專利名稱：檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，尤其設(shè)計(jì)ー種檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)腫瘤的診斷主要依靠影像學(xué)手段，其缺點(diǎn)是不能早期診斷。一旦發(fā)現(xiàn)影像學(xué)異常，多數(shù)病例已錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療甚至化學(xué)藥物和放射治療的時(shí)機(jī)。因此，借助免疫檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行早期診斷始終是腫瘤防治研究的重要課題。但現(xiàn)有試劑盒檢測(cè)結(jié)果與疾病的符合率還不理想。對(duì)許多病例不能做出準(zhǔn)確早期診斷。目前市場(chǎng)上用于免疫檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的主要有放射免疫和酶免疫兩大類試劑盒。雖然它們都通過(guò)定量分析病人體內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物表現(xiàn)提出診斷信息，但是存在以下幾方面的問(wèn)題
a.定量標(biāo)準(zhǔn)混亂，不同廠家生產(chǎn)的試劑盒定量ー個(gè)特定樣品的結(jié)果有時(shí)會(huì)相差數(shù)倍， 導(dǎo)致特定標(biāo)志物表達(dá)的信息無(wú)法準(zhǔn)確傳遞出來(lái)，與疾病的符合程度下降；
b.定量范圍不合理。普遍表現(xiàn)為定量范圍窄，在實(shí)際應(yīng)用中給定量的準(zhǔn)確性帶來(lái)影響。 因而，新型檢測(cè)技術(shù)精確定量分析腫瘤標(biāo)志物，可以準(zhǔn)確區(qū)別個(gè)體分度和疾病狀態(tài)下腫瘤標(biāo)志物水平的差異及濃度變化。而化學(xué)發(fā)光免疫診斷技術(shù)由于靈敏度高，線性范圍寬，從而在有種于確定合理的定量和定量范圍。結(jié)腸鏡檢查是目前臨床使用的最精確的結(jié)腸癌篩檢方法，但是，高額的費(fèi)用和患者不愿承受這種侵入性治療方法限制了它的使用。結(jié)腸癌發(fā)生時(shí)，關(guān)聯(lián)相關(guān)基因CW9出現(xiàn)甲基化，然后利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行片段擴(kuò)増，基因檢測(cè)，或者而采用其他的方法進(jìn)行檢測(cè)， 但對(duì)于在片段擴(kuò)增前的基因CW9甲基化的早期檢測(cè)方法效果并不理想。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供一種檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其目的是解決以往的檢測(cè)方法效果不理想的問(wèn)題。技術(shù)方案本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過(guò)單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段。單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法的具體步驟如下 (1)、制備單克隆抗體
單克隆抗體利用下列試劑
抗原CW9基因CpG島甲基化片段為陽(yáng)性抗原，CW9基因CpG島非甲基化片段為陰性抗原，非特異性抗原為=MGMT基因CpG島甲基化片段，P16基因CpG島甲基化片段，HPPl基因CpG島甲基化片段；
其它特殊試劑弗氏完全佐計(jì)與弗氏不完全佐計(jì)，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000，14-四甲基15烷，鄰苯ニ胺，TRIS，HEPES緩沖劑，辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)兔抗BALB/c鼠檢驗(yàn)試劑盒其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?br> 免疫動(dòng)物8周齡BALB/c雄性小鼠用陽(yáng)性抗原甲基化CW9/CpG進(jìn)行二次免疫；每只小鼠基礎(chǔ)免疫劑量為100μ g，腹腔注射；24d后加強(qiáng)免疫，劑量為每只小鼠100μ g，尾靜脈注射，4d后取脾融合；
細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞Sp-2 / 0以10:1混合。用50%分子量為1000 聚乙ニ醇作融合劑，融合細(xì)胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5%C02，37°C條件下培養(yǎng)，7d后，每培養(yǎng)孔更換 2/3HT培養(yǎng)液。9d后，開始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化； 腹水抗體純化用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體； (2)、CW9甲基化片段免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定
a.化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的優(yōu)化由SapphireII不同濃度的增強(qiáng)劑和成底物工作液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值測(cè)定，進(jìn)行底物工作液的優(yōu)化；
b.固相化抗體微孔板的制備將上述制備的抗CW9甲基化片段單克隆抗體用0.05 mol/L、pH 為 9. 6 的碳酸鹽緩沖液稀釋成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被濃度，按100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、pH為7. 4的PBS 37°C封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度；
