專利名稱：：核重新編程因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有使分化的體細(xì)胞重新編程來誘導(dǎo)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的作用的核重新編程因子(nuclearreprogra咖ingfactor)。
背景技術(shù)：
：胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是由人和小鼠的初期胚建立的干細(xì)胞，具厶>的多能性的特征。人們期待利用該性質(zhì)將人ES細(xì)胞作為針對帕金森病、青少年糖尿病、白血病等多種疾病的細(xì)胞移植療法的來源。但是，存在著ES細(xì)胞的移植與臟器移植同樣會引起排斥反應(yīng)這樣的問題。而且，對于通過破壞人胚胎建立的BS細(xì)胞的利用，出于倫理的觀點的反對意見也很多。如果能夠誘導(dǎo)患者自身的分化體細(xì)胞脫分化，建立具有接近于ES細(xì)胞的多能性和增殖能力的細(xì)胞(該細(xì)胞在本說明書中被稱為"誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞"(iPS細(xì)胞)，但也存在被稱為"胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，，或"ES樣細(xì)胞"的情況)的話，則預(yù)期能夠利用它們作為沒有排斥反應(yīng)和倫理性問題的理想的多能性細(xì)胞。作為使體細(xì)胞核重新編程的方法，已報道了，例如，從將體細(xì)胞的核移植到卵細(xì)胞中制備的克隆胚中建立ES細(xì)胞的技術(shù)(W.S.Hwang等，Science,303，pp.1669-74，2004;W.S.Hwang等，Science,308，pp.1777-83，2005:但是，現(xiàn)已清楚了這些論文都是捏造的，而且已于日后撤下這些論文)。然而，這些技術(shù)只是為了建立ES細(xì)胞的目的而制備克隆胚，因此與使用不孕治療中產(chǎn)生的剩余胚的常規(guī)ES細(xì)胞相比，倫理的問題反而大。而且，現(xiàn)已報道了通過使體細(xì)胞與ES細(xì)胞相融合使體細(xì)胞核重新編程的技術(shù)(M.Tada等，Curr.Biol.，11，pp.1553-1558，2001;C.A.Cowan等，Science,309，pp.1369-73，2005)。但是，即使在該方法中也存在以下問題無法解決由于導(dǎo)致最終使用人ES細(xì)胞而產(chǎn)生的倫理性問題。而且，現(xiàn)已報道應(yīng)而使細(xì)胞核重新編程的技術(shù)(C.K.Taranger等，Mol,Biol.Cell,16，pp.5719-35，2005)。該方法，提取物中何種成分誘導(dǎo)重新編程完全不清楚，因此在技術(shù)的可靠性和安全性上存在問題。另一方面，提出了篩選具有使分化的體細(xì)胞重新編程來誘導(dǎo)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的作用的核重新編程因子的方法(國際公開W02005/80598)。該方法包括以下步驟使含有在受ECAT(EScellassociatedtranscript)基因(ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因群ES細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域的表達(dá)調(diào)節(jié)位置上存在標(biāo)記基因的基因的體細(xì)胞與被檢物質(zhì)相接觸、研究標(biāo)記基因表達(dá)細(xì)胞的出現(xiàn)的有無，選擇使該細(xì)胞出現(xiàn)的被檢物質(zhì)作為體細(xì)胞的核重新編程因子的候選物。而且，該出版物的實施例6等中公開了使體細(xì)胞重新編程的方法。但是，上述出版物中沒有公開實際上鑒定核重新編程因子的報告。專利文獻l國際公開W02005/80598
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于提供核重新編程因子。更具體的是，本發(fā)明的課題在于提供用于不利用卵細(xì)胞、胚和ES細(xì)胞而誘導(dǎo)分化細(xì)胞的重新編程，簡便且再現(xiàn)性強地建立具有與ES細(xì)胞同樣的多能性和增殖能力的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法。本發(fā)明者為了解決上述的課題進行了積極的研究，使用國際公開WO2005/80598中記載的核重新編程因子的篩選方法嘗試鑒定核重新編程因子。其結(jié)果是,發(fā)現(xiàn)了24種候選作為與核重新編程相關(guān)的基因，確認(rèn)了它們中的3種基因是核重新編程所必需的基因。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的。也就是，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種體細(xì)胞的核重新編程因子，其含有下述3種基因Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了含有下述3種基因0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的產(chǎn)物的上述因子。而且，根據(jù)其它的優(yōu)選方式還提供了還含有下述基因Sox家族基因的基因產(chǎn)物的上述因子，作為更優(yōu)選的方式，提供了含有Sox2的基因產(chǎn)物的上述因子。而且，如果根據(jù)其它的優(yōu)選方式，提供了含有細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子和Myc家族基因的基因產(chǎn)物共同存在、或代替Myc家族基因的基因產(chǎn)物。作為更優(yōu)選方式，提供了細(xì)胞因子為堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)的上述因子。如果根據(jù)特別優(yōu)選的方式，提供了除0ct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、和Sox家族基因的各基因的產(chǎn)物之外，還含有TERT基因的基因產(chǎn)物的體細(xì)胞的核重新編程因子；以及除了Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因，和TERT基因的各基因的產(chǎn)物之外，還含有從由下述的基因SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil構(gòu)成的組中選出的一種以上的基因產(chǎn)物的因子。除了這些因子，還提供了進一步含有選自于下組中的1種以上的基因的基因產(chǎn)物的上述的因子Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll和P-連環(huán)素(catenin)。而且，如果根據(jù)上述發(fā)明的其它優(yōu)選方式，還提供了進一步含有選自于下組中的l種以上的基因的基因產(chǎn)物的上述的因子，所述組為ECAT1、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rexl、UTF1、Stella、Stat3和Grb2。從其它的觀點出發(fā)，本發(fā)明提供了通過體細(xì)胞的核重新編程制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與體細(xì)胞接觸的步驟。如果根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了包括在體細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加上述的核重新編程因子的步驟的上述方法；包括在體細(xì)胞中導(dǎo)入編碼上述的核重新編程因子的基因的步驟的上述方法；包括使用含有至少1種以上的編碼上述核重新編程因子的基因的重組栽體將該基因?qū)塍w細(xì)胞中的步驟的上述方法；和使用從患者中采集的體細(xì)胞作為體細(xì)胞的上述方法。再從其它的觀點出發(fā)，本發(fā)明提供了由上述方法獲得的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。而且，本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)上述的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞分化而得到的體細(xì)胞。