專利名稱：α－半乳糖苷酶基因、其編碼蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼糖苷酶的基因及其編碼的蛋白，尤其涉及一種從青霉(Penicillium sp.)中分離、克隆的編碼α-半乳糖苷酶的基因；本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的重組表達載體和含有本發(fā)明基因的宿主細胞以及它們的制備方法，此外，本發(fā)明還涉及重組α-半乳糖苷酶的制備以及該α-半乳糖苷酶的用途。
背景技術(shù)：
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)即蜜二糖酶，屬于外切糖苷酶類，能夠?qū)Ｒ簧呋擎湻沁€原末端α-半乳糖苷鍵的水解，它不僅能夠水解含α-半乳糖苷鍵的寡糖，而且還能夠催化含該鍵的多糖。棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖是豆類植物中廣泛存在的低聚寡糖，在α-半乳糖苷酶的作用下，這些寡糖可以被分解為D-半乳糖和其他相應(yīng)的單糖和寡糖。
α-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物、植物、動物和人體內(nèi)。在微生物中，細菌、放線菌、絲狀真菌、酵母等都能合成α-半乳糖苷酶。目前，已分離篩選出許多產(chǎn)α-半乳糖苷酶的微生物，如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、青霉、紅曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黃曲霉、啤酒酵母等等。微生物α-半乳糖苷酶有較高的產(chǎn)量，特別是絲狀真菌，每升培養(yǎng)基可以分泌30g蛋白質(zhì)，它們產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合適的酸堿度和良好的穩(wěn)定性從而最有利于技術(shù)應(yīng)用(den Herder I.F.，et al.Mol.Gen.Genet.233，404-410)。因此產(chǎn)α-半乳糖苷酶的真菌受到越來越廣泛的關(guān)注。
在制糖工業(yè)中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜黏度增加而阻礙蔗糖結(jié)晶析出，以致產(chǎn)生大量的廢糖蜜，使糖產(chǎn)量降低。應(yīng)用α-半乳糖苷酶處理廢糖蜜能將阻礙蔗糖結(jié)晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同時，還產(chǎn)生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得率(Ganter C.，et al.Journal of Biotechnology.8(4)301-310)。同時酶法制糖可使蔗糖的粒狀結(jié)晶的均勻性、色澤和純度得到改善。
在大豆及其制品中，含有1％的棉子糖、4％的水蘇糖和微量的毛蕊花糖。這些寡糖阻礙人類對豆類的消化吸收，能夠產(chǎn)生脹氣等疾病，而人胃腸道不分泌α-半乳糖苷酶，因此在豆制品中加入α-半乳糖苷酶，可以分解這些寡糖，增加人類對豆類營養(yǎng)的吸收(Prashanth S J and Mulimani V H.，Process Biochemistry.401199-1205)。
糾爾豆膠是一種食品，含有38-40％的α-半乳糖，半乳糖是以殘基形式連接于甘露糖為主鏈的甘露聚糖上。半乳糖側(cè)鏈的存在對半乳甘露聚糖的特性影響很大。α-D-半乳糖基側(cè)鏈的多少及位置，決定其在水中的溶解度和膠凝能力。糾爾豆膠與刺槐膠相比，其膠凝能力較弱，如用α-半乳糖苷酶來進行改性處理，適量除去側(cè)鏈的半乳糖殘基而不使甘露聚糖主鏈斷裂，可提高水溶性，也極大提高糾爾豆膠的膠凝能力，提高其商品性(Luonteri E.，et al.Enzyme Microb.Technol.22(3)，192-198)。
豆粕是非常優(yōu)秀的植物性蛋白質(zhì)飼料原料，一般在日糧中的用量為25～30％。但在豆粕中含有5～6％的單胃動物不能消化的α-半乳糖苷類的低聚寡糖，如棉子糖、水蘇糖等，這些寡糖一方面會引起動物的腸胃脹氣疾病，另一方面會增加食糜的粘度，從而降低了動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。而在豆科飼料中添加α-半乳糖苷酶能夠增加飼料中低聚寡糖的消化，減少此類低聚寡糖的抗營養(yǎng)作用，減輕或消除單胃動物的消化紊亂，從而提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率和代謝能(Ghazi S.，et al.British Poultry Science.44(3)410-418)?，F(xiàn)有的α-半乳糖苷酶對于大豆中的α-半乳糖苷類的低聚寡糖的分解能力尚差強人意，所以提供一種新的能夠有效分解大豆中的α-半乳糖苷類的低聚寡糖的α-半乳糖苷酶具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的α-半乳糖苷酶Agl1，該α-半乳糖苷酶能夠有效分解大豆中的α-半乳糖苷類的低聚寡糖，例如棉子糖、水蘇糖等。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種α-半乳糖苷酶Agl1，其含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物。
優(yōu)選的，本發(fā)明α-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；更優(yōu)選的，本發(fā)明α-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種編碼上述α-半乳糖苷酶的基因。
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種編碼α-半乳糖苷酶的基因，該基因具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；或(b)在嚴謹條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，且該核苷酸序列編碼具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。
優(yōu)選的，本發(fā)明編碼α-半乳糖苷酶的基因具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；本發(fā)明編碼α-半乳糖苷酶的基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是構(gòu)建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重組表達質(zhì)粒及獲取含有該重組表達載體的重組菌株。