c.以正常人游離DNA作為參考，確定用優(yōu)化好的HRP化學(xué)發(fā)光定量試劑對(duì)100份健康人標(biāo)本進(jìn)行濃度測(cè)定，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定正常游離DNA，CW9甲基化片段參考范圍；
d.化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)孔分別加25μ L后，每孔再各加第二抗體 75 yL，在震蕩器上混勻1 min，置37°C恒溫反應(yīng)60 min.洗掉游離成分，加入底物工作液 50 yL，催化底物，第10 min后測(cè)定各加樣品孔的發(fā)光值RLU，并將數(shù)據(jù)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀
Luminoskan Ascent version 2. 4. 1tfi^lf。將制備的單克隆抗體進(jìn)行雜交瘤篩選及抗體檢測(cè)，具體步驟如下
雜交瘤篩選用固相抗原間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法進(jìn)行包被陽(yáng)性抗原甲基化CW9/CpG的濃度為25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗體抗原反應(yīng)物由80 μ 1培養(yǎng)上清液+2 μ 1 經(jīng)紫外分光光度計(jì)標(biāo)定濃度的15 μ g/ml的甲基化CW9/CpG組成；檢測(cè)對(duì)照孔中的抗原部分則用20μ l、20%Me0H-PBS的抗原稀釋液代替；酶底物用鄰苯ニ胺；其它按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明提供一種檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過(guò)單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段。本發(fā)明通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫技木，定性地測(cè)定特定的腫瘤基因甲基化片段。本發(fā)明的關(guān)鍵在于制備CW9甲基化單克隆抗體，該抗體可以對(duì)CW9甲基化片段有陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)CW9 非甲基化有陰性反應(yīng)。以上得出一個(gè)中間結(jié)果，然后利用傳統(tǒng)的RT-PCR基因擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)上述CW9甲基化非陰性產(chǎn)品的樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，然后根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)及RT-PCR的檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)患者是否有早期直腸癌進(jìn)行綜合性的評(píng)定。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn) 1、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)
化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)因其具有簡(jiǎn)便易
5行、標(biāo)記物制備非常容易、穩(wěn)定性高、便于實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，特別是能在較短的時(shí)間內(nèi)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此深受檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者和臨床醫(yī)師的好評(píng)。化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑作為免疫診斷試劑的ー種，是以化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的ー類診斷試劑，理論上所有免疫反應(yīng)均可以制備為化學(xué)發(fā)光診斷試劑盒。此類試劑盒通常包括免疫反應(yīng)試劑及化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑。2、化學(xué)發(fā)光免疫方法的特點(diǎn)
作為近十年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析方法。基于此構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑具有以下突出的技術(shù)特點(diǎn)
