專利名稱：檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測芯片，尤其涉及一種檢測全基因組CpG島的寡核 苷酸芯片及其應用。
背景技術：
正常細胞功能的發揮與細胞本身的遺傳信息、遺傳調控和表觀遺傳調 控相關，隨著人類基因組計劃的實施，國內外對基因組所攜帶的遺傳信息 在疾病發生、發展中的重要作用已有比較深入的研究。相對而言，染色質 所攜帶的表觀遺傳信息在疾病發生、發展中的重要作用才剛開始被認識， 表觀遺傳學基因組正在興起。表觀遺傳學的過程包括DNA甲基化，組蛋白 的修飾和ATP依賴的染色質的修飾，都可以引起基因表達的改變。其中 DNA的甲基化是目前的一個研究熱點。
疾病發生、發展是細胞內遺傳本身、遺傳調控和表觀遺傳調控的紊亂。 大量的臨床和基礎研究結果表明除了遺傳因素，環境因素在大多數疾病發 生、發展中有巨大的影響，而表觀遺傳調控機制在遺傳因素和環境因素的 互動關系中起了橋梁的作用，已有的研究結果表明表觀遺傳因素的作用占 百分之七十左右。近年的研究更進一步指出表觀遺傳調控機制在多種疾病 發生中起主導作用。基因表達的表觀遺傳調控是保證細胞內基因的時空正
確表達所必需的。因此，當表觀遺傳調控出現異常時，在胚胎發育階段可 能引起各種先天性的發育缺陷，在成體階段可能造成各種疾病的發生。后
基因組時代表觀遺傳學的興起為解開生命奧秘及征服疾病帶來了希望。
在哺乳類動物中，胞嘧啶的甲基化是惟一己知的DNA內源性修飾方 式，即通過DNA甲基轉移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)的催化作 用，將甲基基團加在胞嘧啶的5' C位置處。在哺乳類動物細胞中，大多 數5'-甲基胞嘧啶(5mC)以雙核苷酸CpG的形式出現。CpG雙核苷酸在 基因組中的分布很不均勻，其中密度較高的區域稱為CpG島(CpGisland)。 以人類基因組為例，人類5(m 6(m的基因有CpG島，據估計整個基因組 有45, 000個CpG島，并且幾乎總是位于基因啟動子和(或)外顯子周圍。 除了印記基因和女性失活的X染色體的幾個基因外，正常情況下，在CpG 島的CpGs總是非甲基化的，而大多數CpG島之外的CpGs則是甲基化的。
DNA甲基化的機制及其作用尚未完全清楚，目前認為它與控制基因表 達、DNA修復、外源基因的識別和剔除、以及染色體的穩定性等相關。已 證實，CpG島的甲基化可以直接導致相關基因的表觀遺傳學沉默，啟動子 區域CpG島甲基化是與基因突變和缺失相并列的抑癌基因失活的第3種途 徑，并成為近年來腫瘤研究的熱點之-。
隨著生物技術的進步，DNA甲基化的檢測手段日漸豐富，常用技術 的基本原理主要可以歸納為四個方面:一種是依賴化學物質對甲基化和非 甲基化胞嘧啶的化學活性不同，將甲基修飾基團的差別轉變為堿基序列的 不同，從而加以分離；另一種是依賴甲基化和非甲基化胞嘧啶對特定的限
制性內切酶處理的不同反應而實現；第三種是依據差異性雜交的原理；第
四種則是依靠甲基化CpG結合(methyl-CpG-binding domain, MBD)蛋白 家族對甲基化以及非甲基化的CpG序列的結合能力的不同進行分離。此
外，還有單核苷酸法、甲基化接受力的檢測法等多種技術，這些技術極大 地促進了表觀遺傳學的研究，推動了表觀基因組學研究的開展。目前雖然
已經存在較多的DNA甲基化的檢測技術，但是每種方法都有一定的局限
性，難以達到大規模和全基因組范圍的分析，也不能檢測全基因組中甲基
化或非甲基化DNA具體的CpG位點?，F有的表觀基因組學急需要高通量， 大規模的研究手段，全面地了解在疾病的發生過程中甲基化譜式的改變。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種檢測全基因組CpG島的寡核苷 酸芯片，能夠高通量、大規模地對全基因組DNA進行CpG島的檢測。為此， 本發明還提供應用該寡核苷酸芯片進行檢測的方法。
為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現
在本發明的一個方面，提供了一種檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯 片，包括固相載體和探針，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游 2kb區域的核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交。
所述探針的設計針對包括人類、大鼠、小鼠在內的哺乳動物全基因組 CpG島及CpG島上下游2kb區域的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種應用上述寡核苷酸芯片檢測全基因 組CpG島位置的方法，包括如下步驟
(1) 抽提待測樣品核酸；
(2) 對步驟(1)抽提的DNA進行純化；
(3) 標記步驟(2)純化的DNA;
(4) 選取上述寡核苷酸芯片，在適于與所選芯片進行雜交的條件下，加入經標記的DNA，并使其反應足夠時間；
(5)檢測雜交反應結果，以確定待測樣品DNA的CpG島位置。
其中，所述步驟(2)中，DNA經純化后，可按不同的研究目的進行 富集，并經片段化處理；所述步驟(3)的標記包括熒光素標記、生物 素標記、熒光共振能量轉移標記、放射性元素標記和酶標記。
