專利名稱：一種土壤放線菌發(fā)酵液的提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自新疆那拉提地區(qū)分離的土壤放線菌發(fā)酵液的提取物及其制備方法，以及該提取物在制備抗小菜蛾和魚類寄生蟲中華鳋的農(nóng)藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)屬鱗翅目菜蛾科，是世界性十字花科蔬菜的主要害蟲，年發(fā)生世代多(一般亞熱帶地區(qū)8～12代，熱帶地區(qū)20代以上)，繁殖系數(shù)高，平均每頭雌蟲成蟲產(chǎn)卵在170粒以上，世代間蟲口數(shù)量增長快，重疊現(xiàn)象嚴重。在全世界，小菜蛾造成的經(jīng)濟損失十分嚴重，在美國，每年由蟲害引起的損失達30億美元，而由小菜蛾造成的損失達10億美元，占三分之一。在我國，每年小菜蛾造成的損失以億元計。在產(chǎn)量方面，由小菜蛾危害引起蔬菜減產(chǎn)在美國達4000多萬噸；在我國，部分地區(qū)由于小菜蛾大暴發(fā)曾使油菜顆粒無收。在防治上，全世界用于殺滅小菜蛾的費用達數(shù)十億美元，這還不包括研究開發(fā)新殺蟲劑投入的費用。
60年代中期，我國使用有機磷農(nóng)藥來防治小菜蛾，80年代初又使用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，到80年代后期，小菜蛾對這兩類農(nóng)藥產(chǎn)生了高度的抗藥性。苯甲酰基脲類(BPUS)殺蟲劑被稱為第3代農(nóng)藥，通過抑制昆蟲表皮基丁質(zhì)合成，導(dǎo)致昆蟲新表皮不能正常形成而死亡，由于其機理獨特，曾認為該類殺蟲劑不易產(chǎn)生抗藥性，但在某些地區(qū)，由于不合理使用，使得小菜蛾很快產(chǎn)生抗藥性。蘇云金桿菌與阿維菌素屬于生物農(nóng)藥范圍，過去人們認為對小菜蛾不易產(chǎn)生抗藥性，但近年的研究表明，小菜蛾已對蘇云金桿菌與阿維菌素產(chǎn)生抗藥性，且抗性水平有逐年提高的趨勢。因此，研制新的生物農(nóng)藥以防治抗藥性小菜蛾具有重要意義。
中華鳋(Sinergasilus spp)是魚類常見的嚴重寄生蟲，常常造成魚類減產(chǎn)和大批死亡。目前防治此類寄生蟲的主要是敵百蟲等藥劑。這些藥劑的長期使用已造成寄生蟲對藥劑產(chǎn)生抗藥性。因此，尋找新的生物農(nóng)藥成為當(dāng)務(wù)之急。
從土壤放線菌中研制新的生物農(nóng)藥是一種有效途徑，如井岡霉素、阿維菌素都是開發(fā)成功的例子。目前，人類發(fā)現(xiàn)的大約上萬種抗生素，有70％是由土壤放線菌產(chǎn)生的。近五十年來，人們大約只研究和分離了1～2％的土壤放線菌，其中大部分特別是一些人類活動很少干擾的土壤放線菌研究幾乎是空白的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有潛在生物農(nóng)藥價值的土壤放線菌發(fā)酵液的提取物。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述土壤放線菌發(fā)酵液的提取物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述土壤放線菌發(fā)酵液的提取物在制備抗小菜蛾或抗魚類寄生蟲等農(nóng)藥中的應(yīng)用。該土壤放線菌發(fā)酵液提取物是土壤放線菌GDPPRA 3704發(fā)酵物中對小菜蛾和中華鳋有效部分油狀物。
本發(fā)明所涉及的土壤放線菌分離自新疆那拉提地區(qū)的沿河樹林。本發(fā)明所用的微生物菌株是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所生化組自新疆那拉提地區(qū)分離得到土壤微生物，初步鑒定為放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌屬(Streptomyces)的一個種Streptomyces sp.，編號為GDPPRA 3704，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏時間為2006年7月14日，菌種保藏號為CCTCCNoM 206067。
GDPPRA 3704的形態(tài)特征為在高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上，基絲灰黃色，氣絲淡黃至象牙黃，無可溶性色素。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種土壤放線菌發(fā)酵液提取物的制備方法，包括以下步驟(1)土壤放線菌GDPPRA 3704的種子培養(yǎng)將高氏一號培養(yǎng)基制成試管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培養(yǎng)7～10天。
(2)土壤放線菌GDPPRA 3704的液體發(fā)酵培養(yǎng)將斜面中成熟菌株制成孢子懸浮液，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為8～16％，通氣量(V/Vmin)為1∶0.6～1.2，發(fā)酵溫度為26～32℃，發(fā)酵培養(yǎng)周期為72～108小時。
(3)有效物質(zhì)的浸出
