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根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法

文檔序號:433583閱讀:328來源:國知局
專利名稱:根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ZS0">2抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法 技術(shù)領(lǐng)域根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母,將外源基因 整合到宿主染色體上,屬于基因工程中轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景轉(zhuǎn)化是酵母基因操作技術(shù)中的重要步驟之一。由于酵母細胞不像大腸桿菌和枯草芽胞桿菌等原核微生物那樣具有可以將外源DNA攝入細胞內(nèi)的特殊生理 狀態(tài)(感受態(tài))',因此酵母轉(zhuǎn)化曾是酵母基因工程研究的一大限制因素。目前廣 泛采用的酵母轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法等。 這些方法在釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化研究上已取得了巨大的成功。由于工業(yè)應(yīng)用酵母菌株和實驗室用的酵母菌株在細胞壁結(jié)構(gòu)、生理生化特 性、遺傳背景及生長環(huán)境等方面存在巨大的差異,在轉(zhuǎn)化工業(yè)應(yīng)用酵母時需要 建立相對應(yīng)的轉(zhuǎn)化體系。但是,上面所述的轉(zhuǎn)化方法在轉(zhuǎn)化一些工業(yè)酵母菌株 時往往存在轉(zhuǎn)化率低、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性差、難以重復(fù)等困難,有些菌株甚至無法 轉(zhuǎn)化。針對這一問題,研究人員提出了不同的改進方法以及新的轉(zhuǎn)化方法。其 中,根癌農(nóng)桿菌(JgraZwcten'MW ^me/"c/era)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法是有效的方法 之一。1995年Bundock等首次成功進行了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化。進 一步研究發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法具有轉(zhuǎn)化低拷貝、高頻率轉(zhuǎn)移、成 本低、穩(wěn)定性好、操作方便和重復(fù)性好、能轉(zhuǎn)化大片段DNA (大到50Kb的外 源DNA)、能明顯提高轉(zhuǎn)化率獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子等優(yōu)點,在應(yīng)用領(lǐng)域中具有很大 的潛能。產(chǎn)甘油假絲酵母是目前我國用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)甘油的優(yōu)良菌株之一,它 具有甘油產(chǎn)率高、耐高滲壓、發(fā)酵條件粗放、菌體生長速度及發(fā)酵速度快、轉(zhuǎn) 化率高、發(fā)酵原料簡單等優(yōu)點。除了甘油,產(chǎn)甘油假絲酵母還能產(chǎn)生多種其他 多元醇,如赤蘚醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等,因此是一株具有很高的潛在應(yīng)用 價值的酵母。采用基因工程手段構(gòu)建重組菌是進一步改進產(chǎn)甘油假絲酵母性能 的途徑,實現(xiàn)這一目標(biāo)首先要獲得有效的載體和轉(zhuǎn)化方法,在此基礎(chǔ)上才有可 能對產(chǎn)甘油假絲酵母代謝途徑進行有目的的改造,以達到提高甘油產(chǎn)量和改善 工藝的目的。成功建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系能改進甘油生產(chǎn),還可以為通過代謝工 程進一步構(gòu)建高產(chǎn)其他多元醇的重組菌創(chuàng)造條件,所采用的轉(zhuǎn)化方法和載體構(gòu) 建方法也能為其他耐高滲酵母的基因工程改造提供借鑒。因此,建立產(chǎn)甘油假 絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。本發(fā)明采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母,實現(xiàn)了產(chǎn)甘油假 絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系的成功建立。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)MOC/"抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘 油假絲酵母的方法,構(gòu)建雙元載體成功地實現(xiàn)了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)產(chǎn)甘油假絲酵 母的轉(zhuǎn)化。