本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將將SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使SEQ IDNO1所示的核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將SEQ ID NO1所示的核苷酸序列插入到質(zhì)粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOX1啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質(zhì)粒pPIC9-Agl1。
本發(fā)明所構(gòu)建的重組酵母表達質(zhì)?？赏ㄟ^常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述的宿主細胞可為畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母細胞(Saccharomycescerevisiae)或乳酸酵母細胞(Hansenula polymorpha)。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)GS115，得到重組菌株GS115/Agl1。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種制備所述的α-半乳糖苷酶的方法。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的優(yōu)選的，一種制備本發(fā)明α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟構(gòu)建含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的重組表達質(zhì)粒；培養(yǎng)用該重組表達質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α-半乳糖苷酶的表達，回收并純化所表達的α-半乳糖苷酶。
上述制備α-半乳糖苷酶的方法中，優(yōu)選的，所述的重組表達質(zhì)粒是pPIC9-Agl1；所述的宿主細胞是畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)GS115，所述的重組菌株為GS115/Agl1。
本文中，所述的“多個”通常意味著2～60個，優(yōu)選為2～15個，這些取決于α-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個或多個氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個或多個氨基酸殘基；所述的“嚴謹條件”是指雜交液為5～6×SSC，42～75℃雜交過夜，室溫至37℃用2×SSC洗滌一至兩次，優(yōu)選的，所述的“嚴謹條件”為雜交液為6×SSC，68℃雜交過夜，37℃用2×SSC洗滌兩次。
本發(fā)明整體技術(shù)方案的詳細描述1、α-半乳糖苷酶的分離純化和測序本發(fā)明首先通過超濾、FPLC等技術(shù)從青霉(Penicillium sp.)F63分離純化青霉電泳純的α-半乳糖苷酶；將所分離的電泳純的α-半乳糖苷酶利用ESI-MS/MS質(zhì)譜儀進行測序。
2、α-半乳糖苷酶基因的克隆提取青霉F63基因組DNA，根據(jù)內(nèi)肽序列設(shè)計簡并引物擴增α-半乳糖苷酶的部分核苷酸序列，再通過反向PCR克隆到編碼α-半乳糖苷酶基因全長。
3、α-半乳糖苷酶cDNA序列的獲得提取青霉菌絲體RNA，采用RT-PCR的方式擴增得到α-半乳糖苷酶的cDNA序列。
4、重組α-半乳糖苷酶的酶的制備將α-半乳糖苷酶基因連入真核表達載體pPIC9，獲得重組質(zhì)粒。利用電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。誘導(dǎo)畢赤酵母宿主菌表達外源基因，制備重組α-半乳糖苷酶。
5、重組α-半乳糖苷酶酶學性質(zhì)鑒定通過酶活測定檢測重組α-半乳糖苷酶的基本酶學性質(zhì)。


圖1純化的α-半乳糖苷酶Agl1的SDS-PAGE分析(A)和Native-PAGE分析(B)(5-14％梯度)。
(A)SDS-PAGE.1分子量標準；2純化的酶。
(B)Native gradient PAGE。1分子量標準；2純化的α-半乳糖苷酶(注箭頭所指的位置為純化的α-半乳糖苷酶)。
圖2嵌套反向PCR擴增產(chǎn)物電泳分析。
1.分子量標準；2-4.PCR產(chǎn)物。
圖3α-半乳糖苷酶cDNA擴增產(chǎn)物電泳分析。
1.分子量標準；2.NEGATIVE CK；3 Agl1 CDNA。
圖4 Agl1在畢赤酵母中表達的α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析。
1.分子量標準蛋白重量；2.GS115和質(zhì)粒pPIC9；3.甲醇誘導(dǎo)前的發(fā)酵上清；4-9所表達的重組α-半乳糖苷酶在不同誘導(dǎo)時間的發(fā)酵上清。
圖5重組α-半乳糖苷酶Agl-R的SDS-PAGE分析。
1.分子量標準；2.發(fā)酵培養(yǎng)上清；3.通過HiTrap Q Sepharose的重組α-半乳糖苷酶；4.純化的重組α-半乳糖苷酶。
圖6本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶的最適pH值。
圖7本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶pH穩(wěn)定性。
圖8本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶反應(yīng)溫度。
圖9本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性。
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式
試驗材料和試劑1、菌株及載體Penicillium F63(CGMCC No.1669；中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期2006年4月5日；北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學院微生物研究所)，畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。