本發明的檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，能高通量、快速、準 確地在全基因組范圍內檢測目的DNA所在的CpG島位置，有助于全面了解 全基因組CpG島區域的甲基化譜式的改變。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明。 附圖是應用本發明的寡核苷酸芯片檢測全基因組CpG島的方法的流 程圖。
具體實施例方式
本發明的針對全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探 針，所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材 料中的一種或它們的任意組合；所述探針與全基因組范圍內CpG島及CpG 島上下游2kb區域的核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交。
應用本發明的寡核苷酸芯片檢測人全基因組CpG島的方法如附圖所 示，具體步驟為
(1)寡核苷酸芯片的制備 l)探針設計
針對全基因組范圍內的CpG島及CpG島上下游2kb區域的核苷酸序列
設計探針，平均每個CpG島設計6 10條探針，用于確定所檢測DNA所在 的CpG島的位置。設計探針長度為30 bp 55bp， Tm值65。C 7(TC， GC 含量為50 60%。 2)芯片制備
采用原位合成的方式進行。 (2)待測樣品的處理和標記
1) 全基因組DNA抽提及目的基因的獲取
采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206) i式劑盒 抽提待測樣品基因組DNA。將抽提溶解好的DNA移入高壓滅菌過的1. 5ml 離心管中，取lul進行電泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE, EB， 80MV， 1.5 小時電泳)，在FR-200紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker (Lambda DNA/EcoRI+Hindlll)進行定量。抽提的DNA依據不同的研究需 要可做進一步的篩選和富集。
2) 目的DNA的純化和片段化
目的DNA采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)純化。純化的DNA經測定濃度后，用DNase I進行片段化，片斷 化長度控制在80 200bp左右。片段化的反應體系包括IX DNase I緩沖液，200 ngM純化目的DNA， DNase I (0. 0012 ,g)。反應條件 為37。C溫浴5 min，然后95°C 15 min。片段化后的產物跑1. 5%瓊脂糖 凝膠，電泳檢測結果。
3) 熒光素標記
利用脫氧核苷酸末端轉移酶在3'末端進行熒光素標記，標記的反應
體系包括
片段化目的DNA 25 W
5X脫氧核苷酸末端轉移酶緩沖液 8 KL 40 W體系^ Cy3-dCTP (1 rnM) 1 W
脫氧核苷酸末端轉移酶(20 U/Hl)3 W 、ddH20 3 W
反應條件為37X:溫浴120min，然后95。C加熱15min。 (3)芯片雜交及結果分析
以熒光標記為例，標記的DNA 95C變性10 min，立即置于冰上，用 于雜交。雜交反應體系包括IOXSSPE， 0.01% triton， 5XDenhard， s solution, 10% DMSO以及熒光素標記的DNA。反應條件為45。C 65。C溫 浴1小時 16小時。然后相繼用洗漆緩沖液I (2XSSC， 0.2% SDS)和 洗滌緩沖液II (1XSSC， 0.1% SDS)在45。C 65X:各洗滌10 min，室溫 下用洗滌緩沖液III (0. 1XSSC)洗滌5分鐘，最后在室溫下用cWH20洗滌 30秒。洗滌后的芯片，經甩干后，用Axon 4000A芯片掃描儀進行掃描(也 可以用其他的激光掃描儀)。掃描結果用GenePix 4000A軟件處理圖像得 到數據文件，然后對數據文件進行分析。
對寡核苷酸芯片的雜交結果進行分析，以確定目的DNA所在的CpG島位置。 實施例1
應用本發明的寡核苷酸芯片檢測人全基因組CpG島的方法如附圖所 示，具體步驟為
l.寡核苷酸芯片的制備
1) 探針設計
針對人類全基因組范圍內46， 957個CpG島及CpG島上下游2kb區域 的核苷酸序列，設計共設計367， 802條探針，平均每個CpG島設計8條探 針，用于確定所檢測DNA所在的CpG島的位置。設計探針長度為30bp 55bp， Tm值65。C 70。C， GC含量為50 60%。
2) 芯片的制備采用原位合成的方式進行。 2.待測樣品的處理和標記
1) 人基因組DNA抽提及目的基因的獲取
采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206)試劑盒 抽提人外周血或組織中基因組DNA。將抽提溶解好的認A移入高壓滅菌過 的1.5ml離心管中，取lul進行電泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE, EB， 80MV， 1.5小時電泳)，在FR-200紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對 照marker (Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進行定量。抽提的DNA依據研 究需要分別使用甲基化和非甲基化特異的DNA親和層析柱進行分離富集。