①靈敏度高。以發(fā)光底物可檢測(cè)出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏5000倍。這對(duì)濃度極稀的臨床標(biāo)志物的檢測(cè)尤為有效。以當(dāng)前廣為關(guān)注的HIV診斷為例。Handa等醫(yī)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)處于窗ロ期的HIV-I PM抗原。發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法的最小檢測(cè)極限在3. 1-6. 3pg/ml之間，而酶免疫法的最小檢測(cè)極限在12. 5-25. 0 pg/mL之間。與酶免疫法相比，化學(xué)發(fā)光法可把HIV的窗ロ期縮短7d。Sakai等醫(yī)用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)pM 抗原。其最小檢測(cè)濃度達(dá)到4. 3 pg/mL,小于Abbot和Coulter酶免疫試劑盒的相應(yīng)濃度。 縮短了 HIV感染的窗ロ期。②寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍，發(fā)光強(qiáng)度在4-6個(gè)數(shù)量級(jí)之間與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系，這有助于檢測(cè)濃度較高的臨床樣本。并避免彎鉤效應(yīng)，便如化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)癌胚抗原(CEA)時(shí)的線性范圍為0. 01-1000 ng/mL，達(dá)到約6個(gè)數(shù)量級(jí)，不受血清非特異因素的干擾，使檢測(cè)的特異性和敏感性明顯提高。③光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，輝光型化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至1 天。從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作及測(cè)量。④結(jié)果穩(wěn)定、誤差小、樣品系直接發(fā)光。不需要任何光源照射。免除了各種可能因素(光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等)給分析來(lái)來(lái)的影響。⑤環(huán)境友好。免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析的危害性，試劑有效期可長(zhǎng)達(dá)1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有1-2個(gè)月。而酶聯(lián)的底物儲(chǔ)存性差，都無(wú)法與化學(xué)發(fā)光相比，從而有利于推廣應(yīng)用。⑥、化學(xué)發(fā)光免疫分析較其他診斷技術(shù)更容易整合最新的平臺(tái)技木。由于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特點(diǎn)，尤其適合于全自動(dòng)檢測(cè)，所以整合了高質(zhì)量的單克隆抗體和重組(或合成) 蛋白質(zhì)抗原、高效抗體標(biāo)記方法、生物素親和素及磁性微粒子等固相包被技木。集加樣、傳輸、、分享、洗滌和測(cè)量、數(shù)據(jù)處理于一體的全自動(dòng)診斷技術(shù)平臺(tái)將是化學(xué)發(fā)光診斷技術(shù)的發(fā)展方向之一。⑦、快速檢測(cè)、攜帯方便。試劑盒可以隨身攜帯、操作場(chǎng)地不限。3、化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑
化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑漸有取代放射性免疫分析與普通酶免疫診斷試劑的趨勢(shì)，是未來(lái)免疫診斷試劑的重要發(fā)展方向。理論上所有免疫反應(yīng)均可以制備為化學(xué)發(fā)光診斷試劑盒。檢驗(yàn)快速，攜帯方便。4、結(jié)腸癌早期檢測(cè)
經(jīng)過(guò)研究論證，在連續(xù)臨床病例控制中，來(lái)自于結(jié)腸癌患者和非癌癥結(jié)腸疾病患者 3，000例血漿采樣健康控制，我們使DNA甲基化，由腫瘤流向血流充當(dāng)早期敏感性特異性的結(jié)腸癌探測(cè)生物標(biāo)記。在2006年ー項(xiàng)研究中，我們以甲基化DNA作為生物標(biāo)記物在血漿中探測(cè)，結(jié)腸癌早期檢測(cè)敏感性達(dá)到90%，當(dāng)測(cè)試被調(diào)整為“高敏感性”吋，則敏感度也可達(dá)到 70%。 通過(guò)參照實(shí)驗(yàn)測(cè)試服務(wù)提早向患者及醫(yī)生們提供生物標(biāo)記使用權(quán)。為高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)人、癌癥及癌癥患者開發(fā)專門的診斷法，這些測(cè)試包括監(jiān)督結(jié)腸癌生物標(biāo)記應(yīng)用及針對(duì)癌癥患者的基于組織的預(yù)期癌癥分子分類試驗(yàn)。
5、化學(xué)發(fā)光試劑用于結(jié)腸癌早期檢測(cè)
結(jié)腸癌發(fā)生吋，關(guān)聯(lián)相關(guān)基因CW9出現(xiàn)甲基化，傳統(tǒng)方法可利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行片段擴(kuò)增，基因檢測(cè)，本發(fā)明的新方法利用化學(xué)發(fā)光免疫方法對(duì)腫瘤發(fā)生物甲基化片段進(jìn)行免疫制作成單克隆抗體，通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，速度快，成本低，價(jià)格合理易于接受。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的說(shuō)明
本發(fā)明提供一種檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，該方法通過(guò)單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段。本發(fā)明的方法具體步驟如下