并針對產(chǎn)甘油假絲酵母生長快的特點對轉(zhuǎn)化條件進行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。 為進一步研究產(chǎn)甘油假絲酵母打下了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法,是以質(zhì)粒pPICZB為模板通過PCR技術(shù)獲得2eocf"抗性基因, 再與線性化質(zhì)粒pCAM 3300連接,獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300- zeoc// ;質(zhì)粒 pCAM 3300—zeo"'"轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,再和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng), 根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeoc/w質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母;(1) 基因的克隆 根據(jù)M0"'T7基因的特異性設(shè)計引物弓i物R: 5'醒GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3'; 弓1物F: 5,- ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3 ,;PCR擴增zeo"Vz基因得到300bp的特異條帶;PCR方法如下取質(zhì)粒pPICZB模板1 jiL, 10 xPCR緩沖液2 (iL,引物R、 F各lpL, dNTPs2(iL, Taq DNA聚合酶0.5 pL,總反應(yīng)體積為20 |_iL;循環(huán)參 數(shù)94 。C預(yù)變性5 min, 94 。C 45 s, 56°C 90 s, 72 °C卯s, 35個循環(huán),72 °C 延伸10min;通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片 斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標(biāo)片斷,純化好的目標(biāo)片斷與pEGM-T-Easy vector連接保存;再用相應(yīng)五coi I酶切,膠回收zeoc^目標(biāo)基因,£caR I酶切 線性化質(zhì)粒pCAM 3300;在T4連接酶的作用下連接得到pCAM 3300-zeoc&;(2) 質(zhì)粒pCAM3300—zeoc&轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404將重組質(zhì)粒pCAM 3300—zeocZ"通過電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404, 在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒酶切驗證,得到重組菌 LBA4404/pCAM 3300—,c〖Vz;(3) 根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'"質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母將重組菌LBA4404/pCAM3300—zeoc/"于LB培養(yǎng)基(卡那霉素50 pg/mL,
利富霉素50嗎/mL,鏈霉素30|Lig/mL)中,30°C, 200 r/min搖床培養(yǎng)36 h,離 心收集菌體;用等體積的IM培養(yǎng)基重懸,培養(yǎng)6h;接種產(chǎn)甘油假絲酵母 WL2002-5于YPD培養(yǎng)基中,30°C、 200 r/min搖床培養(yǎng)過夜;產(chǎn)甘油假絲酵母 的YPD培養(yǎng)液按1:5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)6h;分別離心收集根癌 農(nóng)桿菌菌體和產(chǎn)甘油假絲酵母,用生理鹽水清洗一次,用IM培養(yǎng)基重懸菌體, 產(chǎn)甘油假絲酵母細胞終濃度達到109個/mL,根癌農(nóng)桿菌細胞終濃度達到1011個 /mL,各取50fiL加入20mLIM培養(yǎng)基(乙酰丁香酮200 pmol/L,卡那霉素50 1Lig/mL,利富霉素50|iig/mL)中30。C、 200 r/min共培養(yǎng)過夜;取200 |iL培養(yǎng) 液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25T:培養(yǎng)24h;將玻璃紙轉(zhuǎn)接 到SM培養(yǎng)基(頭孢噻月虧200|amol/L, zoec/w 150 mg/L)上培養(yǎng)兩天,篩選陽 性酵母轉(zhuǎn)化子。重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM3300—zeoc/"介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母 WL2002-5的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件(1) IM固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)時間優(yōu)化優(yōu)化的共培養(yǎng)時間為24h;(2) 共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細胞比例為1:500-1000時,最高轉(zhuǎn)化率達到2個轉(zhuǎn)化子/104個酵母細胞。