專利名稱：象草體細胞培養高頻率植株再生技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及象草體細胞培養獲得高頻率植株再生的技術方法，屬于生物技術領域，專用于象草體細胞培養、試管苗微繁殖和體細胞突變體篩選，并適用于農桿菌介導法基因轉化。
二、技術背景象草(Pennisetum Purpureum Schumach)為禾本科狼尾草屬多年生草本植物，原產熱帶非洲，是適宜于熱帶和亞熱帶地區種植的高產牧草，可用于草食畜禽養殖、公路護坡、中高檔紙漿和人造木板生產，近年來的研究表明象草還是一種理想的生物質能源作物，國內外種植面積有迅速擴大的趨勢。但由于象草為對光照敏感的短日照作物，只能在北緯28°以南地區正常開花完成生育過程及自然越冬，在長江中下游及其相同緯度地區主要作一年生利用，不能自然開花結實。自然開花或人工誘導象草開花，均由于種子成熟期不一、易于落粒和發芽率極低，在生產上只能采用種莖無性繁殖的方法提供種苗，且缺乏抗寒、耐鹽性強的象草品種，影響其大面積推廣種植。
宣樸等以狼尾草屬雜交種皇竹草的腋芽和頂芽為外植體材料，通過愈傷組織誘導和綠苗分化途徑建立快繁體系，但皇竹草腋芽和頂芽誘導愈傷組織的頻率僅為10％，綠苗分化率為5％。迄今為止尚未見國內外有關象草組織培養高頻率植株再生技術的報道。本研究以象草品種N51的幼穗為外植體材料，試圖探明不同激素組合對處于不同發育時期幼穗的愈傷組織誘導和植株再生能力的影響，以期建立起象草體細胞培養高頻率植株再生技術體系，為實現象草工廠化試管苗生產和利用生物技術培育抗寒、耐鹽新品種奠定基礎。

發明內容
技術問題 本發明的目的在于建立象草幼穗培養獲得顆粒狀胚性愈傷組織和高頻率植株再生的技術，克服高梁屬作物在組織培養中誘導產生白色、半透明、粘狀愈傷組織，綠苗分化率低，愈傷組織經過繼代培養后喪失植株分化能力，不宜用于規模化試管苗繁殖和分子生物學育種等缺陷。
技術方案象草體細胞培養高頻率植株再生技術，其特征在于，(1)材料選用7～9月經短日照處理3周分枝穗原基分化期的象草幼穗為外植體材料。
(2)培養基基本培養基MS大量元素、微量元素、B5維生素，蔗糖3％，瓊脂條的用量為0.8％；愈傷組織誘導培養基附加2，4-二氯苯氧乙酸(簡稱2，4-D)4.0mg/L和激動素(簡稱KT)0.05mg/L或0.1mg/L；愈傷組織繼代培養基附加2，4-D 3.0mg/L和6-芐基氨基嘌呤(簡稱6-BA)0.2mg/L愈傷組織分化培養基附加苯基脲類細胞分裂素(簡稱CPPU)2.0mg/L和萘乙酸(簡稱NAA)0.01mg/L或KT 0.5mg/L和吲哚乙酸(簡稱IAA)0.5mg/L；培養基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整pH值至5.8。
(3)培養方法取分枝穗原基分化期2～5cm長的幼穗，在無菌條件下用70％的酒精徹底擦拭包在幼穗外的葉鞘，剝出幼穗，切成2～3mm長的段片。把幼穗切段接種于愈傷組織誘導培養基上，20～25d后將愈傷組織轉入愈傷組織繼代培養基。繼代培養20～25d后轉入綠苗分化培養基，20～25d后綠芽或顆粒狀愈傷組織再轉入新鮮的分化培養基繼續分化培養。3片葉大小的幼苗轉入壯根培養基，15d長成根系發育良好的的完整小植株。培養室溫度為26℃～28℃，光強為2000lux，每天光照16h。冬季和早春試管苗移栽至溫室，其它季節可直接移栽至大田。