一.制備單克隆抗體本發(fā)明所產(chǎn)生的CW9甲基化單克隆抗體利用下列試劑 抗原CW9基因CpG島(CpGisland)甲基化片段(甲基化CW9/CpG)為陽(yáng)性抗原，CW9 基因CpG島(CpGisland)非甲基化片段(非甲基化CW9/CpG)為陰性抗原，非特異性抗原為 MGMT基因CpG島(CpGisland)甲基化片段，P16基因CpG島(CpGisland)甲基化片段，HPPl 基因CpG島(CpGisland)甲基化片段。其它特殊試劑弗氏完全佐計(jì)與弗氏不完全佐計(jì)，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000， 14-四甲基15烷(美國(guó)SIGMA公司)，鄰苯ニ胺，TRIS，HEPES緩沖劑(美國(guó)GIBCO公司)，辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)(ELISA)兔抗BALB/c鼠檢驗(yàn)試劑盒(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)試劑公司)其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?.免疫動(dòng)物8周齡BALB/c雄性小鼠(購(gòu)自衛(wèi)生部藥檢所動(dòng)物繁育場(chǎng))用陽(yáng)性抗原甲基化CW9/CpG進(jìn)行二次免疫；每只小鼠基礎(chǔ)免疫劑量為100 μ g，腹腔注射；24d后加強(qiáng)免疫，劑量為每只小鼠100 μ g,尾靜脈注射，4d后取脾融合。3.細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞Sp-2 / 0以10:1混合。用50%分子量為1000聚乙ニ醇作融合劑，融合細(xì)胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5%C02，37°C條件下培養(yǎng)，7d后，每培養(yǎng)孔更換2/3HT培養(yǎng)液。9d后，開始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。4.腹水抗體純化用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體。5.雜交瘤篩選及抗體檢測(cè)雜交瘤篩選用固相抗原間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法進(jìn)行包被陽(yáng)性抗原甲基化CW9/CpG的濃度為25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗體抗原反應(yīng)物由80 μ 1培養(yǎng)上清液+2 μ 1經(jīng)紫外分光光度計(jì)標(biāo)定濃度的甲基化CW9/CpG( 15 μ g/ml) 組成；檢測(cè)對(duì)照孔中的抗原部分則用20 μ 1抗原稀釋液(20%Me0H-PBS)代替；酶底物用鄰苯 ニ胺(OPD)；其它按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。6.抗體的特性測(cè)定方法抗體滴度用固相抗原間接非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定，測(cè)定條件為包被抗原為甲基化CW9/ CpG，濃度為25μβ/πι1，每孔加量150 μ 1 ；抗體從100倍開始對(duì)倍稀釋，每孔加量130μ 1 ； 抗體稀釋液為0. P/oBSA-PBS ；陰性對(duì)照孔用Sp-2 / 0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液；封閉液為1% BSA-PBS,每孔加量250 μ 1 ；酶底物用OPD ；酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Linbro公司。其它按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。7.檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抗原靈敏度先用期盼滴定法篩選出包被抗原濃度和抗體工作稀釋度的優(yōu)化組合，以此為測(cè)試條件，用固相抗原間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法作出抗原甲基化CW9/CpG 的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。其中ELISA測(cè)試條件為包被抗原甲基化 CW9/CpG的濃度問(wèn)哦5μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；抗體工作稀釋度為1:300000 ；抗體稀釋度為0. 1% BSA-PBS ；抗體抗原反應(yīng)液為每孔65 μ 1抗體+65 μ 1相應(yīng)濃度甲基化CW9/CpG ；封閉液為1% BSA-PBS，每孔加量250 μ 1 ；酶底物為OPD ；陰性對(duì)照用Sp_2 / 0骨髄瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液；酶標(biāo)板用美國(guó)Linbro板。其它按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。8.抗體的特異性用固相抗原剪輯競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定，參試陽(yáng)性抗原為甲基化才、陰性抗原非甲基化CW9/CpG、非特異性抗原MGMT基因CpG島(CpGisland)甲基化片段， P16基因CpG島(CpGisland)甲基化片段，HPPl基因CpG島(CpGisland)甲基化片段。其它測(cè)試條件同1。9.抗體亞類分析用免疫雙擴(kuò)散法進(jìn)行。10.抗體親和カ=Friguet法。對(duì)應(yīng)小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線滴定出抗體IgG含量，再對(duì)應(yīng)抗體滴度曲線求出平衡態(tài)下，抗體使抗原達(dá)到半飽和時(shí)的游離抗體克分子濃度[Ab]，帶入下式求出抗體的親和常數(shù)Ka(L/mol)
Ka = l/[Ab]
11.本發(fā)明生產(chǎn)單克隆抗體取得結(jié)果如下