而且，根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種干細(xì)胞療法，該方法包括將對誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞進行分化誘導(dǎo)而獲得的體細(xì)胞移植到該患者中的步驟，所述誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞是通過使用從患者中分離和采集的體細(xì)胞用上述方法獲得的。而且，本發(fā)明還提供了使用對由上述方法獲得的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞進行分化誘導(dǎo)而獲得的各種細(xì)胞來評價化合物、藥物、毒物等的生理作用和毒性的方法。而且，本發(fā)明提供了一種改善細(xì)胞的分化能力和/或增殖能力的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與細(xì)胞接觸的步驟，以及提供了由上述方法獲得的細(xì)胞和對由上述方法獲得的細(xì)胞進行分化誘導(dǎo)而得到的體細(xì)胞。通過使用由本發(fā)明提供的核重新編程因子，不利用胚和ES細(xì)胞就可以簡便且再現(xiàn)性強地誘導(dǎo)分化細(xì)胞核的重新編程，可以建立與ES細(xì)胞具有同樣的分化和多能性和增殖能力的未分化細(xì)胞-誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。例如、使用本發(fā)明的核重新編程因子能夠由患者自身的體細(xì)胞制備具有高增殖能力和分化多能性的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞，通過使該細(xì)胞分化而獲得的細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞、胰島素產(chǎn)生細(xì)胞、或神經(jīng)細(xì)胞等)可以應(yīng)用于針對心力衰竭、胰島素依賴性糖尿病、帕金森病和脊髓損傷等多種疾病的干細(xì)胞移植療法中，由此可以回避使用人胚的倫理問題以及移植后的排斥反應(yīng)，因此極為有用。而且，可以使誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞分化的各種細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等)，作為用于評價化合物、藥物、毒物等的藥效和毒性的系統(tǒng)極為有用。附圖簡述圖1是表示使用在Fbxl5基因中敲入了Pgeo的小鼠的胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)的重新編程因子的篩選方法的圖。圖2是表示通過導(dǎo)入表1中所示的24個基因而獲得的iPS細(xì)胞的形態(tài)的照片。還顯示了分化細(xì)胞(MEF)和正常的胚胎干細(xì)胞(ES)的形態(tài)作為對照。圖3是表示iPS細(xì)胞中標(biāo)記基因的表達(dá)的圖。顯示了以從iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞和MEF細(xì)胞中提取的總RNA作為模板進行RT-PCR獲得的結(jié)果。圖4是表示iPS細(xì)胞中DM曱基化狀態(tài)的圖。對從iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞、和MEF細(xì)胞提取的基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，對目的DNA進行PCR擴增后，插入于質(zhì)粒。每個基因分離出IO個克隆的質(zhì)粒，測定序列。甲基化CpG用黑點表示，非甲基化CpG用白點表示。圖5是表示通過24個基因的群、和從24個基因的群中每次除去1個基因后的23個基因的群的導(dǎo)入獲得的G418細(xì)胞的克隆數(shù)的圖。圖下側(cè)表示G418選擇后一周內(nèi)獲得的集落數(shù)，圖上側(cè)表示3周內(nèi)獲得的集落數(shù)。當(dāng)除去用四方形圍起來的基因(基因的編號與表l所示的相同)時，完全沒有獲得集落，或是在3周后只發(fā)現(xiàn)少數(shù)集落。圖6是表示通過10個基因的群、和從10個基因的群中每次除去1個基因后的9個基因的群的導(dǎo)入而獲得的G418細(xì)胞的集落數(shù)的圖。除了#14、#15、或#20的各基因時一個集落都沒有獲得。當(dāng)除去#22的基因時，獲得了少數(shù)的G418抗性集落，但是細(xì)胞呈現(xiàn)出分化的形態(tài)，其明顯與iPS細(xì)胞不同。圖7是表示由IO個基因的群、4個基因的群、3個基因的群、或2個基因的群產(chǎn)生的G418抗性集落(重新編程集落)的出現(xiàn)數(shù)的圖。顯示了各集落的代表性形態(tài)及大小。圖8是表示對將MEF來源的iPS細(xì)胞移植到棵鼠皮下形成的腫瘤進行蘇木精-曙紅(H&E)染色的結(jié)果的照片。發(fā)現(xiàn)了三胚層系向各種組織的分化。圖9是表示通過將成體皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞移植到小鼠胚泡中，移植到假孕小鼠的子宮中制備的胎兒的照片。由上圖可知在左側(cè)的胎兒中來源于iPS細(xì)胞的細(xì)胞(發(fā)出綠色熒光)分布于全身。在下圖中清楚了同一胎兒的心臟、肝臟、脊髄的幾乎全部細(xì)胞為GFP陽性，其源于iPS細(xì)胞。圖10是表示通過RT-PCR確認(rèn)ES細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)的結(jié)果的照片。圖中，Sox2minus表示在MEF中導(dǎo)入3個基因而建立的iPS細(xì)胞，4ECAT表示在MEF中導(dǎo)入4個基因而建立的iPS細(xì)胞，IOECAT表示在MEF中導(dǎo)入10個基因而建立的iPS細(xì)胞，IOECAT皮膚成纖維細(xì)胞表示在皮膚成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入10個基因而建立的iPS細(xì)胞，ES細(xì)胞表示小^LES細(xì)胞，MEF表示沒有進行基因?qū)氲腗EF細(xì)胞。其下的編號表示克隆編號。圖11是表示在由MEF建立iPS細(xì)胞中bFGF的效果的圖。在常規(guī)的飼養(yǎng)細(xì)胞(ST0細(xì)胞)(左)和導(dǎo)入了bFGF表達(dá)載體的ST0細(xì)胞(右)上培養(yǎng)的Fbxl5"e"^。小鼠來源的MEF中通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個因子(上部分)或c-Myc以外的3個因子(下部分)。2周內(nèi)通過G418進行選擇，經(jīng)晶體藍(lán)染色后，拍照。數(shù)字表示集落數(shù)。圖12是對采用Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的實驗進行說明的圖。A.分離在中心含有小鼠Nanog基因的大腸桿菌人工染色體(BAC)，在Nanog的編碼環(huán)形區(qū)域的上游通過重組插入EGFP-IRES-Puro盒。B.用改良的BAC制備轉(zhuǎn)基因小鼠。發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)局限于胚泡的內(nèi)細(xì)胞團塊和生殖腺中。圖13M示對使用Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的實騶ii行說明的圖。從Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的胎兒(受精后13.5日)中除去頭部、內(nèi)臟和生殖腺，建立MEF。用細(xì)胞分選器進行分析的結(jié)果是，即使在Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠來源的MEF(Nanog)中，與Fbxl5P一^。小鼠來源的MEF(Fbxl5)和野生型小鼠來源的MEF(Wild)同樣，幾乎不存在GFP陽性細(xì)胞。圖14是由Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠MEF(左)和Fbxl5Pgeo/"eo小鼠MEF(右)建立的iPS細(xì)胞的照片。分別用嘌呤霉素和G418進行選擇。圖15是表示iPS細(xì)胞的增殖的結(jié)果的圖。表示將ES細(xì)胞、Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠MEF(左)來源的iPS細(xì)胞(NanogiPS)和Fbxl5"e。"ge。小鼠MEF來源的iPS細(xì)胞(FbxiPS)各10萬個分別接種于24孔板中，每3天進行一次傳代，測定細(xì)胞數(shù)的結(jié)果。數(shù)字表示加倍時間的平均。圖16是表示iPS細(xì)胞的基因表達(dá)的圖。用RT-PCR分析標(biāo)記基因在MEF、ES細(xì)胞、Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠MEF(左)來源的iPS細(xì)胞(NanogiPS)和Fbxl5"e°/ege、J、鼠MEF來源的iPS細(xì)胞(FbxiPS)中的表達(dá)。