2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。PNPGal、蜜二糖、棉子糖、水蘇糖及瓜爾豆均購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養(yǎng)基(1)青霉培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基1000mL馬鈴薯汁，10g葡萄糖，25g瓊脂。
(2)誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(0.4％K2HPO4，0.28％(wt/vol)(NH4)2SO4，0.12％(wt/vol)CaCl2，0.12％(wt/vol)尿素，0.12％(wt/vol)MgSO4，0.02％(wt/vol)甘露糖，0.02％(wt/vol)酵母提取物和3％(wt/vol)豆粕)(3)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。
說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。
實施例1青霉菌α-半乳糖苷酶的分離純化青霉(Penicillium)F63被接種在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達α-半乳糖苷酶。誘導(dǎo)7天后離心菌體獲得培養(yǎng)基上清，將培養(yǎng)基上清用20-95％的(NH4)2SO4沉淀，沉淀物重懸在20mM、pH8.0的Tris-HCl中，透析過夜。
透析后的樣品用超濾管濃縮。2mL的樣品上預(yù)先用20mM、pH8.0的Tris-HCl平衡的HiTrap Q Sepharose XL陰離子柱(Amersham Pharmacia Biotech)。用NaCl鹽梯度洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白，在0.3M的鹽梯度下，含有α-半乳糖苷酶組分的蛋白被洗脫下來。
500uL濃縮的含α-半乳糖苷酶組分的樣品上Sephacryl S-200 HR分子篩(Amersham Pharmacia Biotech)，分子篩用含0.3M NaCl的20mM、pH8.0的Tris-HCl溶液洗脫，收集僅含α-半乳糖苷酶的組分。
對純化過程中的離子交換層析，凝膠層析各步分別進行了酶活性測定及蛋白濃度測定，結(jié)果見表1。純化完成后，比活性從粗酶液的9.6U/mg提高到純酶的106.4U/mg，純化倍數(shù)為11倍，得率10.1％。SDS-PAGE結(jié)果表明，純化后的α-半乳糖苷酶蛋白僅有一條單一的條帶，分子量約為82kD(圖1)。
表1 α-半乳糖苷酶Agl1純化結(jié)果

注蛋白濃度用考馬斯亮蘭G250法測定。
實施例2α-半乳糖苷酶蛋白的測序。
將實施例1中分子篩純化后的α-半乳糖苷酶濃縮，SDS-PAGE電泳，電泳純的α-半乳糖苷酶單一條帶進行膠內(nèi)酶切。用質(zhì)譜儀對肽段進行測序，獲得6段內(nèi)肽，這6段內(nèi)肽的氨基酸序列分別為LFVLDDGWFK、QSEGYTVSEFQYK、VNPLVLTGDMWR、DNAGLGDWLPNP、LEGLDENALYK和PEVQDFLLK。經(jīng)序列比對后，發(fā)現(xiàn)其中有4段內(nèi)肽與已知的α-半乳糖苷酶有較高的同源性，另外兩端內(nèi)肽沒有找到與之同源的α-半乳糖苷酶序列。其中LFVLDDGWFK與黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、木霉、犁頭霉α-半乳糖苷酶的相應(yīng)肽段的同源性為100％、88％、100％和88％；QSEGYTVSEFQYK與黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、木霉α-半乳糖苷酶的相應(yīng)肽段的同源性為66％、66％和76％；VNPLVLTGDMWR與黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、木霉α-半乳糖苷酶的相應(yīng)肽段的同源性為58％、75％和75％；DNAGLGDWLPNP與黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、木霉、犁頭霉α-半乳糖苷酶的相應(yīng)肽段的同源性為91％、84％、83％和76％。沒有找到與另外兩段內(nèi)肽LEGLDENALYK和PEVQDFLLK同源的α-半乳糖苷酶序列。說明實施例1中從青霉(Penicillium)F63中分離、純化的α-半乳糖苷酶是一種新的α-半乳糖苷酶。
實施例3青霉菌α-半乳糖苷酶編碼基因Agl1的克隆提取青霉菌(Penicillium sp)F63基因組DNA取30℃培養(yǎng)7天后的青霉F63菌液60000rpm離心10min。取100mg菌絲體加500μL無菌水清洗，離心取沉淀。
沉淀重懸于500μL提取液混合液，于37℃溫育60min，10000rpm離心10min去沉淀。上清液用等體積酚、酚∶氯仿、氯仿依次抽提。取上層溶液加0.6-1倍體積的異丙醇常溫沉淀10min。12000rpm離心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍離心，將沉淀烘干后用30μL無菌水溶解，備用。
根據(jù)測序的α-半乳糖苷酶的內(nèi)肽序列設(shè)計合成簡并引物P1，P2(P15’-(T/C)T(A/G/C/T)GA(T/C)GA(T/C)GGCTGGTTT-3’；P25’-C(G/T)CCACAT(A/G)TC(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GT-3’)。以青霉菌F63總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃變性3min后冷卻至4℃；然后94℃變性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，32個循環(huán)后72℃保溫10min。得到一約800bp片段，將該片段回收后測序。
根據(jù)測序得到的核甘酸序列設(shè)計反向PCR引物P3，P4(P35’-GCCGGGGCTCATTGCTCTCGC-3’；P45’-CGTCTGGGAACCGCTCAGGG-3’)。用限制性內(nèi)切酶SalI酶切青霉F63基因組DNA，然后用T4DNA連接酶使酶切片段自身環(huán)化，以此自身環(huán)化的DNA片段作為PCR反應(yīng)的模板進行反向PCR擴增。通過反向PCR得到一個長3200bp的基因片段(圖2)。擴增得到產(chǎn)物回收后測序。
實施例4α-半乳糖苷酶基因的RT-PCR分析提取青霉菌菌絲體的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的一條鏈，然后設(shè)計引物(Prgal1，5’-AAAGGTATGTATTTCCCGG-3’；Prgal2，5’-CTATTGCTTTTCCAACATCA-3’)擴增該單鏈cDNA，獲得α-半乳糖苷酶的cDNA序列(圖3)，擴增得到產(chǎn)物回收后測序。