有益效果 本發明與現有技術相比具有如下優點和積極效果本發明采用暗處理人工誘導幼穗分化的方法，選取象草分枝穗原基分化期的幼穗(離穗軸2～5cm)的幼穗為材料，通過激素調控，在離體培養條件下，有效地解決了象草在組織培養過程中由于誘導產生的愈傷組織水漬化或因形成大量毛狀根而喪失植株分化能力的難題。本發明顆粒狀胚性愈傷組織的誘導率在<p>E、精紡高支防縮抗靜電羊絨嗶嘰成品物理指標測試結果

該產品理化指標符合國家行業標準FZ/T24009-1999規定的優等品要求，抗靜電效果明顯。
F、精紡高支防縮抗靜電羊絨嗶嘰導電纖維添加量與織物抗靜電性能的關系

(注uc/m2——微庫侖/平方米，面料電荷面密度單位)通過生產實踐證明，導電纖維的細度和長度顯然應與基礎織物所用的原料細度和長度相適應。在加入導電短纖維的混紡紗的紡紗過程中，未出現靜電干擾問題，紡紗加工順利。與對應的常規混紡紗的紡紗過程相比，導電短纖維消除加工過程中的靜電干擾作用明顯；從織物的抗靜電效果看，由于導電纖維是無規律散布性的分布于面料中，導電纖維外露，導電性能均勻性差，所涂敷碳的實施例1-7的是選取不同摩爾比的對苯二胺及二胺基二苯醚成份。
實施例A及B的二胺分別選取單一的對苯二胺成份以及單一的二胺基二苯醚成份，其結果的熱膨脹系數、剝離強度及尺寸穩定性作為實施例1-7的比較，檢測結果參閱表二所示。
表一是本發明的實施例1-7及參考實施例A及B的反應物組成

本試驗中設置的3種激素組合對幼穗的出愈時間和愈傷組織狀態無明顯影響。幼穗接種15d后，愈傷組織均呈現白色或淺黃色顆粒狀，顆粒狀愈傷組織誘導率均較高。不同激素組合對愈傷組織狀態的影響表現在，幼穗接種30d后，顆粒狀愈傷組織的發生頻率不同，這種影響與幼穗的長度也有關。幼穗長度小于5cm時，在2，4-D濃度為4.0mg/L時，接種30d后，顆粒狀愈傷組織的誘導率總體呈現隨KT濃度的升高而提高的趨勢；幼穗長度為2～5cm，KT濃度為0.05mg/L和0.1mg/L時，顆粒狀愈傷組織的誘導頻率無差異，均明顯高于KT濃度為0.02mg/L的誘導培養基中顆粒狀愈傷組織的頻率。幼穗長度5～10cm時，無論穗基部或上部，KT濃度為0.05mg/L時，顆粒狀愈傷組織的誘導率最高。誘導培養基中KT濃度為0.02mg/L時，愈傷組織易產生纖毛或毛狀根，這可能與KT濃度偏低有關。
2.2愈傷組織的繼代培養愈傷組織在誘導培養基中培養25～30d后轉移至繼代培養基，水漬狀愈傷組織在所有繼代培養基中3～5d全部死亡；蓬松狀愈傷組織轉移至繼代培養基生長迅速，但7～10d后，部分蓬松狀愈傷組織產生大量的毛狀結構和不定根，大部分蓬松狀愈傷組織15d以后逐漸惡化，喪失綠苗分化的能力。從誘導培養基中選擇色澤鮮亮、顆粒狀愈傷組織進行繼代培養，當添加的激素組合為4.0mg/L2，4-D、0.05mg/L KT，即采用NI2誘導培養基進行繼代培養時，來自不同誘導培養基中的白色或淺黃色顆粒狀愈傷組織繼代10d后全部褐化，這可能是由于4.0mg/L 2，4-D濃度太高的原因。2，4-D濃度降至3.0mg/L或2.0mg/L，顆粒狀愈傷組織在繼代培養基上生長迅速，10d后，部分愈傷組織開始變為蓬松狀，部數周期天線。
表1

