描述了闡明本發明優選實施方案的反應原理(6)至(8)部分的示意圖。
圖4描述了闡明本發明優選實施方案的反應原理(9)至(11)部分的示意圖。
圖5描述了本發明的單鏈核酸中形成的環結構的示意圖。
圖6描述了屬于人CYP2C19家族的基因的核苷酸序列，所述序列彼此類似。
圖7描述了闡明在實施例中用于檢測SNP的靶核苷酸序列，和引物與靶核苷酸序列的位置關系的示意圖。
圖8描述了闡明本發明的突變檢測方法之結果的照片。每個泳道表示靶模板(特定區域具有推測的核苷酸序列)；具有單核苷酸錯配的模板(特定區域具有的核苷酸序列與推測的核苷酸序列有單核苷酸差異)；無模板(僅有用作對照的引物)。
圖9描述了闡明本發明的突變檢測方法所得結果的圖。此處，縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示反應時間(小時)。-■-無靶；-○-m1；和-●-WT。
圖10描述了闡明在實施例3中用于檢測SNP的靶核苷酸序列，和引物與靶核苷酸序列的位置關系的示意圖。
圖11描述了闡明本發明的突變檢測方法所得結果的圖。實驗組a)和b)分別闡明了通過使野生型(WT)的引物套和突變型(MUT)的引物套與各自的模板DNA反應所得的結果。此處，縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示反應時間(分鐘)。-●-野生型(WT)；-○-突變型(MUT)；和-▲-無DNA。
圖12描述了闡明本發明的突變檢測方法之結果的照片。每個泳道表示通過使各自的模板DNA與野生型(WT)的引物套和突變型(MUT)的引物套反應所得的產物。無DNA(不含模板DNA)；MUT DNA(以突變型的CYP2C19基因為模板)；和WT DNA(以野生型的CYP2C19基因為模板)。
圖13描述了闡明本發明的突變檢測方法之特異性的圖。實驗組a)和b)分別闡明了通過使野生型(WT)的引物套和突變型(MUT)的引物套與各自的模板DNA反應所得的結果。此處，縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示反應時間(分鐘)。-◆-無DNA；-▲-CYP2C9基因；-×-CYP2C18基因；-●-野生型(WT)CYP2C19；和-○-突變型(MUT)CYP2C19。
圖14描述了闡明在實施例5中用于檢測SNP的靶核苷酸序列，和引物與靶核苷酸序列的位置關系的示意圖。
圖15描述了闡明使用具環引物的本發明的突變檢測方法之結果的圖。實驗組a)和b)分別闡明了通過使野生型(WT)的引物套和突變型(MUT)的引物套與各自的模板DNA反應所得的結果。此處，縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示反應時間(分鐘)。-●-野生型(WT)；-○-突變型(MUT)；和-▲-無DNA。
圖16描述了闡明使用具環引物的本發明的突變檢測方法之特異性的圖。實驗組a)和b)分別闡明了通過使野生型(WT)的引物套和突變型(MUT)的引物套與各自的模板DNA反應所得的結果。此處，縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示反應時間(分鐘)。-◆-無DNA；-▲-CYP2C9基因；-×-CYP2C18基因；-●-野生型(WT)CYP2C19；和-○-突變型(MUT)CYP2C19。
圖17描述了闡明通過使用具環引物的本發明突變檢測方法檢測血液樣品中的突變的結果圖。10號樣品野生型純合子(WT/WT)；11號樣品野生型/突變型雜合子(WT/MUT)和8號樣品突變型純合子(MUT/MUT)。此處，縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示反應時間(分鐘)。-●-野生型(WT)引物；和-○-突變型(MUT)引物。
實施本發明的最佳模式下文將參照實施例詳細描述本發明。
實施例1.檢測人CYP2C19基因中的突變(1)通過PCR擴增人CYP2C19基因，并用識別SNP位點的限制性酶SmaI消化該基因，以將基因定型為野生型(WT)或具有單核苷酸突變的突變型(ml)。另外，將基于上述結果被測定為WT或m1的PCR產物克隆至pBluescript II的EcoRV位點。測定核苷酸序列以進一步證實SNP位點的核苷酸序列。野生型的核苷酸序列示于SEQ ID NO5。在ml中，SEQ ID NO5的核苷酸111處的殘基不是G而是A(圖7)。