通過比較α-半乳糖苷酶的基因組序列和cDNA序列后發(fā)現(xiàn)該基因沒有內(nèi)含子，GTG為其翻譯起始密碼子。該基因為2205bp，編碼一個含有714個氨基酸的成熟α-半乳糖苷酶，以及一個含有21個氨基酸的信號肽。其中，SEQ ID NO1所示的核苷酸序列為編碼本發(fā)明α-半乳糖苷酶的cDNA序列；SEQ ID NO2所示的氨基酸序列為本發(fā)明成熟α-半乳糖苷酶的氨基酸序列；SEQ ID NO3所示的核苷酸序列為編碼本發(fā)明α-半乳糖苷酶的DNA序列；SEQ ID NO4所示的核苷酸序列為編碼本發(fā)明α-半乳糖苷酶信號肽的核苷酸序列；SEQ ID NO5所示的氨基酸序列為本發(fā)明α-半乳糖苷酶的氨基酸序列；SEQ ID NO6所示的氨基酸序列為本發(fā)明α-半乳糖苷酶信號肽的氨基酸序列。所測出的基因Agl1的成熟蛋白部分核甘酸序列與GeneBank上的α-半乳糖苷酶基因序列進行同源比較，最高同源性為69％，氨基酸序列最高同源性也為69.5％，證明從青霉菌(Penicillium sp)F63中分離克隆得到的編碼α-半乳糖苷酶的基因為新基因。
實施例5重組α-半乳糖苷酶的制備。
將表達載體pPIC9進行雙酶切(SnaBI+NotI)，同時將編碼α-半乳糖苷酶的基因Agl1(SEQ ID NO1)雙酶切(SnaBI+NotI)，切出編碼成熟α-半乳糖苷酶的基因片段與表達載體pPIC9連接，獲得含有青霉菌α-半乳糖苷酶基因Agl1的重組質(zhì)粒pPIC-Agl1并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/Agl1。
取含有重組質(zhì)粒的GS115菌株，接種于200mL YPD培養(yǎng)液中，30℃250rpm振然過夜培養(yǎng)，然后接種于發(fā)酵基本培養(yǎng)基于3L發(fā)酵罐中發(fā)酵。經(jīng)過基礎(chǔ)培養(yǎng)、碳源飼喂和誘導(dǎo)培養(yǎng)三個階段共156h，重組α-半乳糖苷酶的表達量達到111U/mL。SDS-PAGE結(jié)果(圖4)表明，重組α-半乳糖苷酶在畢赤酵母中得到了表達。所表達的α-半乳糖苷酶經(jīng)過HiTrap Q Sepharose FPLC之后，其蛋白質(zhì)的含量達到總蛋白的90％以上(圖5)，說明本純化方法是高效的。
實施例6重組α-半乳糖苷酶的活性分析。
比色法將PNPGal溶于0.1M乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中，使其終濃度為20mM。將10uL酶液，90uL的去離子水和100uL20mM的PNPGal混合，搖勻。37℃溫育5min后，反應(yīng)液中加入2.8mL1M的Na2CO3溶液來終止反應(yīng)。在405nm處測其OD值，并計算酶活。酶活(U/mL)單位定義在pH4.5、37℃下每分鐘分解PNPGal釋放1μmol p-硝基酚所需的酶量被定義為一個酶活單位。
實施例7重組α-半乳糖苷酶Agl1的最適pH及pH穩(wěn)定性測定將實施例5純化的重組α-半乳糖苷酶Agl1在不同的pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。所用緩沖液為pH3.0～7.5的乙酸-磷酸氫二鈉系列緩沖液及pH8.0～9.0Tris-HCl系列緩沖液。純化的重組α-半乳糖苷酶Agl1在不同pH的緩沖體系，37℃下測定的pH適性結(jié)果表明(圖6)重組α-半乳糖苷酶Agl1的最適pH為5.0，在pH4.2～7.0范圍內(nèi)，酶活性維持在75％以上，而在pH3.0以下，基本檢測不到酶活性。
將酶液在不同pH值的緩沖液中于常溫下處理12h，再測定酶活性以研究酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明，本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶在pH5.0～6.5之間保持最適pH下酶活的75％以上(圖7)，說明本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶在pH5.0～6.5有較好的穩(wěn)定性。
實施例8重組α-半乳糖苷酶Agl1酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性最適溫度的測定在乙酸-磷酸氫二鈉(pH5.0)緩沖體系及不同溫度下進行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果表明，重組α-半乳糖苷酶Agl1最適溫度為45℃。在37℃～48℃范圍內(nèi)，酶活性維持在75％以上(圖8)。
酶的熱穩(wěn)定性試驗表明，在40℃下保溫60min，剩余酶活性為61.1％。45℃下保溫10min，剩余酶活性為8.4％。50℃保溫2min，剩余酶活性為15.4％(圖9)。試驗結(jié)果說明，本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶在40℃以下是穩(wěn)定的。
實施例9不同化學試劑對α-半乳糖苷酶Agl1酶活性的影響試驗在酶促反應(yīng)體系中加入不同的化學試劑(終濃度為1mmol/L)，研究不同化學試劑對酶活性的影響。結(jié)果表明，只有Hg2+完全抑制本發(fā)明α-半乳糖苷酶活性，SDS、Cu2+對本發(fā)明α-半乳糖苷酶Agl1有明顯的抑制作用。其余化學試劑對本發(fā)明α-半乳糖苷酶Agl1的酶促反應(yīng)無顯著影響(表2)。
表2各種金屬離子和化學試劑對α-半乳糖苷酶活性的影響

實施例10本發(fā)明α-半乳糖苷酶Agl1的底物特異性試驗將蜜二糖、棉子糖和水蘇糖用乙酸-磷酸氫二鈉(pH5.0)緩沖液溶解，濃度為1.0mg/mL。而瓜兒豆膠的濃度為3.0mg/mL。在酶反應(yīng)最適溫度和最適pH值下，用離子色譜CARBOPAC PA10測定實施例5所純化的重組α-半乳糖苷酶對不同底物的作用。結(jié)果表明，本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶Agl1對瓜兒豆膠沒有活性。酶對底物的降解次序為蜜二糖(80.7％)＞棉子糖(67.5％)＞水蘇糖(64.8％)(表3)。
表3α-半乳糖苷酶Agl1對不同底物的作用

試驗結(jié)果表明，本發(fā)明α-半乳糖苷酶能夠有效的將蜜二糖、棉子糖或水蘇糖酶解為D-半乳糖。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所<120>α-半乳糖苷酶基因、其編碼蛋白及其制備方法和應(yīng)用<130>p0897<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2142<212>DNA<213>Penicillium sp.