將步驟(2)培養(yǎng)的發(fā)酵液離心分離，棄去上清液，保留菌絲，用60～80％(體積百分比)丙酮浸泡菌絲8～24小時，離心除去菌絲體，保留濾液。
(4)有效物質(zhì)的分離用大孔吸附樹脂對濾液進行吸附，用純丙酮洗脫，對洗脫液進行減壓濃縮，得到棕色油狀物，即為土壤放線菌發(fā)酵液的提取物。
所述菌株為土壤放線菌GDPPRA 3704，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏號為CCTCC NoM 206067。
所述高氏一號培養(yǎng)基組成為KNO31g，NaCl 0.5g，MgSO40.5g，K2HPO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，可溶性淀粉20g，瓊脂20g，水1000ml。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖15～30g，淀粉5～15g，豆餅粉10～25g，玉米漿10～15g，氯化鈉2～8g，碳酸鈣2～8g，水1000ml。
一種土壤放線菌發(fā)酵液的提取物就是通過上述制備方法制備而成的。
上述土壤放線菌發(fā)酵液的提取物在制備抗小菜蛾或抗魚類寄生蟲等農(nóng)藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的提取物(油狀物)能殺死小菜蛾和魚類寄生蟲中華鳋，具體效果可達到175ml，72h，100％殺滅小菜蛾；0.6μg/ml，24h，100％殺滅中華鳋。本發(fā)明的提取物可用于制備殺小菜蛾的農(nóng)藥和用于制備殺魚類寄生蟲的農(nóng)藥。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明發(fā)酵工藝和提取工藝簡單，有效物質(zhì)回收率高。小菜蛾和中華鳋對本發(fā)明油狀物較敏感，較低濃度已具有殺滅作用，可望制成生物農(nóng)藥，具有較高的經(jīng)濟和社會效益。同時，此土壤放線菌發(fā)酵液的提取物(油狀物)為土壤放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的，在自然條件下可降解，對環(huán)境影響較少。
本發(fā)明土壤放線菌GDPPRA 3704，為放線菌目、鏈霉菌屬的一個種Streptomyces sp，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏時間為2006年7月14日，保藏號為CCTCC NoM 206067。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1
本發(fā)明提取物——棕色油狀物的制備方法(1)土壤放線菌GDPPRA 3704的種子培養(yǎng)高氏一號培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為KNO31g，NaCl 0.5g，MgSO40.5g，K2HPO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，可溶性淀粉20g，瓊脂20g，水1000ml，制成茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培養(yǎng)10天。
(2)土壤放線菌GDPPRA 3704的液體發(fā)酵培養(yǎng)采用30L發(fā)酵罐進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20g，淀粉10g，豆餅粉15g，玉米漿15g，氯化鈉5g，碳酸鈣3g，水1000ml；將茄子瓶斜面中成熟菌株制成孢子懸浮液接入發(fā)酵罐，接種量為10％，發(fā)酵溫度為30℃，通氣量(V/Vmin)為1∶0.8，發(fā)酵培養(yǎng)96小時。
(3)有效物質(zhì)的浸出將步驟(2)培養(yǎng)好的發(fā)酵液在2000r/min離心10min，棄去上清液，保留菌絲，用60％(體積百分比)丙酮浸泡12小時，在2000r/min離心10min，除去菌絲體，保留濾液。
(4)有效物質(zhì)的分離用大孔吸附樹脂HZ-841對濾液進行吸附，用純丙酮洗脫，對洗脫液進行減壓濃縮，得到棕色油狀物1.75g。即為本發(fā)明的土壤放線菌發(fā)酵液的提取物。
實施例2本發(fā)明提取物——棕色油狀物的制備方法(1)土壤放線菌GDPPRA 3704的種子培養(yǎng)高氏一號培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為KNO31g，NaCl 0.5g，MgSO40.5g，K2HPO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，可溶性淀粉20g，瓊脂20g，水1000ml，制成試管斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培養(yǎng)8天。
(2)土壤放線菌GDPPRA 3704的液體發(fā)酵培養(yǎng)采用30L發(fā)酵罐進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30g，淀粉15g，豆餅粉25g，玉米漿10g，氯化鈉8g，碳酸鈣8g，水1000ml；將試管斜面中成熟菌株制成孢子懸浮液接入發(fā)酵罐，接種量為16％，發(fā)酵溫度為26℃，通氣量(V/Vmin)為1∶1.2，發(fā)酵培養(yǎng)108小時。