本實用新型的電性能可通過如下的測試曲線和實測的E面和H面的方向圖給以反映圖2是本實用新型頻帶內的電壓駐波比測試曲線。電壓駐波比測試結果表明，天線在225～400MHz頻帶內電壓駐波比均小于1.9；圖3a和圖3b分別給出了天線在225MHz頻點的實測E面和H面方向圖；圖4a和圖4b分別給出了天線在325MHz頻點的實測E面和H面方向圖；圖5a和圖5b分別給出了天線在400MHz頻點的實測E面和H面方向圖。
從以上E面和H面輻射方向圖測試結果表明，天線在頻帶內滿足了方向圖覆蓋要求。
表4 不同繼代、分化培養基對顆粒狀愈傷組織分化的影響

注培養21d的平均數(SG2)分化培養基，21d顆粒狀愈傷組織成苗率僅為7.7％，但綠芽分化率為30.8％，由于在分化培養基中的綠芽轉入相同分化培養基后成苗率達100％，因此來自繼代培養基NC2的顆粒狀愈傷轉入SG2的最終成苗率達38.5％，表明SG2對來自分化培養基NC2的顆粒狀愈傷組織也是適宜的分化培養基。繼代培養基為NC1和NC3，顆粒狀愈傷組織轉入分化培養基后，綠芽和綠苗總的分化率均以SG1高于SG2。來自繼代培養基NC3的顆粒狀愈傷組織轉入分化培養基SG2，21d，大部分愈傷組織繼續保持顆粒狀結構，部分顆粒狀愈傷分化出毛狀根，部分愈傷組織褐化，無綠芽和苗分化，這可能是由于在繼代培養時2，4-D濃度太低，影響愈傷組織的分化能力。分化培養基中的顆粒狀愈傷組織再次轉入分化培養基，10d后均惡化不能成苗。在分化培養基上的苗長勢較弱，早春移入簡易大棚后活棵慢，而且不易發棵；有3片葉的小苗轉入壯根培養基，生長15d，根系發達苗壯(圖2)。試管苗經1d溫室練苗，移栽至簡易大棚后，活棵快，移栽成活率達95％以上，生長健壯的小苗15d左右長出新的分蘗。
三.討論在禾本科植物組織培養和基因轉化研究中，國內外學者普遍認為幼穗、未成熟胚和成熟胚是最為適宜的外植體材料，胚性愈傷組織的誘導頻率和植株再生頻率顯著高于其它類型的外植體材料。宣樸等以皇竹草的腋芽和頂芽為外植體材料，通過愈傷組織誘導和綠苗分化途徑建立快繁體系，但皇竹草腋芽和頂芽誘導愈傷組織的頻率僅為10％，綠苗分化率為5％。王憑青等以雜交狼尾草(美洲狼尾草與象草雜交種)的莖節(帶側芽)、莖段、心葉和嫩葉為外植體材料，通過培養基配方篩選，建立起植株再生體系。本發明以象草的幼穗為外植體材料，建立起較高頻率的植株再生技術體系，并在此基礎上展開了體細胞突變體篩選和農桿菌介導基因轉化工作，目前已得到耐鹽脅迫篩選和轉耐鹽基因BADH的植株(圖3，圖4)。
本發明試驗結果表明，象草幼穗的不同發育時期對顆粒狀愈傷組織的誘導率影響最大。2～5cm長的幼穗顆粒狀愈傷組織的誘導率顯著高于＜2cm或＞5cm長的幼穗。2，4-D濃度為4.0mg/L，KT濃度為0.05mg/L或0.1mg/L，顆粒狀愈傷組織的誘導率較高。當繼代培養基中2，4-D濃度與誘導培養基相同時，繼代后愈傷組織迅速惡化，降低繼代培養基中2，4-D濃度，有利于顆粒狀愈傷組織的的保持和增殖。繼代培養時顆粒狀愈傷組織所占的比例和綠芽分化率的高低不僅與繼代培養基中的激素組合有關，還受到初始誘導培養基中的激素組合的影響。采用相同繼代培養基NC2，當誘導培養基中激素組合為2，4-D 4.0mg/L和KT0.05mg/L(NI2)時，繼代培養時顆粒狀愈傷組織的保持率只有40.9％，但綠芽分化率高為35.4％；而誘導培養基中激素組合為2，4-D 4.0mg/L和KT0.1mg/L(NI3)時，繼代培養時顆粒狀愈傷組織的保持率高達74.0％，綠芽分化率只有15.5％。