下面的數(shù)字表示傳代數(shù)。圖17是表示由NanogiPS細(xì)胞形成畸胎瘤的圖。顯示在棵鼠的背部皮下注射100萬個ES細(xì)胞或NanogiPS細(xì)胞，3周后產(chǎn)生的腫瘤的外觀(左)和組織圖像(右H&E染色)。圖18是表示用NanogiPS細(xì)胞制備嵌合體小鼠的圖。將NanogiPS細(xì)胞(克隆NPMF4EK-24，傳代數(shù)6)移植于胚泡中，誕生出嵌合體小鼠。由90個移植胚誕生出4只嵌合體小鼠。圖19是表示由NanogiPS細(xì)胞出發(fā)的種系傳遞(germlinetransmission)的圖。對通過圖18所示的嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠的交配所誕生的小鼠進行基因組DM的PCR分析時，根據(jù)在所有的小鼠中存在0ct3/4和Klf4的轉(zhuǎn)基因，確認(rèn)了種系傳遞。圖20是表示由iPS細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的圖。顯示由來源于皮膚成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞在體外分化成的神經(jīng)細(xì)胞(上微管蛋白陽性)、寡突膠質(zhì)細(xì)胞(左04陽性)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(右GFAP陽性)。圖21是表示對不使用藥物選擇的iPS細(xì)胞的建立進行說明的圖。在每個10cm皿中接種1萬至10萬個MEF，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個因子。對照(Mock)中沒有產(chǎn)生集落(左)，而導(dǎo)入了4個因子的皿中，除了扁平的轉(zhuǎn)化集落，還獲得了與膨脹的iPS細(xì)胞相類似的集落(中央)。一旦將這些細(xì)胞傳代培養(yǎng)，就獲得了與iPS細(xì)胞相類似的細(xì)胞(右)。圖22是表示通過無藥物篩選建立的細(xì)胞的基因表達(dá)的圖。從圖21中所示的建立的細(xì)胞中提取RNA，用RT-PCR分析ES細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。圖23是表示人成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞樣細(xì)胞的圖。顯示了通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個因子的人同源基因?qū)胗谌颂簛碓吹某衫w維細(xì)胞中而獲得的集落(左)、和2次傳代后的細(xì)胞(右)。圖24是表示由人成體皮膚成纖維細(xì)胞建立iPS細(xì)胞的圖。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將左邊部分所示的因子導(dǎo)入到用慢病毒感染了小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的人成體皮膚成纖維細(xì)胞中。照片表示病毒感染后第8天的相位差圖像(物鏡x10)。用于實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的核重新編程因子的特征在于含有下述3種基因Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物，在優(yōu)選方式中，特征在于除了上述的3種基因之外還含有Sox家族基因的基因產(chǎn)物。作為確認(rèn)本發(fā)明的核重新編程因子的方法，可以利用例如、國際公開W02005/80598中記栽的核重新編程因子的篩選方法。通過參照上述出版物的所有公開的內(nèi)容，包含于本說明書的公開內(nèi)容中。本領(lǐng)域人員參照上述出版物篩選核重新編程因子，可以確認(rèn)本發(fā)明的重新編程因子的存在和作用。例如，可以利用Fbxl5基因座中敲入了Pgeo(P半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的小鼠作為容易觀察重新編程現(xiàn)象的實驗系統(tǒng)。詳細(xì)內(nèi)容示于本說明書的實施例中。小鼠Fbxl5基因是在ES細(xì)胞和早期胚等的分化多能性細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。在小鼠Fbxl5基因中敲入pgeo的且缺失Fbxl5的功能的同源變異小鼠中，通常沒有觀察到包括分化多能性或發(fā)生在內(nèi)的異常的表現(xiàn)型。在該小鼠中，egeo受到Fbxl5基因的增強子和啟動子的表達(dá)控制，0geo在分化的體細(xì)胞中不表達(dá)，顯示出對G418的敏感性。另一方面，敲入了Pgeo的同源變異ES細(xì)胞顯示出對極高濃度(12mg/ml以上)的G418的抗性。利用該現(xiàn)象，可以構(gòu)建使體細(xì)胞的重新編程可視化的實驗系統(tǒng)。利用上述實驗系統(tǒng)，可以首先從敲入了Pgeo的同源變異小鼠的胎兒(受精后13.5天)中分離成纖維細(xì)胞(Fbxl5^"^。的MEF)。由于MEF不表達(dá)Fbxl5基因，因此也不表達(dá)Pgeo，表現(xiàn)出對G418的敏感性?？墒?，一旦該MEF與沒有進行基因操作的ES細(xì)胞(仍然呈現(xiàn)對G418的敏感性)相融合，MEF的核進行重新編程的結(jié)果是，表達(dá)Pgeo而形成G418抗性。因此，通過利用該實驗系統(tǒng)，可以置換成G418抗性使重新編程現(xiàn)象可視化。可以使用上述的實驗系統(tǒng)選擇核重新編程因子。作為與核重新編程因子相關(guān)的基因的候選物，選擇出多個顯示出在ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因和提示在ES細(xì)胞的分化多能性維持中起重要作用的基因，通過這些候選物單獨或適當(dāng)組合可以確認(rèn)是否引出核重新編程。例如，通過組合所有的選擇出的初次候選物，確認(rèn)可以將分化細(xì)胞重新編程誘導(dǎo)至接近ES細(xì)胞的狀態(tài)后、制備從前述組合中每次除去1個基因的組合，確認(rèn)同樣的作用，可以選擇該基因不存在時重新編程誘導(dǎo)能力減弱，或重新編程誘導(dǎo)能力喪失的二次候選物。對于這樣選擇出的二次候選物，通過重復(fù)同樣的步驟，可以選擇出必需的核重新編程基因的組合，可以確認(rèn)Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的3種基因的基因產(chǎn)物的組合作為核重新編程因子起作用，除了這3種基因的基因產(chǎn)物，還可以確認(rèn)Sox家族基因的基因產(chǎn)物的組合作為核重新編程因子具有極好的性質(zhì)。核重新編程因子的選擇方法的具體例子具體示于本說明書的實施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上述的一般的說明和實施例的具體性說明可以容易地確認(rèn)這3種基因的組合誘導(dǎo)體細(xì)胞的重新編程，和這3種基因產(chǎn)物的組合對于核重新編程是必需的。由本發(fā)明提供的核重新編程因子至少含有Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物的組合，包括例如Oct3/4、Klf4和c-Myc這3種基因的基因產(chǎn)物的組合。作為Oct家族基因，可以例舉例如0ct3/4、0ctlA和0ct6等。Oct3/4是屬于POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報道其是未分化標(biāo)記(K.Okamoto等，Cell,60，pp461-72，1990)。而且，還有報告指出Oct3/4與多能性維持相關(guān)(J.Nichols等，Cell,95，pp379-91，1998)。作為Klf家族基因，可以例舉Klfl、Klf2、Klf4和Klf5等。據(jù)報道Klf4(Kruppellikefactor-4)是腫瘤抑制因子(A.M.Ghaleb等，CellRes.，15，pp92-62005)。作為Myc家族基因，可以例舉c-Myc、N-Myc和L-Myc等。有報道指出c-Myc是與細(xì)胞的分化和增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄控制因子(S.Adhikary，M.Eilers,Nat.Rev.Mol.CellBiol.，6,pp635-45,2005)，且與多能性維持相關(guān)(P.Cartwright等，Development,132，pp885-96,2005)。0ct3/4、Klf4和c-Myc以外的各家族基因的NCBI登錄號如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>了在本發(fā)明中利用上述基因產(chǎn)物，可以使用任意哺乳類動物來源(例如小鼠、大鼠、牛、綿羊、馬、猴等的哺乳類動物來源)的基因。