然后，被設計用于根據本發明分辨人CYP2C19的WT和m1的引物含有下列核苷酸序列。靶核苷酸序列中各個引物的位置示于圖7。FA的5’末端含有待測的突變位點。因此，當靶核苷酸序列的區域中不含推測的核苷酸序列時，互補鏈合成反應受到抑制。
RA(R1+R2)/SEQ ID NO15’-GGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTGTGTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATC-3’外部引物R3/SEQ ID NO25’-AGGGTTGTTGATGTCCATC-3’FA(F1+F2)/SEQ ID NO35’-CGGGAAATAATCAATGATAGTGGGAAAATATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3’外部引物F3/SEQ ID NO45’-CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3’使用含有上述核苷酸序列的引物，并使用10-19mol/管(約60000個分子)已插入WT或m1的pBluescript II(已用EcoRI線性化)作為模板，60℃保溫2小時。使模板保持為雙鏈以進行反應。反應溶液的組成如下反應溶液的組成(25μL)20mM Tris-HCl pH8.810mMKCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO41M甜菜堿0.1％Triton X-1000.4mM dNTP8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)引物
1600nM FA1600nM RA200nM F3200nM R3在5μL上述反應溶液中加入5μL上樣緩沖液，然后，上樣于2％瓊脂糖凝膠(0.5％TBE)。在100V下電泳0.5小時。電泳后，用溴化乙錠(EtBr)染色凝膠以通過肉眼觀察核酸。結果示于圖8。當反應不含模板或含有含單核苷酸錯配的模板m1時，觀察不到擴增。然而，當將WT用作模板時，能檢測到擴增產物。由此證實本發明能清楚地分辨單核苷酸差異。
實施例2.檢測人CYP2C19基因中的突變(2)使用與實施例1中所用引物相同的引物進行本發明的突變檢測方法。反應溶液的組成與實施例1中的相同，不同的是將10-21mol/管(約600個分子)已插入WT或ml的pBluescript II(已用EcoRI線性化)用作靶核苷酸序列。在64℃進行保溫。在反應溶液中以終濃度為0.25μg/ml加入EtBr。用ABIPrism 7700(Perkin Elmer)監測反應6小時。
結果示于圖9。當反應中不使用模板，或使用含單核苷酸錯配的模板m1時，在6小時的反應過程中檢測不到擴增。當將WT用作模板時，隨著擴增反應的進行，熒光強度有所增強。由此證實本發明能清楚地分辨特定區域中的單核苷酸差異。另外，還闡明可以在等溫下進行基于本發明的突變檢測方法，此外，可用常規的熒光分析儀器監測反應。
實施例中使用的ABI Prism 7700原先是監測PCR的儀器。然而，本發明的檢測方法中不需要象PCR中那樣的熱循環；僅通過在等溫下保溫(64℃)即可完成反應。因此，可在具有溫箱的熒光分析儀器中進行根據此實施例的突變檢測方法。
實施例3.檢測人CYP2C19基因中的突變(3)進行下列實驗以評價本發明檢測核苷酸序列突變的方法的特異性。更具體地，分別設計對應于特定區域中的突變型和野生型推測核苷酸序列的引物，并使用引物進行本發明的突變檢測方法。下文列出了所制備的引物的核苷酸序列。使用人CYP2C19基因為模板，并使用擴增具有所需突變(MUT)之序列(突變型推測核苷酸序列)的引物套和擴增野生型(WT)序列(野生型推測核苷酸序列)的引物套，通過與實施例1和2相同的方法進行實驗。各個引物在靶核苷酸序列中的位置示于圖10。自FA和RA的5’末端起的第二個核苷酸對應于SNP位點。