<220>
<221>CDS<222>(1)..(2142)<400>1gcg gat aat act ctc ttt gct ctc aat gga gaa aat gtt tcg tac cgc 48Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ala Leu Asn Gly Glu Asn Val Ser Tyr Arg1 5 10 15atc cat gtg gac aac acc act ggt gat ctc cta gga gac cat ttc ggc 96Ile His Val Asp Asn Thr Thr Gly Asp Leu Leu Gly Asp His Phe Gly20 25 30ggc tcc gtc gga gct aat atc cct ctg gag act gta ggc gag gtc aat144Gly Ser Val Gly Ala Asn Ile Pro Leu Glu Thr Val Gly Glu Val Asn35 40 45ggc tgg agt agt cat ata gga cgt gtg cgc cgc gag ttc cca gac caa192Gly Trp Ser Ser His Ile Gly Arg Val Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln50 55 60ggc cga ggg gat ttc cgg acc cct gcg att cgc att cgt cag tca gaa240Gly Arg Gly Asp Phe Arg Thr Pro Ala Ile Arg Ile Arg Gln Ser Glu65 70 75 80ggg tat acc gta tct gaa ttc cag tac aaa tcg cac aag atc atc gcc288Gly Tyr Thr Val Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Ser His Lys Ile Ile Ala85 90 95ggc aag ccc gct ctg cct ggg ttg cca gcc acg aca ggc aca gaa gag336Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Thr Gly Thr Glu Glu100 105 110gat gtt agc act ttg atc atc agt ctg tat gac aag tac agc gat gtg384Asp Val Ser Thr Leu Ile Ile Ser Leu Tyr Asp Lys Tyr Ser Asp Val115 120 125gct gca gac ctc tcc tac tca att ttc cct aag cac gat gcc att gtg432Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys His Asp Ala Ile Val130 135 140cgc agc gtg aat gtt acg aat cac gga gag gca aac atc aca atc gag480Arg Ser Val Asn Val Thr Asn His Gly Glu Ala Asn Ile Thr Ile Glu145 150 155 160tct ctg gcc agt ctg agc gtg gat ttg ccg ttt gag gaa ctg gac atg528Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Leu Pro Phe Glu Glu Leu Asp Met165 170 175atc agt ctt cgt gga gac tgg gcg agg gaa gcg cac cgc gag agg aaa576Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala His Arg Glu Arg Lys180 185 190agg gtc acg tac ggt acc caa ggc ttt gga agt tcc aat ggg tac tcc624Arg Val Thr Tyr Gly Thr Gln Gly Phe Gly Ser Ser Asn Gly Tyr Ser195 200 205
序列表tct cac ctc cac aat cct ttc ctg gcg ttg gca gat ccc tct gcc acc672Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Ala Asp Pro Ser Ala Thr210 215 220gag tcc caa gga gag gta tgg gga ttc tcg ctt gtg tac aca ggt tca720Glu Ser Gln Gly Glu Val Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser225 230 235 240ttc tcc gtg gag gtc gag aag ggt tca cag ggt ttc acg cgt gcc ctt768Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Thr Arg Ala Leu245 250 255ctg ggt ttc aac cct ggt cag ctt tcg tgg act ttg ccg cca ggt gag816Leu Gly Phe Asn Pro Gly Gln Leu Ser Trp Thr Leu Pro Pro Gly Glu260 265 270act ctt act tcc ccg gaa tgt gtc tcg gta tac tcc cgg gat ggc atc864Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr Ser Arg Asp Gly Ile275 280 285ggc gga atg tca cgc tcg ctg cat cgc ttg tac cgc aac cat ctc atc912Gly Gly Met Ser Arg Ser Leu His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile290 295 300aag agc aag ttt gct acc agt gat cgt cct acg ttg ctg aac aat tgg960Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Thr Leu Leu Asn Ser Trp305 310 315 320gaa gga ctg tat ttc gat tac aac cag agc agt atc tac gag ctg gca 1008Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser Ile Tyr Glu Leu Ala325 330 335aag gga gcc gcc gaa gta ggc gct aag ctc ttc gtt ctg gat gac ggc 1056Lys Gly Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly340 345 350tgg ttc ggc aag gaa tac cca cgt ctc tct gac aat gcc ggg ctg ggc 1104Trp Phe Gly Lys Glu Tyr Pro Arg Leu Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly355 360 365gac tgg atc cca aac cct gag cgg ttc cca gac ggc ctg gag ccg ctt 1152Asp Trp Ile Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asp Gly Leu Glu Pro Leu370 375 380gtg aaa aag atc acg gac ctc aaa gcc gct aac acg tca aca aac atg 1200Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ala Asn Thr Ser Thr Asn Met385 390 395 400cgc ttt ggt atc tgg ttc gag ccg gaa atg gtc aat ccg aac tcg act 1248Arg Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Thr405 410 415ctg tat aac gag cac ccg gac tgg gcc cta cat gca gga ccc tac cct 1296Leu Tyr Asn Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro420 425 430cgc acc gaa aga cgc agc cag ctc gta ttg aac ctc gct ctt cct gaa 1344Arg Thr Glu Arg Arg Ser Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu435 440 445gtc csa gac ttc atc atc aag tcc gtc tca gat att ctc aag agt gca 1392Val Gln Asp Phe Ile Ile Lys Ser Val Ser Asp Ile Leu Lys Ser Ala450 455 460gat att agt tac gtc aag tgg gat aac aac agg ggc att cac gag acg 1440Asp Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Ile His Glu Thr465 470 475 480cct tcg cca gcc aca agc cac gcc tac atg ctc ggt ctg tac cgc gtt 1488Pro Ser Pro Ala Thr Ser His Ala Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val485 490 495ttc gag gaa ctg aca acc caa ttc ccc gat gtc ctc tgg gag ggt tgc 1536Phe Glu Glu Leu Thr Thr Gln Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys500 505 510
序列表gcg tcg ggt gga ggc cgt ttc gac cca ggt gtt ctc cag tat ttc ccg1584Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro515 520 525cag atc tgg aca tcg gac aac aca gac gca atc gat cgc atc acc atc1632Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Asp Arg Ile Thr Ile530 535 540cag ctt ggc act tcg ctc gcc tac ccg cct agc gcg atg ggt gct cac1680Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His545 550 555 560ctg tcc caa gtg ccg aac cac cag act ggc cgt aca gtc ccc gtg gct1728Leu Ser Gln Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Val Ala565 570 575gtc cgc gga cat gtc gcg atg atg ggc ggc tcg ttt ggc ttg gaa ctc1776Val Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu580 585 590gat ccc gct gca atg gac gct gat gac aag gca gct atg ccg ggg ctc1824Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Asp Asp Lys Ala Ala Met Pro Gly Leu595 600 605att gct ctc gct gag aag gta aat ccc att gtt ctt act ggt gat atg1872Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Val Leu Thr Gly Asp Met610 615 620tgg cga ttg aac ctt ccg gag gac tcg aat tgg cct gct gtt ttg ttc1920Trp Arg Leu Asn Leu Pro Glu Asp Ser Asn Trp Pro Ala Val Leu Phe625 630 635 640atc gcc gag gat ggt cag aag gct gtg ttg ttt gtc ttc cag ctc gct1968Ile Ala Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Leu Phe Val Phe Gln Leu Ala645 650 655cca aat gtc gat cat tca tgg ccc cgc gtt agg ttg gag gga ttg gat2016Pro Asn Val Asp His Ser Trp Pro Arg Val Arg Leu Glu Gly Leu Asp660 665 670gag aat gct tta tat aag att gat gat ggt gtg gtt tac tct ggt gga2064Glu Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Asp Asp Gly Val Val Tyr Ser Gly Gly675 680 685acc ttg atg aat atc ggt ctg caa ttc ccc ttt aag ggt gac tat ggc2112Thr Leu Met Asn Ile Gly Leu Gln Phe Pro Phe Lys Gly Asp Tyr Gly690 695 700agt caa gtt gtg atg ttg gaa aag caa tag2142Ser Gln Val Val Met Leu Glu Lys Gln705 710<210>2<211>713<212>PRT<213>Penicillium sp.