而且，除了野生型的基因產(chǎn)物外，還可以利用取代、插入和/或缺失了多個(例如1~10個、優(yōu)選1~6個、更優(yōu)選1~4個、更優(yōu)選1~3個、特別優(yōu)選1或2個)氨基酸的，且與野生型的基因產(chǎn)物具有同樣功能的變異基因產(chǎn)物。例如，除了野生型之外還可以使用穩(wěn)定型(T58A)等作為c-Myc的基因產(chǎn)物。對于其它的基因產(chǎn)物也是同樣。本發(fā)明的核重新編程因子，除了上述3種基因產(chǎn)物之外，可以包括其它的基因產(chǎn)物。作為這樣的基因產(chǎn)物，可以例舉Sox家族基因的基因產(chǎn)物。作為Sox家族基因，可以例舉，例如Soxl、Sox3、Sox7、Soxl5、Soxl7、和Soxl8、優(yōu)選Sox2。至少包括0ct家族基因(例如Oct3/4)、Klf家族基因(例如Klf4)、Myc家族基因(例如c-Myc)和Sox家族基因(例如Sox2)這4種基因的基因產(chǎn)物的組合的核重新編程因子，從重新編程的效率的觀點出發(fā)是本發(fā)明的優(yōu)選方式，尤其是為了獲得多能性，存在優(yōu)選組合Sox家族基因的基因產(chǎn)物的情形。Sox2在初期發(fā)生過程中表達(dá)，是編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因(A.A.Avilion等，GenesDev.，17，ppl26-40，2003)。Sox2以外的Sox家族基因的NCBI登錄號如下所示，表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>而且，Myc家族基因的基因產(chǎn)物存在可以被細(xì)胞因子替代的情況。作為細(xì)胞因子，例如，優(yōu)選SCF或bFGF等，但不僅限于此。作為更優(yōu)選方式，除了上述3種基因產(chǎn)物、優(yōu)選上述4種基因產(chǎn)物外，還可以列舉誘導(dǎo)細(xì)胞的永生的因子。例如，可以列舉包括TERT基因的基因產(chǎn)物的因子，與包括選自于下述基因中的l種以上的基因的基因產(chǎn)物的因子的組合SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil。TERT是DNA復(fù)制時用于維持染色體末端端粒結(jié)構(gòu)所必需的，在人中的干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，但是在許多體細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)(I.Horikawa，等，ProcNatlAcadSciUSA.102，ppl8437-442，2005)。據(jù)報道，SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7或Bmil通過與大T抗原組合，導(dǎo)致人體細(xì)胞的永生(S.Akimov等，StemCells,23，ppl423-1433，2005;P.Salmon等，Mol.Ther.，2，pp404-414，2000)。這些因子，尤其是在由人細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時極為有用。TERT和Bmil基因的NCBI登錄號如下所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>而且，還可以組合選自于下述基因中的l種或2種以上的基因的基因產(chǎn)物Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll和P-連環(huán)素。出于重新編程的效率的觀點，作為特別優(yōu)選的方式，可以例舉含有將Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll和P-連環(huán)素的基因產(chǎn)物與上述4種基因產(chǎn)物組合的共計10種基因產(chǎn)物的核重新編程因子。有報道指出Fbxl5(Y.Tokuzawa等，MolCellBiol.,23，卯2699-708，2003)、Nanog(K.Mitsui等，Cell,113，pp631-42，2003)、ERas(K.Takahashi，K.Mitsui,S.Yamanaka，Nature,423，pp541-5，2003)和ECAT15-2(A.Bortvin等，Development,130，ppl673-80，2003)為ES細(xì)胞特異性表達(dá)基因，Tcll與Akt的活性化相關(guān)(A.Bortvin等，Development,130，ppl673-80，2003)、J3-連環(huán)素為Wnt信號傳遞途徑的重要構(gòu)成因子，與多能性維持相關(guān)(N.Sato等，Nat.Med,，10，pp55-63，2004)。而且，本發(fā)明的核重新編程因子還可以含有例如、選自于選自于由下述的基因構(gòu)成的組中的l種以上的基因的基因產(chǎn)物ECATl、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rexl、UTF1、Stella、Stat3和Grb2。ECAT1、Esgl、ECAT8、Gdf3和ECAT15-1為ES細(xì)胞特異性表達(dá)基因(K.Mitsui等，Cell,113，pp631-42，2003)、Dnmt3L是DNA甲基化酶相關(guān)因子，Soxl5是在初期發(fā)生過程中表達(dá)編碼轉(zhuǎn)錄因子的一組基因(M.Maruyama等，JBiolChem,，280pp24371-9，2005)。Fthll7編碼鐵蛋白重鏈多肽-樣17(A.colLoriotT.Boon,C.DeSmet，IntJCancer,105，pp371-6，2003)，Sal14編碼在胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)的鋅指蛋白質(zhì)(J.Kohlhase等，CytogenetGe謹(jǐn)eRes.,98，pp274-7，2002)、Rexl編碼存在于Oct3/4下游的轉(zhuǎn)錄因子(E.Ben-Shushan，J.R.Thompson,L.J.Gudas，Y.Bergman,MolCellBiol.，18，ppl866-78，1998)。有報道指出UTF1是位于0ct3/4下游的轉(zhuǎn)錄輔助因子，一旦抑制它就抑制ES細(xì)胞的增殖(A.0kuda等，EMB0J.,17，pp2019-32，1998)。Stat3是細(xì)胞增殖'分化的信號因子，通過Stat3的活性化，激起LIF的運作，對多能性維持起重要的作用(H.Niwa，T.Burdon，I.Chambers,A.Smith,GenesDev.,12,pp2048-60，1998)。Grb2編碼存在于細(xì)胞膜的各種成長因子受體和Ras/MAPK級聯(lián)之間進行介導(dǎo)的蛋白質(zhì)(A.M.Cheng等，Cell,95，pp793-803，1998)。不過，可以包含于本發(fā)明的核重新編程因子的基因產(chǎn)物不限于上述具體說明的基因的基因產(chǎn)物。本發(fā)明的核重新編程因子中，除了可以作為核重新編程因子起功能的其它基因產(chǎn)物之外，還可以包括1或2種以上的與分化、發(fā)生或增殖等相關(guān)的因子或具有其它生理活性的因子，當(dāng)然這樣的實施方式也應(yīng)理解為包含于本發(fā)明的范圍中?？梢宰鳛楹酥匦戮幊桃蜃悠鹱饔玫钠渌虍a(chǎn)物，可以使用例如、只使Oct3/4、Klf4和c-Myc這3種基因中的1種或2種表達(dá)的體細(xì)胞，通過篩選可以誘導(dǎo)該細(xì)胞的核重新編程的基因產(chǎn)物進行鑒定。通過本發(fā)明提供了上述篩選方法作為新的核重新編程因子的篩選方法。而且，包含于本發(fā)明的核重新編程因子的基因產(chǎn)物除了例如由上述基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)自身之外，還可以是該蛋白質(zhì)與其它的蛋白質(zhì)或肽等的融合基因產(chǎn)物的形態(tài)。例如，還可以使用與綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的融合蛋白質(zhì)或與組氨酸標(biāo)簽等肽的融合基因產(chǎn)物。而且，制備與來源于HIV病毒的TAT肽的融合蛋白質(zhì)，通過使用該融合蛋白質(zhì)，可以促進細(xì)胞膜對于核重新編程因子的細(xì)胞內(nèi)攝取，可以回避基因?qū)氲葟?fù)雜的操作，只在培養(yǎng)基中添加融合蛋白質(zhì)就可以誘導(dǎo)重新編程。這種融合基因產(chǎn)物的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)目的，可以容易地設(shè)計適當(dāng)?shù)娜诤匣虍a(chǎn)物并進行制備。使用本發(fā)明的核重新編程因子，使體細(xì)胞的核重新編程，可以獲得誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。