檢測野生型的一套引物FA(F1+F2)/SEQ ID NO65’-CCGGGAAATAATCAATGTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3’RA(R1+R2)/SEQ ID NO75’-CGGGAACCCATAACTGTTCTTTTACTTTCTCC-3’檢測突變型的一套引物FA(F1+F2)/SEQ ID NO85’-CAGGAACCCATAACAAATTACTTAGTGTTCTTTTACTTTCTC-3’RA(R1+R2)/SEQ ID NO95’-CAGGAACCCATAACAAATGTGTTCTTTTACTTTCTCC-3’此實施例中使用的外部引物R3和F3分別由SEQ ID NO2和SEQ IDNO4的核苷酸序列組成(與實施例1中的相同)。
制備溶液，其中含有含上述核苷酸序列的引物，和用作模板的6000個分子/管已插入WT或m1的pBluescript II(已用EcoRI線性化)。95℃加熱溶液3分鐘，并與下列反應溶液混合。總體積為25μL。60℃保溫混合物3小時。反應溶液的組成如下反應溶液的組成(25μL)20mM Tris-HCl pH8.810mM (NH4)2SO410mM KCl3.5mMMgSO41M甜菜堿0.1％Triton X-1000.4mM dNTP8U Bst DNA聚合酶1600nM FA1600nM RA200nM F3
200nM R3在反應溶液中以終濃度為0.25μg/ml加入EtBr。用ABI Prism7700(Perkin Elmer)監測反應3小時。
結果示于圖11。另外，在反應完成之后，使用與實施例1中所用的相同的方法，對5μL上述反應溶液進行電泳；結果示于圖12。經證實僅當模板具有推測的核苷酸序列時，在3小時的反應過程中，野生型引物套或突變型引物套才能進行擴增。甚至當僅用6000個模板分子進行實驗時，約100分鐘后，擴增反應就到達平臺期。由此闡明本發明的檢測方法是高度敏感的。6000個DNA分子剛好對應于得自1μL血液的白血細胞基因組DNA的拷貝數。據估計，正常情況下成人的白血細胞數目為4000至8000個細胞。因此，白血細胞的平均數目為6000。由于大部分的血液DNA得自白血細胞，白血細胞的數目相當于血液中的DNA拷貝數。因此，如果用6000個DNA分子可以獲得分析結果，那么用1μL血液樣品即可完成基因分析。
另一方面，當模板的核苷酸序列與推測的核苷酸序列都不相同時，在3小時的反應過程中，用野生型或突變型引物套都檢測不到擴增。由此闡明本發明的突變檢測方法甚至用少量樣品也能獲得可信度較高的核苷酸序列檢驗機制。
實施例4.針對人p450CYP2C19基因的特異性通過實驗評價本發明檢測突變之方法的特異性，所述實驗使用了量大100倍的模板，該模板由與待檢測突變的模板相類似的核苷酸序列組成。使用與實施例3中相同的模板，人p450CYP2C 19基因檢測突變。將人p450CYP2C9基因和人p450CYP2C18基因用作模板，所述模板由類似于基因核苷酸序列的核苷酸序列組成。還將這些基因克隆至pBluescript II，通過與實施例1中相同的方法證實核苷酸序列。然后將基因用于此實驗。
在此實驗中，使用600,000個分子/管人p450CYP2C9基因或人p450CYP2C18基因替代6,000個分子/管人p450CYP2C19作為模板。其它實驗條件與實施例3中的相同。
結果示于圖13。當模板是6000個分子的CYP2C19WT DNA時，用野生型的引物套可以檢測到擴增。然而，當模板是600,000個分子的CYP2C9或CYP2C18基因時，用相同的引物套檢測不到擴增。類似地，當模板是6000個分子的CYP2C19MUT DNA時，用突變型的引物套可以檢測到擴增。但是，當模板是600,000個分子的CYP2C9或CYP2C18基因時，用相同的引物套檢測不到擴增。上文所述的結果表明根據本發明的突變檢測方法，可將一組含有彼此相似的核苷酸序列的基因中的感興趣的核苷酸序列與其它類似的核苷酸序列區分開，還可以清楚地檢測到突變。
從圖6中可以看出，p450CYP2C19，p450CYP2C9和p450CYP2C18的核苷酸序列彼此非常類似。根據常規的核苷酸序列檢測方法，幾乎不可能區分具有如此高的相似性的核苷酸序列并檢測所述核苷酸序列上的突變。
實施例5.用具環引物進行分析(1)-檢測人p450CYP2C19基因中的SNP-進行下列實驗以證實申請人發明的具環引物(2000年9月19日提交；日本專利申請2000-283862)對LAMP法的改良作用也適用于本發明的突變檢測方法。