<400>2Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ala Leu Asn Gly Glu Asn Val Ser Tyr Arg1 5 10 15Ile His Val Asp Asn Thr Thr Gly Asp Leu Leu Gly Asp His Phe Gly20 25 30Gly Ser Val Gly Ala Asn Ile Pro Leu Glu Thr Val Gly Glu Val Asn35 40 45Gly Trp Ser Ser His Ile Gly Arg Val Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln50 55 60
序列表Gly Arg Gly Asp Phe Arg Thr Pro Ala Ile Arg Ile Arg Gln Ser Glu65 70 75 80Gly Tyr Thr Val Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Ser His Lys Ile Ile Ala85 90 95Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Thr Gly Thr Glu Glu100 105 110Asp Val Ser Thr Leu Ile Ile Ser Leu Tyr Asp Lys Tyr Ser Asp Val115 120 125Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys His Asp Ala Ile Val130 135 140Arg Ser Val Asn Val Thr Asn His Gly Glu Ala Asn Ile Thr Ile Glu145 150 155 160Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Leu Pro Phe Glu Glu Leu Asp Met165 170 175Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala His Arg Glu Arg Lys180 185 190Arg Val Thr Tyr Gly Thr Gln Gly Phe Gly Ser Ser Asn Gly Tyr Ser195 200 205Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Ala Asp Pro Ser Ala Thr210 215 220Glu Ser Gln Gly Glu Val Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser225 230 235 240Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Thr Arg Ala Leu245 250 255Leu Gly Phe Asn Pro Gly Gln Leu Ser Trp Thr Leu Pro Pro Gly Glu260 265 270Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr Ser Arg Asp Gly Ile275 280 285Gly Gly Met Ser Arg Ser Leu His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile290 295 300Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Thr Leu Leu Asn Ser Trp305 310 315 320Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser Ile Tyr Glu Leu Ala325 330 335Lys Gly Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly340 345 350Trp Phe Gly Lys Glu Tyr Pro Arg Leu Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly
序列表355 360 365Asp Trp Ile Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asp Gly Leu Glu Pro Leu370 375 380Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ala Asn Thr Ser Thr Asn Met385 390 395 400Arg Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Thr405 410 415Leu Tyr Asn Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro420 425 430Arg Thr Glu Arg Arg Ser Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu435 440 445Val Gln Asp Phe Ile Ile Lys Ser Val Ser Asp Ile Leu Lys Ser Ala450 455 460Asp Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Ile His Glu Thr465 470 475 480Pro Ser Pro Ala Thr Ser His Ala Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val485 490 495Phe Glu Glu Leu Thr Thr Gln Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys500 505 510Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro515 520 525Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Asp Arg Ile Thr Ile530 535 540Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His545 550 555 560Leu Ser Gln Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Val Ala565 570 575Val Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu580 585 590Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Asp Asp Lys Ala Ala Met Pro Gly Leu595 600 605Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Val Leu Thr Gly Asp Met610 615 620Trp Arg Leu Asn Leu Pro Glu Asp Ser Asn Trp Pro Ala Val Leu Phe625 630 635 640Ile Ala Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Leu Phe Val Phe Gln Leu Ala645 650 655
序列表Pro Asn Val Asp His Ser Trp Pro Arg Val Arg Leu Glu Gly Leu Asp660 665 670Glu Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Asp Asp Gly Val Val Tyr Ser Gly Gly675 680 685Thr Leu Met Asn Ile Gly Leu Gln Phe Pro Phe Lys Gly Asp Tyr Gly690 695 700Ser Gln Val Val Met Leu Glu Lys Gln705 710<210>3<211>3216<212>DNA<213>Penicillium sp.