本說明書中所謂"誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞"是具有接近于ES細(xì)胞的性質(zhì)的細(xì)胞，更具體的是，包含一種未分化的且具有多能性和增殖能力的細(xì)胞，但該用語無論在何種意思中都不是限定性解釋，需要最廣義的解釋。對于使用核重新編程因子制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，在國際公開W02005/80598中已有說明(上述公報中使用了ES樣細(xì)胞這樣的用語)、誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的分離方法也有具體的說明。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過參照上述出版物，可以使用本發(fā)明的核重新編程因子容易地制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。對使用本發(fā)明的核重新編程因子由體細(xì)胞制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法沒有特別的限定，如果在體細(xì)胞和誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞可以增殖的環(huán)境中核重新編程因子可以與體細(xì)胞接觸，可以采用任意一種方法。例如，可以在培養(yǎng)基中添加包舍于本發(fā)明的核重新編程因子中的基因產(chǎn)物，或還可以采用使用含有可以表達(dá)本發(fā)明的核重新編程因子的基因的載體將該基因?qū)塍w細(xì)胞中等方法。使用這種栽體時，通過在栽體中整合2種以上的基因，也可以使各個基因產(chǎn)物在體細(xì)胞中同時表達(dá)。在應(yīng)當(dāng)重新編程的體細(xì)胞中，包含于本發(fā)明的核重新編程因子中的基因產(chǎn)物中的l種或2種以上已經(jīng)表達(dá)時，可以從本發(fā)明的核重新編程因子中除去該基因產(chǎn)物，這樣的實施方式也應(yīng)理解為包含于本發(fā)明的范圍中。使用本發(fā)明的核重新編程因子制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞時，對應(yīng)當(dāng)重新編程的體細(xì)胞的種類沒有特別的限定，可以使用任意的體細(xì)胞。例如、除了胎兒期的體細(xì)胞之外，也可以使用成熟的體細(xì)胞。在疾病的治療中使用誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞時，理想的是使用從患者中分離的體細(xì)胞，例如，可以使用與疾病相關(guān)的體細(xì)胞或與疾病治療相關(guān)的體細(xì)胞等。對按照本發(fā)明的方法選擇在培養(yǎng)基中出現(xiàn)的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法沒有特別的限定，例如，可以適當(dāng)采用使用藥物抗性基因等作為標(biāo)記基因，以藥物抗性作為指標(biāo)分離誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞等的公知的方法?？梢跃S持ES細(xì)胞的未分化性和多能性的培養(yǎng)基或不能維持該性質(zhì)的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中已知有多種，通過組合使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，可以有效分離誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。通過利用對于ES細(xì)胞廣泛使用的確認(rèn)手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確認(rèn)分離的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的分化能力和增殖能力。對用本發(fā)明的方法制備的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的用途沒有特別的限定，可以在使用BS細(xì)胞進行的所有的試驗'研究和使用ES細(xì)胞的疾病的治療等中進行利用。例如，通過用視黃酸、EGF等增殖因子、或糖皮質(zhì)激素等處理由本發(fā)明的方法獲得的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞，可以誘導(dǎo)所希望的分化細(xì)胞(例如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血細(xì)胞等)，通過將這樣獲得的分化細(xì)胞返回到患者中的自身細(xì)胞移植可實現(xiàn)干細(xì)胞療法。然而，本發(fā)明的誘導(dǎo)式多能性千細(xì)胞的用途不限于上述的特定的方式。實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明的范圍不受下述實施例的限定。例1:重新編程因子的選擇為了鑒定重新編程因子，需要容易地觀察重新編程現(xiàn)象的實驗系統(tǒng)。作為實驗系統(tǒng)，利用在Fbxl5基因座中敲入了Pgeo(P半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的小鼠。小鼠Fbxl5基因是在ES細(xì)胞和初期胚等分化多能性細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。然而，在小鼠Fbxl5基因中敲入了pgeo的、缺失Fbxl5功能的同源變異小鼠中沒有觀察到包括分化多能性和發(fā)生在內(nèi)的異常的表現(xiàn)型。在該小鼠中，Pgeo受到Fbxl5基因的增強子和啟動子的表達(dá)控制。也就是，Pgeo在分化的體細(xì)胞中不表達(dá)，對G418顯示出敏感性。一方面，敲入了Pgeo的同源變異ES細(xì)胞對極高濃度(12mg/ml以上)的G418顯示出抗性。利用該現(xiàn)象，構(gòu)建使體細(xì)胞的重新編程可視化的實驗系統(tǒng)。上述實驗系統(tǒng)中，首先從敲入了Pgeo的同源變異小鼠的胎兒(受精后13.5日)中分離成纖維細(xì)胞(Fbxl5"e"e"。的MEF)。由于MEF不表達(dá)Fbxl5基因，因此也不表達(dá)Pgeo，對G418顯示出敏感性。另一方面，一旦該MEF與不進行基因操作的ES細(xì)胞(仍然呈現(xiàn)對G418的敏感性)相融合，MEF的核進行重新編程的結(jié)果是，表達(dá)Pgeo而形成G418抗性。也就是，通過該實驗系統(tǒng)，可以使重新編程現(xiàn)象可視化為G418抗性(國際公開W02005/80598)。使用上述實驗系統(tǒng)進行重新編程因子的探索(圖1)，選擇出在ES細(xì)胞中顯示特異性表達(dá)的基因、和提示在ES細(xì)胞的分化多能性維持中有重要作用的基因共計24種作為重新編程因子的候選物。這些基因示于下表4和表5中。而且，就#21的P-連環(huán)素和#22的c-Myc而言，使用了活性型的變異體(連環(huán)素S33Y，c-Myc:T58A)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5NCBI登錄號<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體pMX-gw中通過Gateway技術(shù)插入這些基因的cDNA。首先使24個基因一個一個地感染Fbxl5"e。^e。的MEF，然后，在ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下進行G418選擇。然而，G418抗性集落一個都沒有獲得。接著，使所有24個基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒同時感染Fbxl5e—"6。的MEF。在ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下進行G418選擇時，獲得了多個藥物抗性集落。分離這些集落繼續(xù)培養(yǎng)。這些細(xì)胞可以長期培養(yǎng)，而且清楚地顯示出與ES細(xì)胞類似的形態(tài)(圖2)。圖中，iPS細(xì)胞表示誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞(也稱為ES樣細(xì)胞、ES-like細(xì)胞、ESL細(xì)胞)，ES表示胚胎干細(xì)胞，MEF表示分化細(xì)胞(胎兒成纖維細(xì)胞)通過RT-PCR研究標(biāo)記基因的表達(dá)，Nanog、Oct3/4等的未分化標(biāo)記表達(dá)了(圖3)。清楚了Nanog的表達(dá)接近于ES細(xì)胞，但Oct3/4的表達(dá)比ES細(xì)胞低。