首先，設計含有下述核苷酸序列的引物和具環引物。具環引物指的是存在于FA延伸產物上的F2和F1之間，用作互補鏈合成之起點的引物。對于RA而言情況類似，將存在于上述RA延伸產物上的R2和R1之間，用作互補鏈合成之起點的引物用作具環引物。具體地說，所用的具環引物含有下文所示的核苷酸序列。具環引物可與野生型(WT)引物套聯合使用，或與突變型(MUT)引物套聯合使用。各個引物在反應所用靶核苷酸序列中的位置示于圖14。與實施例3相同，自FA和RA的5’末端起的第二個核苷酸對應于SNP位點。
檢測野生型的一套引物FA(F1+F2)/SEQ ID NO105’-CCGGGAAATAATCTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3’RA(R1+R2)/SEQ ID NO115’-CGGGAACCCTGTTCTTTTACTTTCTCC-3’檢測突變型的一套引物FA(F1+F2)/SEQ ID NO125’-CTGGGAAATAATCATAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3’RA(R1+R2)/SEQ ID NO135’-CAGGAACCCATATGTTCTTTTACTTTCTCC-3’具環引物FL/SEQ ID NO14
5’-GATAGTGGGAAAATTATTGC-3’具環引物RL/SEQ ID NO155’-CAAATTACTTAAAAACCTTGCTT-3’外部引物R3由SEQ ID NO2的核苷酸序列組成，外部引物F3由SEQID NO4的核苷酸序列組成(與實施例1中的相同)。
95℃加熱溶液3分鐘，所述溶液含有上述引物套和具環引物中的任一種，以及用作模板的6000個分子/管已插入WT或m1的pBluescript II(已用EcoRI線性化)，將所述溶液與下列反應溶液混合至總體積為25μL。60℃保溫混合物3小時。反應溶液的組成如下反應溶液的組成(25μL)20mM Tris-HCl pH8.810mM (NH4)2SO410mM KCl4.0mMMgSO41M甜菜堿0.1％Triton X-1000.5mM dNTP8U Bst DNA聚合酶1600nM FA1600nM RA200nM F3200nM R3800nM FL800nM RL，和6000個分子/管模板DNA在反應溶液中以終濃度為0.25μg/ml加入EtBr。用ABI Prism7700(Perkin Elmer)監測反應1小時。結果示于圖15。
在不含具環引物的反應中，分別在用WT-型引物套和MUT-型引物套開始反應之后約70分鐘和約80分鐘，觀察到由擴增產物所致的有所增強的熒光信號(圖11)。而在含有具環引物的反應中，在用野生型或突變型引物套開始反應之后約20分鐘，檢測到由擴增產物所致的有所增強的熒光信號(圖15)。通過使用具環引物，反應速率有所提高。
另一方面，在檢測SNP時，證實不管使用具環引物與否，都通過區分單核苷酸差異來進行擴增反應。由此闡明使用具環引物能大大改善反應速率而不會犧牲特異性。
實施例6.用具環引物進行分析(2)-評價針對人p450CYP2C19基因的特異性-通過實驗來評價本發明的突變檢測方法的特異性，所述實驗使用具環引物和模板，所述模板含有的核苷酸序列類似于需檢測突變的模板的核苷酸序列，而量比用于檢測突變的模板要高100倍。在此實驗中，使用600,000個分子/管人p450CYP2C9基因和人p450CYP2C18基因的每一種替代6,000個分子/管人p450CYP2C19作為模板。其它反應條件與實施例5中的相同。
結果示于圖16。當將6000個分子的CYP2C19WT DNA用作模板時，用野生型的引物套可以檢測到擴增。然而，當將600,000個分子的CYP2C9或CYP2C 18基因用作模板時，用相同的引物套檢測不到擴增。類似地，當將6000個分子的CYP2C19MUT DNA用作模板時，用突變型的引物套可以檢測到擴增。但是，當將600,000個分子的CYP2C9或CYP2C18基因用作模板時，用相同的引物套檢測不到擴增。因此，甚至在根據本發明的突變檢測方法中使用具環引物時，該方法仍可將一組含有彼此相似的核苷酸序列的基因中存在的目標核苷酸序列與類似的核苷酸序列區分開，還可以清楚地檢測到目標突變。
