專利名稱：F2濕加松體細胞誘導方法
技術領域：
本發明屬于植物體細胞胚胎工程技術領域，具體涉及F2濕加松體細胞誘導方法。
背景技術：
F2濕加松是濕地松(Pinus elliottii var.elliottii Engelm)與加勒比松(Pinus caribeae Morelet)雜交產生的后代。濕地松與加勒比松雜交育種由澳大利亞人NIKLES博士等人于1955年首創。其形態接近濕地松，是利用濕地松和加勒比松基因重組，使兩個親體樹種的優良性狀在雜種子代中同時得到表現。在我國長江以南絕大部分地區均能適應種植，濕加松具有生長快、節間距離長、含油脂高、少蟲害、適生范圍廣等特性，其早期材積增益可達親體的3倍以上，而且表現出較強的抗松突圓蚧能力，是值得大力推廣的優良樹種。
但是，由于我國開展濕加松育種時間尚短，雜種種子生產成本高、種子產量低，而且用種子繁殖，個體分化大，難以保持濕加松母體的性狀；采用常規的扦插、壓條或嫁接等無性繁殖方法，繁育速度慢，難以滿足日益增長的市場需求。
體細胞誘導技術作為現代生物技術的一個重要組成部分，具有速度快、周期短、不受季節影響、后代穩定性高等特點。目前在我國對于F2濕加松體細胞誘導技術還沒有相關報道。

發明內容
本發明的目的是提供F2濕加松體細胞誘導方法，以加快繁育速度，縮短周期，實現F2濕加松的大規模、快速繁殖。
為了實現上述目的，本發明的解決方案一是以成熟種子為材料，經預處理、消毒、沖洗，剝出種胚種于誘導培養基上，誘導培養基配方為以DCR為基本培養基，含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)9.0-13.0mg/L、6-BA(6-卞基嘌呤)1.6-2.2mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤)1.6-2.2mg/L，培養條件23±1℃，黑暗培養。
其中，成熟種子預處理是將成熟種子采回后，用牛皮紙包裹，然后在外面套一層塑料袋，密封后在4℃避光儲存2個月。
成熟種子消毒、沖洗是種子在4℃冷藏2個月后，用75％酒精消毒30秒，用無菌水沖洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒10分鐘，用無菌水沖洗8次。
本發明的解決方案二是以幼嫩莖段為材料，經預處理、消毒、沖洗，切取1-2cm的小段接種到誘導培養基上，誘導培養基配方為以SH為基本培養基，含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)5.0-10.0mg/L、6-BA(6-卞基嘌呤)1.1-2.0mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤)1.1-2.0mg/L，培養條件23±1℃，黑暗培養。
其中，幼嫩莖段預處理是選出優良單株和健康、粗壯的母株后，在9月--10月對優樹上的新萌枝條進行嫁接，等到嫁接枝條萌發新芽后，從芽基部剪掉叢芽，這樣反復去芽幾次后，取其新萌發5-10cm的嫩芽。
幼嫩莖段消毒、沖洗是將萌芽條采回后，用流水沖洗30分鐘，然后在無菌工作臺上用75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒4分30秒。
采用上述方法后，本發明選種胚接種到誘導培養基1周后，胚體開始膨大，1個月后從子葉處開始出現愈傷組織，愈傷組織分為4種類型①白色，半透明，有光澤的粘性愈傷組織；②淡黃色，疏松的顆粒狀愈傷組織；③淺白色，水浸狀的愈傷組織；④淡綠色，疏松的顆粒狀愈傷組織。按四種愈傷組織類型分別轉接到激素濃度只有誘導培養基濃度1/10的繼代培養基上。培養二個月左右，愈傷組織的具體表現為①顏色淡黃，呈顆粒狀的愈傷組織逐漸褐化死亡；②顏色白色，顆粒狀的可以增殖，但細胞團沒有粘性；③愈傷組織松散，顏色黃色的也逐漸死亡；④顏色白色，呈半透明，具有粘性的愈傷組織增殖較好。這樣，在繼代培養基中連續培養幾代至十幾代，挑選顏色白色，呈半透明，具有粘性的愈傷組織進行增殖。經過十幾代連續挑選培養后，通過顯微鏡觀察，細胞團中的細胞已經全部為胚性細胞。至此，建立起濕加松成熟合子胚胚性愈傷組織體系。