而且，通過亞硫酸鹽測序法確認(rèn)了DNA曱基化狀態(tài)，清楚了Nanog基因和Fbxl5基因在MEF中處于高甲基化狀態(tài)，但在iPS細(xì)胞中被脫甲基化(圖4)。印記(imprinting)基因-IGF2基因在MEF和iPS細(xì)胞這兩者中約50%被曱基化。已知收集了Fbxl5Pge°/Pge°的MEF，受精后13.5天的原始生殖細(xì)胞中失去印記記憶的IGF2基因幾乎被完全脫甲基化，因此得出了iPS細(xì)胞不是來源于混入Fbxl5"^"。。的MEF中的原始生殖細(xì)胞的結(jié)論。根據(jù)以上結(jié)果，表示通過24種因子的組合，可以將分化細(xì)胞(MEF)重新編程誘導(dǎo)成接近于ES細(xì)胞的狀態(tài)。然后，對所有24種基因?qū)τ谥匦戮幊淌欠癖匦柽M行了研究。使每次除去1個基因的23個基因感染Fbxl5"e""e。的MEF。其結(jié)果清楚了，對于10個基因，除去它們的時候，抑制集落的形成(圖5:基因的編號對應(yīng)于表4中所示的基因的編號，#3、#4、#5、#11、#14、#15、#18、#20、#21、和#22這10種基因)。使這10種基因同時感染Fbxl5^"""的MEF時，結(jié)果，與使24種基因同時感染時相比，顯著更有效地獲得了G418抗性集落。進而，使這10個基因中每次除去1個基因的9個基因感染Fbx15"e。me。的MEF。其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)分別除去4種基因(#14、#15、#20、或#22)時，沒形成G418抗性的iPS細(xì)胞集落(圖6)。因此提示，10個基因中，這4種基因?qū)τ谥匦戮幊陶T導(dǎo)來說起到了特別重要的作用。例2:通過4種基因群的組合進行的重新編程誘導(dǎo)對10種基因中提示有特別重要性的4個基因是否可以誘導(dǎo)體細(xì)胞的重新編程進行了研究。在Fbxl5基因中敲入了Pgeo的MEF的細(xì)胞中，使用上述10種基因的組合、上述4種基因的組合、上述4種中的僅3種基因的組合和上述4種中的僅兩種基因的組合，將這些基因組合(geneset)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入體細(xì)胞中。其結(jié)果是在導(dǎo)入了4種基因時獲得了160個G418抗性集落。盡管該結(jié)果與導(dǎo)入10種基因時的結(jié)果(179個集落)幾乎數(shù)量相同，但是導(dǎo)入4個基因時，集落比導(dǎo)入10個基因時要小。而且，傳代培養(yǎng)這些集落時，呈現(xiàn)iPS細(xì)胞的形態(tài)的集落，在導(dǎo)入10個基因時，在12個克隆中有9個克隆，與之相對，在導(dǎo)入4個基因時，12個克隆中有7個克隆，存在某種程度減少的傾向。作為4個基因，無論是小鼠來源的基因還是人來源的基因中都獲得了數(shù)目幾乎相同的iPS細(xì)胞。導(dǎo)入從上述4個基因中選擇出的3個基因時，有個組合(#14、#15和#20)中獲得了36個扁平的集落，但是即使傳代培養(yǎng)也沒有觀察到iPS細(xì)胞。其它的組合(#14、#20、和#22)中獲得了54個小集落。這些集落中，對較大的6個集落進行次傳代培養(yǎng)時，所有6個克隆都獲得了與ES細(xì)胞類似的細(xì)胞。然而，如果與ES細(xì)胞相比，認(rèn)為細(xì)胞與細(xì)胞之間以及與培養(yǎng)皿的粘附弱。而且，細(xì)胞增殖的速度，與導(dǎo)入4個基因的情況相比要慢。而且，從4個基因中選擇出3個基因的其它的2組組合中分別形成了各1個集落，但是即使傳代培養(yǎng)也沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖。從4個基因中選擇出的2個基因的組合(組合6)中，每一種情況連1個G418抗性集落都沒有形成。以上結(jié)果示于圖7。而且，圖10中，表示了通過RT-PCR確認(rèn)ES細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)的結(jié)果。方法的詳細(xì)內(nèi)容如下所示。,從向Fbxl5^"^。的MEF中導(dǎo)入3個基因(0ct3/4、Klf4和c-Myc、表示為Sox2minus)、4個基因(除3個基因之外還加上了Sox2，表示為4ECAT)、IO個基因(除了4個基因之外還加上了表l的#3、#4、#5、#11、#18、#21，表示為10ECAT)所建立的iPS細(xì)胞、在有其Fbxl5基因中敲入了^geo的成體小鼠的尾部皮膚而建立的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入IO個基因所建立的iPS細(xì)胞(表示為10ECAT皮膚成纖維細(xì)胞)、從小鼠ES細(xì)胞和沒有導(dǎo)入基因的MEF細(xì)胞中純化總RNA，通過DNaseI處理除去混入的基因組DNA。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備第一鏈cDNA,通過PCR研究ES細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。而且，對于0ct3/4、Nanog、ERas，使用不對來自導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒，而只對來自內(nèi)源性基因擴增轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的引物進行PCR。引物序列示于表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>根據(jù)此圖中所示的結(jié)果，清楚了導(dǎo)入3個基因時，ERas和Fgf4被有效誘導(dǎo)表達(dá)，但不引起多能性維持所必需的因子-0ct3/4與Nanog的誘導(dǎo)，或者即使引起也非常弱。另一方面，導(dǎo)入4個基因時，在檢測的4個克隆中，存在有一個Oct3/4和Nanog被較強誘導(dǎo)的克隆(#7)。進而，在導(dǎo)入10個基因時，研究的5個克隆中，3個克隆中發(fā)現(xiàn)了0ct3/4和Nanog的強i秀導(dǎo)。根據(jù)這些結(jié)果清楚了，為了重新編程，至少3個基因的組合(#14、#20、和#22)是必需的，在含有這3種基因的4個基因群和10個基因群中隨著基因的數(shù)目增加，重新編程的效率上升。例3:重新編程的細(xì)胞的多分化能力的分析為了評價建立的iPS細(xì)胞的分化多能性，將通過24個因子、10個因子和4個因子建立的iPS細(xì)胞移植到棵鼠的皮下。其結(jié)果是，在所有例子中均形成了與ES細(xì)胞同樣大小的腫瘤。以組織學(xué)觀察，腫塊由多種細(xì)胞構(gòu)成，確認(rèn)有軟骨組織、神經(jīng)組織、肌肉組織、脂肪組織和腸道樣組織(圖8)，因此證明了iPS細(xì)胞的多能性。另一方面，一旦將由3個因子建立的細(xì)胞移植到棵鼠中就形成腫瘤，其只由組織學(xué)上未分化細(xì)胞形成。因而清楚了，為了誘導(dǎo)分化多能性，Sox家族是必需的。例4:源于成體小鼠的尾部的成纖維細(xì)胞的重新編程將用小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)鑒定的4個因子導(dǎo)入來源在Fbxl5基因中敲入Pgeo且在全身表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的成體小鼠的尾部的成纖維細(xì)胞。然后，在祠養(yǎng)細(xì)胞上，在與ES細(xì)胞培養(yǎng)條件相同的條件下進行培養(yǎng)，通過G418進行選擇。藥物選擇開始后約2周內(nèi)獲得了多個iPS細(xì)胞集落。一旦將這些細(xì)胞移植到棵鼠的皮下，就形成了三胚層系的各種組織構(gòu)成的畸胎瘤。而且，將來源于成體皮膚成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞移植到胚泡中，移植到假孕小鼠的子宮中，結(jié)果在受精后第13.5天的胚中發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞分布于全身(圖9)。這表明iPS細(xì)胞具有多能性，對小鼠胚胎形成有作用。該結(jié)果表明鑒定的因子群不止對胎兒期的體細(xì)胞而且對成熟的小鼠的體細(xì)胞都具有誘導(dǎo)重新編程的能力。在成體皮膚來源的細(xì)胞中可以重新編程誘導(dǎo)這一點在實用性上極為重要。例5研究iPS細(xì)胞建立中細(xì)胞因子的影響。在伺養(yǎng)細(xì)胞(ST0細(xì)胞)中導(dǎo)入堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)或千細(xì)胞因子(SCF)的表達(dá)載體(pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，建立穩(wěn)定表達(dá)這些細(xì)胞因子的細(xì)胞。在這些ST0細(xì)胞上培養(yǎng)Fbxl5"e。"