實施例7.用血液樣品進行分析用QIAamp DNA Blood試劑盒(Qiagen)從收集自志愿者的血液樣品(35個樣品)中提取DNA。通過PCR從提取的DNA中擴增人p450CYP2C19基因的m1區域，所述PCR使用未審公開的日本專利申請(JP-A)No.Hei10-14585中所述的引物序列。根據Z-Taq所用的方法，使用Z-Taq聚合酶(Takara Shuzo)進行擴增。
通過PCR-RFLP分析所得的PCR產物。方法如下。首先，于37℃用限制性酶MspI消化3μL PCR產物3小時，并在4％瓊脂糖凝膠(AmplisizeAgarose，BIO-RAD)上電泳。電泳之后，用SYBR Green I(FMC)染色凝膠，觀察DNA帶的模式以定型m1區域。
通過本發明的突變檢測方法，分析所有樣品中野生型純合子(WT/WT)，野生型/突變型雜合子(WT/MUT)和突變型純合子(MUT/MUT)的各3個樣品，總共9個樣品的m1區域。測定所用9個樣品的PCR產物的核苷酸序列以證實使用PCR-RFLP進行定型所得的結果。根據實施例5中所述的方法進行本發明的突變檢測方法。所用樣品DNA的量理論上等于提取自1μL血液的DNA量。具體地說，將提取自7ml血液的DNA的1/7000等分試樣用作樣品DNA。
關于所有9個樣品，通過本發明的突變檢測方法獲得的結果與通過PCR-RFLP法所獲得的一致。圖17中顯示了9個樣品中的10號樣品(PCR-RFLP的檢測結果是WT/WT)，11號樣品(PCR-RFLP的檢測結果是WT/MUT)和8號樣品(PCR-RFLP的檢測結果是MUT/MUT)的反應結果。
僅當使用野生型(WT)引物套時，才會對野生型純合子(WT/WT)樣品發生擴增反應，用突變型(MUT)的引物檢測不到擴增。另一方面，當樣品是雜合子(WT/MUT)時，用兩個引物套，即野生型(WT)引物套和突變型(MUT)引物套都可以擴增基因。另外，只能用突變型(MUT)引物，不能用野生型(WT)引物擴增突變型(MUT)純合子(MUT/MUT)的樣品。這表明根據下文所述的由聯合使用野生型和突變型引物套所得反應結果得出的矩陣，可以方便地評價純合子/雜合子。
野生型突變型野生型純合子+ -突變型純合子- +雜合子 + -另外，通過測序進一步證實擴增的核酸具有CYP2C19基因的核苷酸序列。除CYP2C19基因外，得自血液的DNA樣品含有很多類似的序列，如CYP2C9和CYP2C18。只有身為靶基因的CYP2C19基因甚至在存在類似序列的情況下，都能被特異性擴增，在單輪擴增反應中即可檢測到單核苷酸差異。由此證實僅通過在單輪擴增反應中檢測擴增產物的存在或缺乏，即可進行很多具有類似序列的基因的的SNP定型。
工業實用性根據本發明，無論靶核苷酸序列是否與推測的核苷酸序列有所不同，都可以精確地評估靶核苷酸序列。本發明的方法可用于分析核酸內的突變和多態性。該方法基于簡單的酶反應。因此，實施該方法無需任何特別的儀器或反應組分，這使得該方法能在低成本下容易地進行。
另外，由于檢測本發明突變和多態性的方法包括含有擴增靶核苷酸序列的反應，使用所擴增的核酸產物的量為指標即可區分核苷酸序列的差異。因此，可以進行高度敏感和可再現的核苷酸序列分析。另外，在每一輪開始時檢驗靶核苷酸序列，然后再進行基于本發明所用反應原理的互補鏈合成。因此，甚至當錯誤的互補鏈被錯誤地合成時，這種錯誤的反應也不會影響到最終的分析結果。根據常規的基因擴增方法PCR，一旦合成錯誤的互補鏈，就不可能準確地評價結果。因此，PCR實際上不適用于這種類型的分析。在基于引物雜交的所有類型的核苷酸序列檢驗機制中，出現某些錯誤是無法避免的。本發明已取得了以下進步高S/N比率，使核酸互補鏈合成中錯誤的影響最小化，同時積累大量正確的反應產物而無任何錯誤。因此，本發明是先進的發明，首次建立了基于核酸擴增反應區分核苷酸序列的方法。
另外，本發明的特征是所有反應的過程在多個區域受控制，該特征有利于在存在具有類似核苷酸序列的多個基因時檢測核苷酸序列的微小差異。由于這一特征，根據本發明可以準確而方便地進行HLA和血小板同種抗原或致病性微生物的定型。另外，根據本發明也可以方便地檢測參與與藥物代謝有關的酶活性的SNP。
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<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9caggaaccca taacaaatgt gttcttttac tttctcc 37<210>10<211>42