本發明選幼嫩莖段接種到誘導培養基1個半月后，在莖段的切口處先出現淺綠色愈傷組織，愈傷組織呈顆粒狀，在針葉與莖段的結合處，出現白色、半透明，愈傷組織呈團狀。挑選白色、半透明，呈團狀的愈傷組織轉接到以BM基本培養基，添加生長素2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.2-2.0mg/L，分裂素6-BA(6-卞基嘌呤)0.25-0.5mg/L，KT(6-糠氨基嘌呤)0.25-0.5mg/L，肌醇1g/L，麥芽糖20-30g/L，滲透壓為140-160mmol/L的繼代培養基中，每12天左右增殖一次，在繼代培養基中連續培養幾代至十幾代，每次挑選顏色白色，呈半透明，具有粘性的愈傷組織進行增殖。經過十幾代連續挑選培養后，通過顯微鏡觀察，細胞團中的細胞已經全部為胚性細胞。至此，建立起濕加松幼嫩莖段的胚性愈傷組織體系。
這樣，再取胚性愈傷組織進行繼代增殖培養，12-15天繼代一次，直到有足夠的胚性材料進入液體培養基增殖培養，可達到快速生長的目的。然后進入成熟胚的培養、萌發、移栽，即可進行商業銷售。本發明是一種新型的林木育種方法，實現了F2濕加松大規模、快速繁殖的目的。
具體實施例方式
運用本發明進行F2濕加松繁殖時，首先對成熟胚及幼嫩莖段進行預處理，然后進行愈傷組織誘導，并結合培養基的調整來篩選出胚性愈傷組織，最后進入繼代增殖。具體操作步驟如下(1)材料的采集及預處理成熟合子胚成熟種子采回后，用牛皮紙包裹，然后在外面套一層塑料袋，密封后在4℃避光儲存2個月。
幼嫩莖段選出優良單株和健康、粗壯的母株后，在9月--10月對優樹上的新萌枝條進行嫁接，嫁接材料選擇種子園優良單株新萌枝條。等到母株嫁接枝條萌發新芽后，從芽基部剪掉叢芽，這樣反復去芽幾次，取其新萌發5-10cm的嫩芽作為實驗材料。
(2)培養基的制備①按組織培養常規方法配制好誘導培養基成熟胚的誘導培養以DCR為基本培養基，含有2，4-D 11.0mg/L、6-BA 2.0mg/L、KT 2.0mg/L；幼嫩莖段在以SH為基本培養基，添加2，4-D 5.0-10.0mg/L、6-BA 1.1-2.0mg/L、KT 1.1-2.0mg/L的誘導培養基上。
②分裝、高壓蒸汽滅菌、冷卻后備用。
(3)誘導階段在無菌條件下，對成熟種子在4℃冷藏2個月后，用75％酒精消毒30秒，用無菌水沖洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒10分鐘，用無菌水沖洗8次后，小心剝出種胚接種于誘導培養基上；對嫩芽，萌芽條采回后，用流水沖洗30分鐘，然后在無菌工作臺上用75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒4分30秒，然后切為1-2cm的小段就可以接種到誘導培養基上。
(4)愈傷組織的挑選和繼代培養①培養基的配制配制以BM為繼代培養的基本培養基，其中添加生長素2，4-D 1.2-2.2mg/L、分裂素6-BA 0.25-0.5mg/L、KT0.25-0.5mg/L、肌醇1g/L、麥芽糖20-30g/L以及各種氨基酸，經過高壓蒸汽滅菌后添加麥芽糖再分裝，冷卻備用。
②種胚接種到誘導培養基1周后，胚體開始膨大，1個月后從子葉處開始出現愈傷組織。愈傷組織經過挑選后從外植體上切下，轉入繼代培養基(種胚和莖段的繼代培養基一樣)上進行繼代培養，每12-15天繼代培養一次。連續培養幾代至十幾代(二個月左右)，挑選顏色白色，呈半透明，具有粘性的愈傷組織進入液體培養基進行增殖培養，可達到快速生長的目的。然后進入成熟胚的培養、萌發、移栽，即可進行商業銷售。