(3)有效物質(zhì)的浸出將步驟(2)培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心，棄去上清液，保留菌絲，用80％丙酮浸泡24小時，離心，除去菌絲體，保留濾液。
(4)有效物質(zhì)的分離用大孔吸附樹脂HZ-841對濾液進行吸附，用純丙酮洗脫，對洗脫液進行減壓濃縮，得到棕色油狀物1.75g。即為本發(fā)明的土壤放線菌發(fā)酵液的提取物。
實施例3 本發(fā)明提取物——棕色油狀物殺滅小菜蛾和中華鳋活性實驗A、抗小菜蛾試驗將實施例1得到的棕色油狀物進行系列濃度稀釋，然后將菜心葉子浸泡于溶液30秒，拿出，自然晾干后，將人工養(yǎng)殖的2齡小菜蛾幼蟲接到藥劑處理的葉片上，在25℃條件下養(yǎng)殖，每24小時調(diào)查一次小菜蛾的死亡率，以丙酮為空白對照，每處理3個重復(fù)。實驗結(jié)果見表1。藥劑濃度為175μg/ml，72h可以100％殺滅小菜蛾；濃度為350μg/ml，48h可以100％殺滅小菜蛾。
表1

B、抗魚類寄生蟲中華鳋的試驗用500ml三角瓶將實施例1得到的棕色油狀物進行系列濃度稀釋，然后將中華鳋接到各處理的三角瓶中，在25℃條件下養(yǎng)殖，每24小時調(diào)查一次中華鳋的死亡率，以丙酮為空白對照，每處理3個重復(fù)。實驗結(jié)果見表2。從表2的結(jié)果可知，本發(fā)明提取物對中華鳋具有明顯的殺滅作用，藥劑濃度在0.6μg/ml，24小時可100％殺死中華鳋。
表2


如上所述，可較好地實現(xiàn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種土壤放線菌發(fā)酵液提取物的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)土壤放線菌GDPPRA 3704的種子培養(yǎng)將高氏一號培養(yǎng)基制成試管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培養(yǎng)7～10天；(2)土壤放線菌GDPPRA 3704的液體發(fā)酵培養(yǎng)將斜面中成熟菌株制成孢子懸浮液，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為8～16％，通氣量為1∶0.6～1.2，發(fā)酵溫度為26～32℃，發(fā)酵培養(yǎng)周期為72～108小時；(3)有效物質(zhì)的浸出將步驟(2)培養(yǎng)的發(fā)酵液離心分離，棄去上清液，保留菌絲，用60～80％丙酮浸泡菌絲8～24小時，離心除去菌絲體，保留濾液；(4)有效物質(zhì)的分離用大孔吸附樹脂對濾液進行吸附，用純丙酮洗脫，對洗脫液進行減壓濃縮，得到棕色油狀物，即為土壤放線菌發(fā)酵液的提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤放線菌發(fā)酵液提取物的制備方法，其特征是所述菌株為土壤放線菌GDPPRA 3704，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏號為CCTCC NoM 206067。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤放線菌發(fā)酵液提取物的制備方法，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比為葡萄糖15～30g，淀粉5～15g，豆餅粉10～25g，玉米漿10～15g，氯化鈉2～8g，碳酸鈣2～8g，水1000ml。
4.一種土壤放線菌發(fā)酵液的提取物就是通過權(quán)利要求1所述的制備方法制備而成的。
5.權(quán)利要求4所述的土壤放線菌發(fā)酵液的提取物在制備抗小菜蛾或抗魚類寄生蟲農(nóng)藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種土壤放線菌GDPPRA 3704發(fā)酵液的提取物及其制備方法，以及該提取物在制備殺滅小菜蛾和魚類寄生蟲中華鳋等農(nóng)藥中的應(yīng)用。經(jīng)土壤放線菌GDPPRA 3704的種子培養(yǎng)；土壤放線菌GDPPRA 3704的液體發(fā)酵培養(yǎng)；有效物質(zhì)的浸出和有效物質(zhì)的分離，即得到發(fā)酵液的提取物。本發(fā)明發(fā)酵工藝和提取工藝簡單，有效物質(zhì)回收率高。小菜蛾和中華鳋對本發(fā)明提取物較敏感，較低濃度已具有殺滅作用，可望制成生物農(nóng)藥，具有較高的經(jīng)濟和社會效益。同時，此發(fā)酵液提取物為土壤放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的，在自然條件下可降解，對環(huán)境影響較少。
文檔編號C12R1/04GK1974756SQ20061012227
公開日2007年6月6日 申請日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日
發(fā)明者沈會芳, 林壁潤, 謝雙大, 潘群英, 姚新生, 張廣文 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所