細(xì)胞融合與雜交流細(xì)胞的篩選細(xì)胞融合后約有65. 孔長(zhǎng)出雜交流克隆，其中對(duì)陽(yáng)性抗體有反應(yīng)的約為77. 5%，對(duì)陰性抗體有反應(yīng)的為46. 7%。從中選擇出對(duì)陽(yáng)性抗體有強(qiáng)烈反應(yīng)同時(shí)對(duì)陰性抗體無(wú)反應(yīng)的孔，經(jīng)過(guò)多次亞克隆建立了 3個(gè)穩(wěn)定分泌抗甲計(jì)劃片段單克隆抗體的雜交流細(xì)胞株2B6，3E7，3H18。其中再經(jīng)過(guò)兩次亞克隆后，各個(gè)細(xì)胞株經(jīng)過(guò)兩次亞克隆陽(yáng)性率都達(dá)到了 100%，對(duì)陰性抗原的反應(yīng)率均為零。經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)定，選2B6為最佳克隆，做進(jìn)ー步的研究。抗體特性抗體滴度為7. 5x107 ；抗體檢測(cè)靈敏度為0. 005ng/ml ；
抗體的特異性陰性抗原通過(guò)固體抗原間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法經(jīng)過(guò)測(cè)定表明抗體與陰性抗原無(wú)交叉反應(yīng)，與其他非特異性抗原非甲基化片段無(wú)交叉反應(yīng)，且與其他非特異性抗原甲基化片段有弱交叉反應(yīng)，數(shù)值在0.04、. 12 (假設(shè)陽(yáng)性反應(yīng)為1) 抗體亞類分析為IgG3 抗體的親和カKa為8. 45xl09L/mol
12.血漿樣品的制備
使用乙ニ胺四乙酸一次性采血管(紫色頂?shù)腂ecton/Dickinson)采血。血漿必須在4 小時(shí)內(nèi)處理。對(duì)血漿1500 X g離心十分鐘，接著在不破壞白細(xì)胞層的情況下小心地移除血漿。血漿放在15 ml管里并再次1500 X g離心10分鐘。如果從每名患者得到了一管多的血漿，血漿合并在-SOoC的冷凍管里儲(chǔ)存。13.人體血漿游離DNA抽取本發(fā)明利用美國(guó)QIAGEN公司的Qia AMP DNA抽取試劑盒， 提取人體血漿游離DNA.
ニ、CW9甲基化片段免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定
a.化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的優(yōu)化由不同濃度的增強(qiáng)劑和組成底物工作液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值 (RLU)測(cè)定，進(jìn)行底物工作液的優(yōu)化。b.固相化抗體微孔板的制備將CW9甲基化單克隆抗體用0. 05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)稀釋成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被濃度，按 100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37°C封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度.
c.正常人游離DNA作為參考，確定用優(yōu)化好的HRP化學(xué)發(fā)光定量試劑對(duì)100份健康人標(biāo)本進(jìn)行濃度測(cè)定，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定正常游離DNA CW9甲基化片段參考范圍。d.化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)孔分別加25 μ L后，每孔再各加第二抗體75 yL，在震蕩器上混勻1 min，置37°C恒溫反應(yīng)60 min.洗掉游離成分，加入底物エ 作液50 yL，第10 min后測(cè)定各加樣品孔的發(fā)光值RLU，并將數(shù)據(jù)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀定量軟件 Luminoskan Ascent version 2· 4· 1 軟件&行定量分析。15.即時(shí)PCR測(cè)定CW9/CpG島片段的甲基化程度
把化學(xué)發(fā)光免疫階段測(cè)定的CW9/CpG島甲基化片段陽(yáng)性樣品DNA進(jìn)行即時(shí)PCR甲基化程度測(cè)定利用美國(guó)ABI即時(shí)PCR測(cè)定試劑盒，和甲基化片段測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。16.根據(jù)甲基化程度的高低曲線來(lái)判定樣品中是否含有腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明具有如下實(shí)用內(nèi)容
1.利用本發(fā)明所涉及的單克隆抗體檢測(cè)人體各種體液包括血液、唾液及其它的液體中的CW9基因中的CpG甲基化片段。2.利用本發(fā)明所涉及的單克隆抗體測(cè)定CW9基因CpG甲基化片段所得的中間結(jié)果再結(jié)合以往常規(guī)的方法來(lái)判定人體各項(xiàng)腫瘤包括直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等固體腫瘤以及白血病、淋巴癌等液體腫瘤的早期檢驗(yàn)，以及癌癥治療跟蹤等應(yīng)用。3.利用本發(fā)明所涉及的單克隆抗體作為對(duì)正常人進(jìn)行各種癌癥的早期篩查的中間指標(biāo)。4.利用本發(fā)明所涉及的單克隆抗體與即時(shí)PCR結(jié)合，進(jìn)行各種的癌癥篩查與檢驗(yàn)。5.本發(fā)明所涉及的單克隆抗體可以用于化學(xué)免疫發(fā)光或和普通酶標(biāo)法(ELISA) 以及其它的生化免疫方法測(cè)定CW9基因中的CpG甲基化片段。6.