幼嫩莖段誘導培養1個半月后，在莖段的切口處先出現淺綠色，呈顆粒狀的愈傷組織，在針葉與莖段的結合處，出現白色，半透明，呈團狀的愈傷組織。挑選白色，半透明，呈團狀的愈傷組織轉接到BM繼代培養基中，每12天左右繼代一次。在繼代培養基中連續培養幾代至十幾代，每次挑選顏色白色，呈半透明，具有粘性的愈傷組織進入液體培養基進行增殖培養，可達到快速生長的目的。然后進入成熟胚的培養、萌發、移栽，即可進行商業銷售。
本發明具有如下優點一、所取材料為成年樹嫁接萌芽條，一般在針葉樹種的繁育上，采用成熟或未成熟種子作為原始材料，但由于有性繁殖，種子變異較大，使后代不能完全保持母本的優良性狀，這樣，后代就會表現出不同的性狀，根據后代20年左右的生長表現情況來確定優良無性系，然后進行大量繁殖，通過使用嫁接及多次去芽的方法，不僅可以使成年植株達到幼齡化狀態，保持母本所具有的優良性狀外，而且能提高愈傷組織的誘導率，同時，還可以大大縮短對后代表現性狀的觀察時間；二、在繼代培養階段，由于胚性和非胚性愈傷組織對培養基的滲透壓的適應范圍不同，可以通過調整培養基的滲透壓來選擇胚性愈傷組織，這樣不僅可以避免通過顯微鏡挑選時出現混雜現象，還可以減少因操作污染而導致的材料損失。
權利要求
1.F2濕加松體細胞誘導方法，其特征在于以成熟種子為材料，經預處理、消毒、沖洗，剝出種胚種于誘導培養基上，誘導培養基配方為以DCR為基本培養基，含有2，4-D 9.0-13.0mg/L、6-BA 1.6-2.2mg/L、KT 1.6-2.2mg/L，培養條件23±1℃，黑暗培養。
2.如權利要求1所述的F2濕加松體細胞誘導方法，其特征在于成熟種子預處理是將成熟種子采回后，用牛皮紙包裹，然后在外面套一層塑料袋，密封后在4℃避光儲存2個月。
3.如權利要求1所述的F2濕加松體細胞誘導方法，其特征在于成熟種子消毒、沖洗是種子在4℃冷藏2個月后，用75％酒精消毒30秒，用無菌水沖洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒10分鐘，用無菌水沖洗8次。
4.F2濕加松體細胞誘導方法，其特征在于以幼嫩莖段為材料，經預處理、消毒、沖洗，切取1-2cm的小段接種到誘導培養基上，誘導培養基配方為以SH為基本培養基，含有2，4-D 5.0-10.0mg/L、6-BA 1.1-2.0mg/L、KT 1.1-2.0mg/L，培養條件23±1℃，黑暗培養。
5.如權利要求4所述的F2濕加松體細胞誘導方法，其特征在于其中，幼嫩莖段預處理是選出優良單株和健康、粗壯的母株后，在9月--10月對優樹上的新萌枝條進行嫁接，等到嫁接枝條萌發新芽后，從芽基部剪掉叢芽，這樣反復去芽幾次后，取其新萌發5-10cm的嫩芽。
6.如權利要求4所述的F2濕加松體細胞誘導方法，其特征在于幼嫩莖段消毒、沖洗是將萌芽條采回后，用流水沖洗30分鐘，然后在無菌工作臺上用75％酒精消毒30秒，無菌水沖洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒4分30秒。
全文摘要
本發明公開一種F2濕加松體細胞誘導方法，以成熟種子為材料，經預處理、消毒、沖洗，剝出種胚種于誘導培養基上，誘導培養基配方為以DCR為基本培養基，含有2，4－D 9.0－13.0mg/L、6－BA 1.6－2.2mg/L、KT 1.6－2.2mg/L，培養條件23±1℃，黑暗培養；以幼嫩莖段為材料，經預處理、消毒、沖洗，切取1－2cm的小段接種到誘導培養基上，誘導培養基配方為以SH為基本培養基，含有2，4－D 5.0－10.0mg/L、6－BA 1.1－2.0mg/L、KT 1.1－2.0mg/L，培養條件23±1℃，黑暗培養。本發明可加快繁育速度，縮短周期，實現F2濕加松的大規模、快速繁殖。
文檔編號C12N5/04GK101029301SQ20061012223
公開日2007年9月5日 申請日期2006年9月14日 優先權日2006年9月14日
發明者賴桂星, 蔡干強, 林良科, 鄭仁華, 蘇志強, 賴春陽, 馮鵬 申請人:廈門涌泉科技有限公司