^小鼠來源的MEF(50萬個/100mm皿)，導(dǎo)入4個因子后，通過G418進行選擇時，結(jié)果與在常規(guī)的ST0細(xì)胞上的培養(yǎng)的情況相比，在產(chǎn)生bFGF(圖11)、SCF(數(shù)據(jù)未顯示)的ST0細(xì)胞上的集落形成數(shù)提高20倍以上。而且，即使導(dǎo)入c-Myc以外的3個因子，在常規(guī)的ST0細(xì)胞上沒有形成iPS細(xì)胞集落，但是在產(chǎn)生bFGF(圖11)、SCF(數(shù)據(jù)未顯示)的ST0細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)集落的形成。根據(jù)這些結(jié)果，清楚了通過細(xì)胞因子的刺激，由MEF建立iPS細(xì)胞的效率提高，和可以通過使用細(xì)胞因子代替從c一Myc使核重新編程成為可能。例6Oct3/4、Klf4、c-Myc、和Sox2基因都存在家族基因(表1和2)。于是，研究通過家族基因代替4個基因是否可以建立iPS細(xì)胞。表7中公開了2次實驗的匯總的結(jié)果。對于Sox家族而言，Soxl的G418抗性集落數(shù)和iPS細(xì)胞建立效率，均與Sox2的程度相同。Sox3的G418抗性集落數(shù)是Sox2的十分之一左右，但挑選的集落中的iPS細(xì)胞建立效率要比Sox2高。Soxl5的G418抗性集落數(shù)和iPS細(xì)胞建立效率都比Sox2低。Soxl7的G418抗性集落與Sox2程度相同，但是iPS細(xì)胞建立效率低。對于Klf家族而言，Klf2產(chǎn)生了比Klf4更少的G418抗性集落，iPS細(xì)胞的建立效率程度相同。對于Myc家族而言，首先確認(rèn)了野生型的c-Myc與T58A變異體在G418抗性集落數(shù)、iPS細(xì)胞建立效率兩方面的程度均相同。而且，N-Myc和L-Myc(都是野生型)，同時在這二者中的c-Myc和G418抗性集落數(shù)、iPS細(xì)胞建立效率的程度均相同。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>例7用Fbxl5-Pgeo以外的報告因子研究是否可以建立iPS細(xì)胞。首先，分離中心部位含有Nanog基因的大腸桿菌人工染色體(BAC)，通過大腸桿菌內(nèi)的重組，敲入GFP基因和噪呤霉素抗性基因(圖12A)。然后，在ES細(xì)胞中導(dǎo)入進行了相同的改良的BAC，確認(rèn)了形成未分化狀態(tài)特異的GFP陽性(數(shù)據(jù)未顯示)。然后，通過移植到相同的ES細(xì)胞的小鼠胚泡中通過嵌合體小鼠制備轉(zhuǎn)基因小鼠。在該小鼠中在胚泡的內(nèi)部細(xì)胞塊和受精后第13.5天胚的生殖腺中特異性發(fā)現(xiàn)了GFP陽性細(xì)胞(圖12B)。從受精后13.5天胚(DBA、129和C57BL/6小鼠的雜種)中除去生殖腺，分離MEF。確認(rèn)了用流式細(xì)胞儀分離的MEF為GFP陰性(圖13)。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個因子導(dǎo)入于該MEF中，通過噪呤霉素進行選擇時，獲得了多個抗性集落。其中只有約10~20%為GFP陽性。一旦傳代培養(yǎng)GFP陽性集落，就呈現(xiàn)出類似于ES細(xì)胞的形態(tài)(圖14)和增殖(圖15)。而且如果觀察基因表達(dá)，就會清楚相較于通過G418從Fbxl5egeo/pgeo的MEF中選擇分離出的iPS細(xì)胞，其更接近于ES細(xì)胞的表達(dá)模式(圖16)。一旦將該細(xì)胞移植于棵鼠中，根據(jù)形成畸胎瘤，確認(rèn)了其為iPS細(xì)胞(圖17)。而且，通過將經(jīng)Nanog-GFP選擇獲得的iPS細(xì)胞移植到C57BL/6小鼠的胚泡中誕生了嵌合體小鼠(圖18)。而且，通過使該嵌合體小鼠之間交配，確認(rèn)了種系傳遞(圖19)。在通過這種Nanog-GFP選擇建立的更接近于ES細(xì)胞的iPS細(xì)胞中，來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒的4個因子的表達(dá)幾乎完全被沉默，這提示自我復(fù)制由于內(nèi)源性的0ct3/4和Sox2而被維持。例8對10cm匯合的iPS細(xì)胞進行胰蛋白酶處理，懸浮于ES細(xì)胞用培養(yǎng)基中(懸浮后1020分鐘通過使ST0細(xì)胞粘附于涂覆了明膠的皿，而將其除去)。在涂覆了HEMA(曱基丙烯酸-2-羥乙酯)的大腸桿菌培養(yǎng)用jh中懸浮培養(yǎng)2x106的細(xì)胞4天，使之形成胚狀體(EB)(l-4天)。EB形成的第4天(第4天)，將所有EB轉(zhuǎn)移到10cm組織培養(yǎng)用皿中，用ES細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時使之粘附。24小時后(第5天)，更換成含有ITS/纖連蛋白的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7天(每兩天進行培養(yǎng)基更換)、選擇腦巢蛋白(nestin)陽性細(xì)胞(如果在無血清下培養(yǎng)，其它鐠系的細(xì)胞會在一定程度死亡)(第5-12天)。然后進行A2B5陽性細(xì)胞的誘導(dǎo)。7天后(第12天)通過胰蛋白酶處理使細(xì)胞分散，除去殘存的EB。將lxl()S個細(xì)胞接種于涂覆了聚-L-鳥氨酸/纖連蛋白的24孔板上，在含有N2/bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)四天(每兩天更換一次培養(yǎng)基(第12-16天)。四天后(第16禾)更換成含有N2/bFGF/EGF的培養(yǎng)基，培養(yǎng)四天(每兩天更換一次培養(yǎng)基)(第16-20天)。四天后(第20天)更換成含有N2/bFGF/PDGF的培養(yǎng)基，培養(yǎng)四天(每兩天更換一次培養(yǎng)基)(第20-24天)。這期間(第12-24天)，在細(xì)胞過度增加形成匯合的時候隨時傳代，接種1~2x105個細(xì)胞(數(shù)量由于傳代時期而改變)。四天后(第24天)更換成N2/T3培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天(第24-31天)，每兩天更換一次培養(yǎng)基。第31天固定，免疫染色。其結(jié)果是，確認(rèn)了由iPS細(xì)胞分化出PIII微管蛋白陽性的神經(jīng)細(xì)胞、04陽性的寡突膠質(zhì)細(xì)胞、GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖20)。例9為了由敲入了Fbxl5-Pgeo的小鼠以外的任意的小鼠體細(xì)胞建立iPS細(xì)胞，開發(fā)了不使用藥物選擇的建立方法。在10cm皿(STO飼養(yǎng)細(xì)胞上)中培養(yǎng)比以上的更少數(shù)量(l萬、5萬或IO萬個)的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入對照DNA或4個因子。在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中進行2周培養(yǎng)(無G418選擇)，在導(dǎo)入了對照DNA的皿中沒有發(fā)現(xiàn)集落形成，但在導(dǎo)入了4個因子的皿中除了被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化的扁平的集落，還形成了多個致密的集落(圖21)。從這些中選擇出24個集落，繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了ES細(xì)胞樣的形態(tài)。通過RT-PCR研究其基因表達(dá)，7個克隆中發(fā)現(xiàn)了ES細(xì)胞標(biāo)記-Esgl的表達(dá)。而克隆4中發(fā)現(xiàn)了Nanog、ERas、GDF3、0ct3/4、Sox2等許多ES細(xì)胞標(biāo)記的誘導(dǎo)，因此被認(rèn)為其是iPS細(xì)胞(圖22)。根據(jù)以上結(jié)果，表明iPS細(xì)胞建立中使用Fbxl5-0geo敲入等的藥物選擇不是必需的，由任意的小鼠來源的體細(xì)胞可以建立iPS細(xì)胞。提示出通過本技術(shù)可以由疾病模型小鼠的體細(xì)胞中建立iPS細(xì)胞的可能性。例10作為誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的細(xì)胞，研究了成纖維細(xì)胞以外的細(xì)胞-肝細(xì)胞和胃粘膜細(xì)胞。通過灌流從Fbxl5"^^。小鼠的肝臟中分離出肝細(xì)胞。用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個因子施加給該肝細(xì)胞，通過G418進行選擇，結(jié)果獲得了多個iPS細(xì)胞集落。