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15caaattactt aaaaaccttg ctt 2權利要求
1.檢測靶核苷酸序列特定區域內的突變和/或多態性的方法，它包括以下步驟(1)在允許互補鏈合成的條件下保溫下列組分(a)至(e)，其中將第二和第一引物用作起點；(a)含有靶核苷酸序列的核酸樣品；(b)催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶；(c)第二引物，其中第二引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；(d)第一引物，其中第一引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；和(e)核苷酸底物；和(2)將利用靶核苷酸序列為模板的互補鏈合成反應所合成的產物的量與特定區域內突變和/或多態性的存在相聯系，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成。
2.權利要求1的方法，其中第二引物或第一引物的5’末端上排列的核苷酸序列都含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成。
3.權利要求1的方法，另外還包括下列組分(f)第三引物，其中第三引物用作互補鏈合成反應的起點，另外通過互補鏈合成翻譯替換了第一引物的延伸產物；和(g)第四引物，其中第四引物用作互補鏈合成反應的起點，另外將模板上第二引物退火區域的3’側用作起點。
4.權利要求1的方法，其中相同樣品中存在一種基因，該基因含有的核苷酸序列類似于靶核苷酸序列的核苷酸序列。
5.權利要求4的方法，其中基因是家族基因和/或假基因。
6.權利要求5的方法，其中家族基因和/或假基因是選自下列的任何基因細胞色素P450家族，人白細胞組織相容性抗原和血小板同種抗原。
7.權利要求1的方法，其中多態性是單核苷酸多態性。
8.權利要求1的方法，其中靶核苷酸序列選自以下任何致病性病毒或致病性微生物基因的核苷酸序列丙型肝炎病毒，流感病毒，瘧疾和幽門螺桿菌。
9.權利要求1的方法，其中在解鏈溫度調節劑的存在下進行步驟(1)的保溫。
10.權利要求9的方法，其中解鏈溫度調節劑是至少一種選自下列的化合物甜菜堿，脯氨酸和二甲基亞砜。
11.權利要求1的方法，其中核酸樣品為雙鏈。
12.權利要求1的方法，其中所述方法在核酸檢測器的存在下進行，以根據檢測器信號的變化檢測突變和/或多態性的存在。
13.權利要求1的方法，其中將源自與需檢測突變和/或多態性的生物體相同的生物體，且其序列經證實不包括突變和/或多態性的核苷酸序列用作內部標準，通過與使用該核苷酸序列為模板所得合成產物的量相比較，檢測突變和/或多態性的存在。
14.權利要求1的方法，另外還包括(h)第一種具環引物，其中第一種具環引物在第一引物延伸產物中的源自第一引物的區域和所述第一引物的任意區域之間提供互補鏈合成起點；和/或(i)第二種具環引物，其中第二種具環引物在第二引物延伸產物中的源自第二引物的區域和所述第二引物的任意區域之間提供互補鏈合成起點。
15.權利要求1的方法，當含有所述特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，在與特定區域或其互補鏈退火的過程中，自互補鏈3’末端起的第二至第四個核苷酸中出現錯配，所述互補鏈是使用排列在第一引物和/或第二引物5’末端的核苷酸序列為模板而合成的。
16.含有下列組分i)-iv)，用于檢測靶核苷酸序列中特定區域的突變和/或多態性的試劑盒，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用該5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成i)第二引物，其中第二引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它構成利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；ii)第一引物，其中第一引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有利用引物作為起點的互補鏈合成反應的產物上的區域；iii)催化包括鏈置換的互補鏈合成的DNA聚合酶；和iv)核苷酸底物。