通過(guò)本發(fā)明涉及的單克隆抗體而測(cè)定的CW9基因中的CpG甲基化片段的結(jié)果， 除了在腫瘤檢測(cè)方面應(yīng)用，也可以運(yùn)用于非腫瘤鄰域的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過(guò)單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法的具體步驟如下(1)、制備單克隆抗體單克隆抗體利用下列試劑抗原CW9基因CpG島甲基化片段為陽(yáng)性抗原，CW9基因CpG島非甲基化片段為陰性抗原，非特異性抗原為=MGMT基因CpG島甲基化片段，P16基因CpG島甲基化片段，HPPl基因CpG島甲基化片段；其它特殊試劑弗氏完全佐計(jì)與弗氏不完全佐計(jì)，L-谷氨酰胺聚乙ニ醇-1000，14-四甲基15烷，鄰苯ニ胺，TRIS，HEPES緩沖劑，辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)兔抗BALB/c鼠檢驗(yàn)試劑盒其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭幻庖邉?dòng)物8周齡BALB/c雄性小鼠用陽(yáng)性抗原甲基化CW9/CpG進(jìn)行二次免疫；每只小鼠基礎(chǔ)免疫劑量為100 μ g，腹腔注射；24d后加強(qiáng)免疫，劑量為每只小鼠100 μ g，尾靜脈注射，4d后取脾融合；細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞Sp-2 / 0以10:1混合；用50%分子量為1000 聚乙ニ醇作融合劑，融合細(xì)胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5%C02，37°C條件下培養(yǎng)，7d后，每培養(yǎng)孔更換 2/3HT培養(yǎng)液；9d后，開始對(duì)鏡檢有雜交瘤克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化；腹水抗體純化用硫酸銨鹽析法純化腹水抗體；(2)、CW9甲基化片段免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定a.化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的優(yōu)化由SapphireII不同濃度的增強(qiáng)劑和成底物工作液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值測(cè)定，進(jìn)行底物工作液的優(yōu)化；b.固相化抗體微孔板的制備將上述制備的抗CW9甲基化片段單克隆抗體用0.05 mol/L、pH 為 9. 6 的碳酸鹽緩沖液稀釋成 1. 0，2. 0，5. 0，7. 0，10. 0，15. 0 μ g/mL 的包被濃度，按100 μ L/孔的量加入包被板中，37°C包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L、pH為7. 4的PBS 37°C封閉2 h后晾干備用，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度；c.以正常人游離DNA作為參考，確定用優(yōu)化好的HRP化學(xué)發(fā)光定量試劑對(duì)100份健康人標(biāo)本進(jìn)行濃度測(cè)定，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定正常游離DNA，CW9甲基化片段參考范圍；d.化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)孔分別加25μ L后，每孔再各加第二抗體 75 yL，在震蕩器上混勻1 min，置37°C恒溫反應(yīng)60 min.洗掉游離成分，加入底物工作液 50 yL，催化底物，第10 min后測(cè)定各加樣品孔的發(fā)光值RLU，并將數(shù)據(jù)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀Luminoskan Ascent version 2. 4. 1tfi^lf。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于將制備的單克隆抗體進(jìn)行雜交瘤篩選及抗體檢測(cè)，具體步驟如下雜交瘤篩選用固相抗原間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法進(jìn)行包被陽(yáng)性抗原甲基化CW9/CpG的濃度為25 μ g/ml，每孔加量150 μ 1 ；每孔所含抗體抗原反應(yīng)物由80 μ 1培養(yǎng)上清液+2 μ 1 經(jīng)紫外分光光度計(jì)標(biāo)定濃度的15μ g/ml的甲基化CW9/CpG組成；檢測(cè)對(duì)照孔中的抗原部分則用20μ l、20%Me0H-PBS的抗原稀釋液代替；酶底物用鄰苯ニ胺；其它按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)人體CW9基因中的CpG甲基化片段的方法，其特征在于該方法通過(guò)單克隆抗體和化學(xué)發(fā)光試劑聯(lián)用的方法進(jìn)行檢測(cè)CW9基因中的CpG甲基化片段，然后利用傳統(tǒng)的RT-PCR基因擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)上述CW9甲基化非陰性產(chǎn)品的樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，然后根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)及RT-PCR的檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)患者是否有早期直腸癌進(jìn)行綜合性的評(píng)定，以及進(jìn)行各種的癌癥篩查與檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102565406SQ20111025423
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者孫琦, 程澎, 賈世哲 申請(qǐng)人:孫琦, 程澎