<400>3gtcgacgtca ctaacatatg agttcgggat ctgttgggcc ggggtatgac tggcttaccg60acatgtcgca caggcctttg ctggtctcat tattcccaaa gagaaaagga ccacttgtta 120aagcattggc aaattggagg agttaagcag actgtgtcgg gattgaaaga agcaaaagcc 180aatgagcgaa gttcaaaccc gcccgcgaca cggagtatcc ccggagtttc ctccgcattt 240tcgactccac agttataaac cccaacatat gtagtagtat atacttccaa gtatcgccga 300agttggtttt tggatccgca tttcaagagc catagttcag cagactcgta gaagtctgtt 360cttggcaatt gagacccatt tctacgtgat tgagatctac ataggtcgag ccaaccttgg 420aatacctgca tgtaatctcc ccacaagtcg gggaaaagac gtcggggtaa aagatataaa 480aaggtatgta tttcccgggg ttgggatttg aattctatca aaaacacggc aaaaatggtt 540tacttatcaa ggggtgttgc agtggctaca tgcctagggc tacttgcaca ttcctccgct 600attatggcta aggaattaac cactaagcgt gagtcctttg cttctgtctt ttatagtttc 660aaatctaacc atatatccta tagcaatcgc ggcggatggt actctctttg ctctcaatgg 720agaaaatgtt tcgtaccgca tccatgtgga caacaccact ggtgatctcc taggagacca 780tttcggcggc tccgtcggag ctaatatccc tctggagact gtaggcgagg tcaatggctg 840gagtagtcat ataggacgtg tgcgccgcga gttcccagac caaggccgag gggatttccg 900gacccctgcg attcgcattc gtcagtcaga aaggtatacc gtatctgaat tccagtacaa 960atcgcacaag atcatcgccg gcaagcccgc tctgcctggg ttgccagcca cgacaggcac 1020agaagaggat gttagcactt tgatcatcag tctgtatgac aagtacagcg atgtggctgc 1080agacctctcc tactcaattt tccctaagca cgatgccatt gtgcgcagcg tgaatgttac 1140gaatcacgga gaggcaaaca tcacaatcga gtctctggcc agtctgagcg tggatttgcc 1200gtttgaggaa ctggacatga tcagtcttcg tggagactgg gcgagggaag cgcaccgcga 1260gaggaaaagg gtcacgtacg gtacccaagg ctttggaagt tccaatgggt actcctctca 1320cctccacaat cctttcctgg cgttggcaga tccctctgcc accgagtccc aaggagaggt 1380atggggattc tcgcttgtgt acacaggttc attctccgtg gaggtcgaga agggttcaca 1440gggtttcacg cgtgcccttc tgggtttcaa ccctggtcag ctttcgtgga ctttgccgcc 1500aggtgagact cttacttccc cggaatgtgt ctcggtatac tcccgggatg gcatcggcgg 1560aatgtcacgc tcgctgcatc gcttgtaccg caaccatctc atcaagagca agtttgctac 1620
序列表cagtgatcgt cctacgttgc tgaacagttg ggaaggactg tatttcgatt acaaccagag 1680cagtatctac gagctggcaa agggagccgc cgaagtaggc gctaagctct tcgttctgga 1740tgacggctgg ttcggcaagg aatacccacg tctctctgac aatgccgggc tgggcgactg 1800gatcccaaac cctgagcggt tcccagacgg cctggagccg cttgtgaaaa agatcacgga 1860cctcaaagcc gctaacacgt caacaaacat gcgctttggt atctggttcg agccggaaat 1920ggtcaatccg aactcgactc tgtataacga gcacccggac tgggccctac atgcaggacc 1980ctaccctcgc accgaaagac gcagccagct cgtattgaac ctcgctcttc ctgaagtcca 2040agacttcatc atcaagtccg tctcagatat tctcaagagt gcagatatta gttacgtcaa 2100gtgggataac aacaggggca ttcacgagac gccttcgcca gccacaagcc acgcctacat 2160gctcggtctg taccgcgttt tcgaggaact gacaacccaa ttccccgatg tcctctggga 2220gggttgcgcg tcgggtggag gccgtttcga cccaggtgtt ctccagtatt tcccgcagat 2280ctggacatcg gacaacacag acgcaatcga tcgcatcacc atccagcttg gcacttcgct 2340cgcctacccg cctagcgcga tgggtgctca cctgtcccaa gtgccgaacc accagactgg 2400ccgtacagtc cccgtggctg tccgcggaca tgtcgcgatg atgggcggct cgtttggctt 2460ggaactcgat cccgctgcaa tggacgctga tgacaaggca gctatgccgg ggctcattgc 2520tctcgctgag aaggtaaatc ccattgttct tactggtgat atgtggcgat tgaaccttcc 2580ggaggactcg aattggcctg ctgttttgtt catcgccagg gatggtcaga aggctgtgtt 2640gtttgtcttc cagctcgctc caaatgtcga tcattcatgg ccccgcgtta ggttggaggg 2700attggatgag aatgctttat ataagattga tgatggtgtg gtttactctg gtggaacctt 2760gatgaatatc ggtctgcaat tcccctttaa gggtgactat ggcagtcaag ttgtgatgtt 2820ggaaaagcaa tagagaggac ttgcaatatc ggctcaatag ttatatttga gcggcaacgg 2880ttgtgagcag tcatgctatt tcataggatt cgacaagtta agaaccaaat atcaacattc 2940caagattgct gaataatgag ataatatatt tgcaagaggg atatccaatt caagactgtt 3000tgtaaactca tgttggcctt ccaaggttga tgatcttagt attattctgc cggacgaaaa 3060aaacccgctt atcgataagc tcgccttctc taatcccctc cgactctgac tccttccagc 3120ctctaattta ttcttaacga actattcaac atggcagatg cagacgagga cgctattcgc 3180gcccctgaaa atgcctctgc acagcccgag gtcgac3216<210>4<211>63<212>DNA<213>Penicillium sp.
<400>4gtgagtcctt tgcttctgtc ttttatagtt tcaaatctaa ccatatatcc tatagcaatc 60gcg 63<210>5<211>234<212>PRT<213>Penicillium sp.