17.權利要求16的試劑盒，另外還包括下列組分v)第三引物，其通過與模板上第一引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點；和vi)第四引物，其通過與模板上第二引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點。
18.權利要求16的試劑盒，另外還包括下列組分vii)擴增內部標準的第五引物，其中第五引物的3’末端與內部標準的一個靶核苷酸序列鏈的3’側區域退火，第五引物的5’側包括與含有互補鏈合成反應之產物的任意區域的核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述反應利用該引物為起點；和iix)擴增內部標準的第六引物，其中第六引物的3’末端與內部標準的一個靶核苷酸序列鏈的3’側區域退火，第六引物的5’側包括與含有互補鏈合成反應之產物的區域的核苷酸序列互補的核苷酸序列，其中所述反應利用該引物為起點。
19.權利要求18的試劑盒，另外還包括下列組分ix)第七引物，其通過與模板上第六引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點；和x)第八引物，其通過與模板上第六引物退火區域的3’側退火而用作互補鏈合成的起點。
20.檢測靶核苷酸序列特定區域內的突變和/或多態性的方法，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成，所述方法包括下列步驟a)將第一引物與靶核苷酸序列退火，以使用引物為起點，進行互補鏈合成反應，其中第一引物的3’末端與一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第一引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有互補鏈合成反應產物上的區域，所述合成反應利用該引物作為起點；b)使步驟a)中合成的第一引物延伸產物中與第二引物退火的區域處于能讓該區域與第二引物進行堿基配對的狀態，將它們退火以便使用第一引物延伸產物為模板合成互補鏈；其中第二引物的3’末端與另一條所述靶核苷酸序列鏈3’側的區域退火，第二引物的5’側包括與推測核苷酸序列互補的核苷酸序列，它含有互補鏈合成反應產物上的區域，所述合成反應利用該引物作為起點；c)使用第二引物的延伸產物自身為模板，通過使具有所述推測核苷酸序列的產物的3’末端與所述延伸產物中的第一引物退火，進行互補鏈合成；d)使用步驟c)中合成的互補鏈自身為模板，通過使步驟c)中合成的，具有所述推測核苷酸序列的互補鏈的3’末端與所述延伸產物中的第二引物退火，進行互補鏈合成；和e)將利用第二引物作起點所得的合成產物的量與特定區域內突變和/或多態性的存在相聯系。
21.權利要求20的方法，其中步驟b)包括通過置換將第一引物延伸產物轉變為單鏈的步驟，其中置換是使用第三引物為起點通過互補鏈合成反應而進行的，所述第三引物利用了與模板上的第一引物退火的區域的3’側。
22.權利要求20的方法，其中步驟c)包括通過置換將第二引物延伸產物轉變為單鏈的步驟，其中置換是使用第四引物為起點通過互補鏈合成反應而進行的，所述第四引物利用了與模板上的第二引物退火的區域的3’側。
23.權利要求20的方法，其中第二和第一引物的5’末端中的至少一個上所排列的核苷酸序列含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端上排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成，所述方法還包括下列步驟1)在權利要求20的方法中，通過使第一引物的3’末端與第二引物延伸產物內的推測核苷酸序列退火，形成能與所述3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對的成環區域，并使用其自身3’末端作為互補鏈合成的起點來進行步驟c)的互補鏈合成反應；2