2) 目的DNA的純化和片段化
分離的甲基化和非甲基化修飾的DNA分別采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)進行純化。純it的DNA 經測定濃度后，用DNase I進行片段化，片斷化長度控制在S0 150bp左 右。3(￥1片段化的反應體系包括IX DNaseI緩沖液，200 ng/W純化 目的DNA， DNase I (0. 0012 U/Pg)。反應條件為37。C溫浴5 min，然后95 °C 15 min。片段化后的產物跑1.5%瓊脂糖凝膠，電泳檢測結果。
3) 熒光素標記
利用脫氧核苷酸末端轉移酶在3'末端進行熒光素標記，標記的反應 體系包括
片段化目的DNA 25 W
5X脫氧核苷酸末端轉移酶緩沖液 8 W 40 rt體系^ Cy3-dCTP (1 mM) 1 W
脫氧核苷酸末端轉移酶(20 U/W) 3 W 、ddH20 3 W
反應條件為37'C溫浴120min，然后95"加熱15min。 (3)芯片雜交及結果分析
標記的DNA經95。C變性10min,立即置于冰上，用于雜交。雜交反 應體系包括10XSSPE，0.01%triton，5XDenhard， s solution,腦DMS0 以及熒光素標記的DNA。反應條件為48。C溫浴12小時。然后相繼洗滌緩 沖液I (2XSSC， 0.2% SDS)和洗滌緩沖液II (1XSSC， 0.1% SDS)在 48。C各洗滌10 min，室溫下用洗滌緩沖液III (0. 1XSSC)洗滌5分鐘， 最后在室溫下用ddH20洗滌30秒。洗滌后的芯片，經甩干后，用Axon 4000A 芯片掃描儀進行掃描。掃描結果用GenePix 4000A軟件處理圖像得到數據 文件，然后對數據文件進行分析。
對寡核苷酸芯片的雜交結果進行分析，以確定甲基化和非甲基化DNA 所在的CpG島位置。
權利要求
1. 一種檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游2kb區域的核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交。
2. 如權利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的探針長度 為30 bp 55bp， Tm值為65。C 70。C， GC含量為50 60%，且每個CpG 島設計6 10條探針。
3. 如權利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述探針的設計 針對包括人類、大鼠、小鼠在內的哺乳動物的全基因組CpG島及其上下游 2kb區域的核苷酸序列。
4. 如權利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述固相載體選 材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的 任意組合。
5. —種應用權利要求1所述寡核苷酸芯片檢測全基因組CpG島的方 法，其特征在于，包括如下步驟(1) 抽提待測樣品核酸；(2) 對步驟(1)抽提的DNA進行純化；(3) 標記步驟(2)純化的DNA;(4) 選取權利要求1所述的寡核苷酸芯片，在適于與所選芯片進行雜 交的條件下，加入經標記的DNA，并使其反應足夠時間；(5) 檢測雜交反應結果，以確定待測樣品DNA的CpG島位置。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，DNA經純化后，可按不同的研究目的進行富集，并經片段化處理。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的標記包括熒光素標記、生物素標記、熒光共振能量轉移標記、放射性元素標記和酶標記。
全文摘要
本發明涉及基因芯片，公開了一種檢測全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探針，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游2kb區域的核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交。本發明還公開了一種應用上述寡核苷酸芯片檢測全基因組CpG島位置的方法。本發明的寡核苷酸芯片，能高通量、快速、準確地在全基因組范圍內進行甲基化和/或非甲基化DNA的CpG島檢測，為全基因組CpG島的相關研究提供有力工具。
文檔編號C12Q1/68GK101205559SQ20061014747
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月19日 優先權日2006年12月19日
發明者穎 秦, 肖華勝 申請人:上海生物芯片有限公司