<400>5Val Ser Pro Leu Leu Leu Ser Phe Ile Val Ser Asn Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15
序列表Pro Ile Ala Ile Ala Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ala Leu Asn Gly Glu20 25 30Asn Val Ser Tyr Arg Ile His Val Asp Asn Thr Thr Gly Asp Leu Leu35 40 45Gly Asp His Phe Gly Gly Ser Val Gly Ala Asn Ile Pro Leu Glu Thr50 55 60Val Gly Glu Val Asn Gly Trp Ser Ser His Ile Gly Arg Val Arg Arg65 70 75 80Glu Phe Pro Asp Gln Gly Arg Gly Asp Phe Arg Thr Pro Ala Ile Arg85 90 95Ile Arg Gln Ser Glu Gly Tyr Thr Val Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Ser100 105 110His Lys Ile Ile Ala Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr115 120 125Thr Gly Thr Glu Glu Asp Val Ser Thr Leu Ile Ile Ser Leu Tyr Asp130 135 140Lys Tyr Ser Asp Val Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys145 150 155 160His Asp Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Thr Asn His Gly Glu Ala165 170 175Asn Ile Thr Ile Glu Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Leu Pro Phe180 185 190Glu Glu Leu Asp Met Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala195 200 205His Arg Glu Arg Lys Arg Val Thr Tyr Gly Thr Gln Gly Phe Gly Ser210 215 220Ser Asn Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Ala225 230 235 240Asp Pro Ser Ala Thr Glu Ser Gln Gly Glu Val Trp Gly Phe Ser Leu245 250 255Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly260 265 270Phe Thr Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Gly Gln Leu Ser Trp Thr275 280 285Leu Pro Pro Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr290 295 300Ser Arg Asp Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Ser Leu His Arg Leu Tyr
序列表305 310 315 320Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Thr325 330 335Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser340 345 350Ile Tyr Glu Leu Ala Lys Gly Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Phe355 360 365Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Lys Glu Tyr Pro Arg Leu Ser Asp370 375 380Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp Ile Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asp385 390 395 400Gly Leu Glu Pro Leu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ala Asn405 410 415Thr Ser Thr Asn Met Arg Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val420 425 430Asn Pro Asn Ser Thr Leu Tyr Asn Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His435 440 445Ala Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg Ser Gln Leu Val Leu Asn450 455 460Leu Ala Leu Pro Glu Val Gln Asp Phe Ile Ile Lys Ser Val Ser Asp465 470 475 480Ile Leu Lys Ser Ala Asp Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg485 490 495Gly Ile His Glu Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser His Ala Tyr Met Leu500 505 510Gly Leu Tyr Arg Val Phe Glu Glu Leu Thr Thr Gln Phe Pro Asp Val515 520 525Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val530 535 540Leu Gln Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile545 550 555 560Asp Arg Ile Thr Ile Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser565 570 575Ala Met Gly Ala His Leu Ser Gln Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg580 585 590Thr Val Pro Val Ala Val Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly Ser595 600 605
序列表Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Asp Asp Lys Ala610 615 620Ala Met Pro Gly Leu Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Val625 630 635 640Leu Thr Gly Asp Met Trp Arg Leu Asn Leu Pro Glu Asp Ser Asn Trp645 650 655Pro Ala Val Leu Phe Ile Ala Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Leu Phe660 665 670Val Phe Gln Leu Ala Pro Asn Val Asp His Ser Trp Pro Arg Val Arg675 680 685Leu Glu Gly Leu Asp Glu Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Asp Asp Gly Val690 695 700Val Tyr Ser Gly Gly Thr Leu Met Asn Ile Gly Leu Gln Phe Pro Phe705 710 715 720Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Gln Val Val Met Leu Glu Lys Gln725 730<210>6<211>21<212>PRT<213>Penicillium sp.
<400>6Met Ser Pro Leu Leu Leu Ser Phe Ile Val Ser Asn Leu Thr Ile Tyr15 10 15Pro Ile Ala Ile Ala20
權(quán)利要求
1.一種α-半乳糖苷酶，其特征在于含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的α-半乳糖苷酶，其特征在于其具有SEQ ID NO2或SEQID NO5所示的氨基酸序列。
3.一種編碼權(quán)利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因，其特征在于具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；或(b)在嚴謹條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。
4.按照權(quán)利要求3的基因，其特征在于其具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組表達質(zhì)粒。
6.按照權(quán)利要求5的重組表達質(zhì)粒，其特征是所述的重組表達質(zhì)粒是pPIC9-Agl1。
7.含有權(quán)利要求5或6所述重組表達質(zhì)粒的重組菌株。
8.按照權(quán)利要求7的重組菌株，其特征是所述的重組菌株是GS115/Agl1。
9.一種制備權(quán)利要求1所述的α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟構(gòu)建含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的重組表達質(zhì)粒；培養(yǎng)用該重組表達質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α-半乳糖苷酶的表達，回收并純化所表達的α-半乳糖苷酶。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其特征是所述的重組表達質(zhì)粒是pPIC9-Agl1；所述的宿主細胞是畢赤酵母細胞(Pichic pastoris)GS115，所述的重組菌株為GS115/Agl1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的α－半乳糖苷酶基因、其編碼蛋白及其制備方法和用途。本發(fā)明首先從青霉(Penicillium sp.)F63(CGMCC No.1669)中分離純化出α－半乳糖苷酶，再分離、克隆得到編碼該酶的基因(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)。此外，本發(fā)明還公開了制備該α－半乳糖苷酶的方法，包括構(gòu)建含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的重組表達質(zhì)粒；培養(yǎng)用該重組表達質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細胞，得重組菌株；培養(yǎng)該重組菌株，誘導(dǎo)重組α－半乳糖苷酶的表達，回收并純化所表達的α－半乳糖苷酶。通過核苷酸和氨基酸序列比較，該α－半乳糖苷酶為一新的α－半乳糖苷酶。試驗證實，本發(fā)明α－半乳糖苷酶能夠較好的水解大豆中棉子糖和水蘇糖，可應(yīng)用于飼料和食品工業(yè)。
文檔編號C12N15/63GK101074435SQ20061008045
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者姚斌, 王亞茹, 羅會穎, 密士軍, 史秀云, 袁鐵錚, 柏映國, 楊培龍, 孟昆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所