)使第一引物與成環區域退火，利用催化互補鏈合成的DNA聚合酶，使用第一引物為起點進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；3)使用與成環區域退火的引物為起點，通過互補鏈合成反應置換自其自身3’末端開始延伸的產物，以使3’末端和所述推測的核苷酸序列之間能再次發生堿基配對；4)通過置換互補鏈以形成單鏈核酸，所述互補鏈是使用成環區域為起點，通過使3’末端與所述推測的核苷酸序列退火作為互補鏈合成之起點，進行使用其自身為模板的互補鏈合成反應而合成的，其中3’末端處于步驟3)中所述的形成堿基對的狀態；5)通過使3’末端與所述第二引物的推測核苷酸序列退火，并通過互補鏈合成形成成環區域，該區域與第二引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對；6)使第二引物與成環區域退火，通過催化互補鏈合成的DNA聚合酶，使用第二引物為起點進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；7)重復步驟3)至6)；和8)在步驟7)之后和/或與步驟7)平行，檢測單鏈核酸的形成，其中重復連接靶核苷酸序列及其互補鏈，并使所形成核酸的量與突變和/或多態性相聯系。
24.權利要求23的方法，另外還包括下列步驟9)使用步驟4)中形成的單鏈核酸為模板，通過使其3’末端與所述第二引物的推測核苷酸序列退火，形成能與第二引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對的成環區域，并使用其自身的3’末端作為互補鏈合成的起點，以進行互補鏈合成反應；10)使第二引物與成環區域退火，所述區域是通過使3’末端與其自身的所述特定區域退火而形成的，使用第二引物為起點，通過催化互補鏈合成的DNA聚合酶進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；11)使用與成環區域退火的引物為起點，通過互補鏈合成反應置換自其自身3’末端開始延伸的產物，以使3’末端和所述推測的核苷酸序列之間能再次發生堿基配對；12)通過置換互補鏈以形成單鏈核酸，所述互補鏈是使用成環區域為起點，通過使3’末端與所述推測的核苷酸序列退火作為互補鏈合成之起點，進行使用其自身為模板的互補鏈合成反應而合成的，其中3’末端處于步驟11)中所述的能與所述推測的核苷酸序列形成堿基對的狀態；13)通過使3’末端與所述的推測核苷酸序列退火，并進行互補鏈合成形成成環區域，該區域與第一引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對；14)使第一引物與成環區域退火，通過催化互補鏈合成的DNA聚合酶，使用第一引物為起點進行互補鏈合成，所述互補鏈合成包括鏈置換；15)重復步驟11)至14)；和16)在步驟15)之后和/或與步驟15)平行，檢測單鏈核酸的形成，其中重復連接靶核苷酸序列及其互補鏈，并使所形成核酸的量與突變和/或多態性相聯系。
25.權利要求24的方法，另外還包括下列步驟17)通過使步驟12)中形成的單鏈核酸的3’末端與其自身的所述推測核酸序列退火，形成能與第一引物3’末端的互補核苷酸序列形成堿基對的成環區域，并使用其自身的3’末端作為起點，使用其自身作為模板以進行互補鏈合成反應。
26.權利要求20的方法，其中第二引物和第一引物的5’末端上排列的核苷酸序列都含有與所述特定區域的推測核苷酸序列或其互補鏈互補的核苷酸序列，其中當含有特定區域的核苷酸序列不是預想的核苷酸序列時，利用5’末端排列的核苷酸序列為模板而合成的，并通過與特定區域或其互補鏈退火而用作互補鏈合成之起點的互補鏈會抑制互補鏈合成。
全文摘要
本發明的方法基于這樣一種方法，其中利用作為相同鏈的核苷酸序列存在的靶核苷酸序列的特定區域上的，通過互補鏈合成而合成的雜交的3’末端作為下一輪互補鏈合成的起點來合成核酸。根據本發明，重復進行與需檢測突變和多態性的特定區域的雜交。因此，靶核苷酸序列中的突變和多態性被精確地拷貝到反應產物上。
文檔編號C12Q1/68GK1876843SQ200610080379
公開日2006年12月13日 申請日期2000年11月7日 優先權日1999年11月8日
發明者神田秀俊, 納富繼宣, 長嶺憲太郎, 米川俊廣 申請人:榮研化學株式會社