通過DNA微陣列對基因表達(dá)模式進行分析的結(jié)果是，清楚了肝臟來源的iPS細(xì)胞比皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞更接近于ES細(xì)胞。同樣，從胃粘膜細(xì)胞和肝細(xì)胞中也獲得了iPS細(xì)胞。例11已知PD98059為MAP激酶的抑制劑，在許多分化細(xì)胞中抑制增殖，但在ES細(xì)胞中促進未分化狀態(tài)維持和增殖。于是研究了iPS細(xì)胞建立中PD98059的效果。用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個因子施加到由具有Nanog-EGFP-IRES-Puro的選擇標(biāo)記的小鼠建立的MEF中，通過嘌呤霉素進行選擇。不施加PD98059時，在獲得的iPS細(xì)胞集落中，GFP陽性的比率為8%。另一方面，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的次日開始持續(xù)施加PD98059(終濃度25jiM)的組中，所獲得的集落中的45%為GFP陽性。這可被認(rèn)為因為PD98059促進GFP陽性的更接近ES細(xì)胞的iPS細(xì)胞的增殖，也可能是PD98059抑制GFP陰性的iPS細(xì)胞和分化細(xì)胞的增殖。因此表明PD98059可以用于更接近于ES細(xì)胞的iPS細(xì)胞的建立和不使用藥物選擇的iPS細(xì)胞的建立中。例12通過核轉(zhuǎn)染(Nucleofection)將小鼠Oct3/4基因啟動子下游整合了紅色熒光蛋白質(zhì)基因和在PGK啟動子下游整合了潮霉素抗性基因的質(zhì)粒導(dǎo)入于用慢病毒使小鼠同向性病毒(ecotropicvirus)受體-可溶性載體家族7(Slc7al、NCBI登錄號NM-007513)在胎兒來源的人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)中表達(dá)的細(xì)胞中。通過潮霉素進行選擇，建立穩(wěn)定表達(dá)林.用絲裂霉素處理800000個的細(xì)胞，接種在STO細(xì)胞上，次日通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc(均來源于人)。挑選3周后獲得的集落中的24個(圖23左)，轉(zhuǎn)移到接種了STO細(xì)胞的24-孔板上進行培養(yǎng)。將2周后逐漸增加的1個克隆傳代到接種了STO細(xì)胞的6-孔板上進行培養(yǎng)，結(jié)果獲得了在形態(tài)上類似于ES細(xì)胞的細(xì)胞(圖23右)，提示其為iPS細(xì)胞。培養(yǎng)基通常使用小鼠ES細(xì)胞用培養(yǎng)基。例13將用慢病毒使Slc7al(小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒受體)導(dǎo)入于人成體皮膚成纖維細(xì)胞(成體HDF)的細(xì)胞接種于800000個飼養(yǎng)細(xì)胞(絲裂霹素處理STO細(xì)胞)上，以以下組合，用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入基因。1.Oct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc、TERT、SV40大T抗原2.0ct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc、TERT、HPV16E63.Oct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc、TERT、HPV16E74.0ct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc、TERT、HPV16E6、HPV16E75.Oct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc、TERT、Bmil(0ct3/4、Sox2，Klf4，c-Myc，TERT來源于人，Bmil來源于小鼠)在小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，繼續(xù)無藥物篩選的培養(yǎng)，在導(dǎo)入了組合1的因子的亞中，在病毒感染8天后出現(xiàn)了被認(rèn)為是iPS細(xì)胞的集落(圖24)。在其它的組合(2至5)中，盡管沒有組合1的情況明顯，但出現(xiàn)了iPS細(xì)胞樣的集落。當(dāng)只導(dǎo)入4個因子時，也沒有出現(xiàn)任何集落。產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用的可能性通過使用由本發(fā)明提供的核重新編程因子，不使用胚和ES細(xì)胞就可以簡便且再現(xiàn)性強地誘導(dǎo)分化細(xì)胞核的重新編程，可以建立與ES細(xì)胞具有同樣的分化和多能性和增殖能力的未分化細(xì)胞-誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。權(quán)利要求1.一種體細(xì)胞的核重新編程因子，該因子含有下述3種基因Oct家族基因、K1f家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物。2.權(quán)利要求l中記載的因子，其含有下述3種基因0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的產(chǎn)物。3.權(quán)利要求1或2中記載的因子，其還含有下述基因Sox家族基因的基因產(chǎn)物。4.權(quán)利要求3中記栽的因子，其舍有Sox2的基因產(chǎn)物。5.權(quán)利要求1至4中任意一項中記載的因子，其含有細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子和Myc家族基因的基因產(chǎn)物共同存在、或者代替Myc家族基因的基因產(chǎn)物。6.權(quán)利要求5中記栽的因子，所述細(xì)胞因子為bFGF和/或SCF。7.權(quán)利要求1至6任意一項中記載的因子，其還含有下述的基因TERT基因的基因產(chǎn)物。8.權(quán)利要求1至7任意一項中記載的因子，其還含有選自于由下述的基因構(gòu)成的組中的l種以上的基因的基因產(chǎn)物SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil。9.權(quán)利要求1至8任意一項中記載的因子，其還含有選自于由下述的基因構(gòu)成的組中的l種以上的基因的基因產(chǎn)物Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll和0-連環(huán)素。10.權(quán)利要求1至9任意一項中記栽的因子，其還含有選自于由下述的基因構(gòu)成的組中的l種以上的基因的基因產(chǎn)物ECAT1、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rexl、UTF1、Stella、Stat3、和Grb2。11.通過體細(xì)胞的核重新編程制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，其包括使權(quán)利要求1至IO任意一項中記栽的核重新編程因子與該體細(xì)胞接觸的步驟。12.權(quán)利要求11中記載的方法，所述體細(xì)胞為人細(xì)胞。13.由權(quán)利要求11或12中記載的方法獲得的誘導(dǎo)式多能性千細(xì)胞。14.通過誘導(dǎo)權(quán)利要求13中記載的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞分化而得到的體細(xì)胞。15.—種改善細(xì)胞的分化能力和/或增殖能力的方法，該方法包括使權(quán)利要求1至IO任意一項中記栽的核重新編程因子與細(xì)胞接觸的步16.權(quán)利要求15中記載的方法，所述細(xì)胞為人細(xì)胞。17.由權(quán)利要求15或16中記栽的方法獲得的細(xì)胞。18.通過誘導(dǎo)權(quán)利要求17中記栽的細(xì)胞分化而得到的體細(xì)胞。全文摘要作為用于不利用胚和ES細(xì)胞而誘導(dǎo)分化細(xì)胞的重新編程，簡便且再現(xiàn)性強地建立具有與ES細(xì)胞同樣的多能性和增殖能力的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，本發(fā)明提供了含有下述3種基因Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物的體細(xì)胞的核重新編程因子。文檔編號C12N15/09GK101356270SQ20068004822公開日2009年1月28日申請日期2006年12月6日優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日發(fā)明者山中伸彌申請人:國立大學(xué)法人京都大學(xué)