相同分化培養基來自誘導培養基NI2和NI3的最后成苗率分別為50.2％和43.99％。來自誘導培養基NI3的顆粒狀愈傷組織盡管最后成苗率略低于NI2，但由于繼代培養時顆粒狀愈傷組織保持率高，有利于開展生物技術育種研究；誘導培養基NI2誘導的愈傷組織早期分化率高，對微繁殖有利。在繼代培養過程中，選擇外表呈干燥、緊密、顆粒狀愈傷組織有利于愈傷組織的增殖和植株再生能力的保持。
權利要求
1.象草體細胞培養高頻率植株再生技術，其特征在于，1)材料選用象草的幼穗為外植體材料；2)培養基基本培養基MS大量元素、微量元素、B5維生素，蔗糖質量比3％，瓊脂條質量比0.8％；愈傷組織誘導培養基附加2，4-二氯苯氧乙酸4.0mg/L和激動素0.05mg/L或0.1mg/L；愈傷組織繼代培養基附加2，4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L和6-芐基腺嘌呤0.2mg/L；愈傷組織分化培養基附加苯基脲類細胞分裂素2.0mg/L和萘乙酸0.01mg/L；或附加激動素0.5mg/L和吲哚乙酸0.5mg/L；幼苗壯根培養基1/2MS培養基，附加萘乙酸0.5mg/L；培養基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調整pH值至5.8；3)培養方法取象草2～5cm長的幼穗，在無菌條件下用70％的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗，切成2～3mm長的片段或把小花從穗軸上剝下，把幼穗的切段或小花接種在愈傷組織誘導培養基上，培養室溫度為26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培養，20～25d后獲得白色或淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織，轉入愈傷組織繼代培養基增殖20～25d后，轉入愈傷組織分化培養基上，20～25d后綠芽或顆粒狀愈傷組織再轉入新鮮的分化培養基繼續培養；帶有3片葉的幼苗轉入壯根培養基，15d長成根系發達的健壯試管植株。
全文摘要
本發明為象草體細胞培養高頻率植株再生技術，屬于生物技術領域。為象草工廠化試管苗生產和生物技術育種提供實用技術，顆粒狀胚性愈傷組織適用于開展體細胞突變體篩選和農桿菌介導法基因轉化工作。以改良的MS為基本培養基，誘導培養基添加4.0mg/L 2，4－D、0.05mg/L KT和4.0mg/L 2，4－D、0.1mg/LKT，繼代培養基添加3.0mg/L 2，4－D、0.2mg/L 6－BA，分化培養基添加2.0mg/LCPPU、0.01mg/L NAA或0.5mg/L KT和0.5mg/L IAA，總成苗率達50.2％和43.99％，試管苗的移栽成活率達95％以上。
文檔編號C12N5/04GK1860860SQ20061008525
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月7日 優先權日2006年6月7日
發明者鐘小仙, 佘建明, 顧洪如, 梁流芳, 張建麗, 丁成龍, 張保龍, 倪萬潮 申請人:江蘇省農業科學院, 杭州白云草業研究所有限公司