zeoc&是一種屬于爭光霉素家族的糖蛋白抗生素,在體內(nèi)能作用于大多數(shù) 細菌(包括:£."http://)和真菌(如酵母菌)。為了高效挑選陽性轉(zhuǎn)化子,從質(zhì)粒pPICZB 上獲得zeo"'w抗性基因插入質(zhì)粒pCAM 3300,獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300- zeo"'n。通過電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。在卡那霉素抗性平板上挑取抗性 轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒酶切驗證。本發(fā)明的有益效果根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化酵母系統(tǒng)具有操作簡單(不需要制備 原生質(zhì)體)、轉(zhuǎn)化效率高、易于得到轉(zhuǎn)化子、轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定等優(yōu)良的特點。耐 高滲產(chǎn)甘油假絲酵母(C朋^^g&cm^gewM) WL2002-5是江南大學(xué)工業(yè)微生 物研究中心的科技工作者經(jīng)過三十年的潛心研究得到的優(yōu)良菌株微生物學(xué)報 Vol.39 No. 1 1999.2。產(chǎn)甘油假絲酵母具有甘油產(chǎn)率高、耐高滲、生長快、發(fā) 酵原料簡單等優(yōu)點。除了甘油,耐高滲酵母還能產(chǎn)生多種其他多元醇,如赤蘚 醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等,因此是一類具有很高的潛在應(yīng)用價值的酵母。采 用基因工程手段構(gòu)建重組菌是進一步改進產(chǎn)甘油假絲酵母性能的重要途徑,實 現(xiàn)這一目標(biāo)首先要獲得有效的載體和轉(zhuǎn)化方法,在此基礎(chǔ)上才有可能對產(chǎn)甘油 假絲酵母代謝途徑進行有目的的改造,以達到提高甘油產(chǎn)量和改善工藝的目的。 成功建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系除可以改進甘油生產(chǎn)外還可以為通過代謝工程進一步 研究產(chǎn)甘油假絲酵母,以及構(gòu)建高產(chǎn)其他多元醇的重組菌創(chuàng)造條件。因此,建 立產(chǎn)甘油假絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。


圖1重組質(zhì)粒pCAM 3300-zeocz'"的構(gòu)建圖2質(zhì)粒pCAM 3300-zeocz'"酶切驗證Lane 1 T-zeoc/"/五coR I ; Lane 2 DNA Marker: DL20002; Lane 3 zeo"'"/ £coR I ; Lane 4 pCAM 3300/£coR I ; Lane 5 pCAM 3300-磨"感coR I ; Lane 6. pCAM 3300-zeo"惑awh I ; Lane 7 DNA Marker: XDNA/歷"dIII。圖3陽性轉(zhuǎn)化子PCR驗證 Lane 1 zoecz'"基因的特異擴增;Lane2 DNA Marker DL2000; Lane 3、 4、 5、 6陽性轉(zhuǎn)化子zoec/"基因特異擴增;Lane 7產(chǎn) 甘油假絲酵母加ec^基因特異擴增;Lane 8產(chǎn)甘油假絲酵母18S rDNA擴增。圖4不同誘導(dǎo)時間轉(zhuǎn)化子生長情況 1.誘導(dǎo)培養(yǎng)0h;2.誘導(dǎo)培養(yǎng)12h; 3.誘導(dǎo)培養(yǎng)18h; 4.誘導(dǎo)培養(yǎng)24h; 5.誘導(dǎo)培養(yǎng)30h; 6.誘導(dǎo)培養(yǎng)36h。
具體實施方式
實施例1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAM 3300-以質(zhì)粒pPICZB為模板通過PCR技術(shù)獲得z "'"抗性基因,再與線性化質(zhì) 粒pCAM 3300連接,獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300- zeoc/",zeoc/w基因的克隆根據(jù)Zeo"Vz基因的特異性設(shè)計引物引物R: 5'-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG -3,; 弓1物F: 5,- ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3 ,;PCR擴增zeo"'"基因得到300bp的特異條帶;PCR方法如下取質(zhì)粒pPICZB模板1 |iL, 10xPCR緩沖液2jiL,引物R、 F各lpL, dNTPs2^iL, Taq DNA聚合酶0.5 pL,總反應(yīng)體積為20 (iL;循環(huán)參 數(shù)94。C預(yù)變性5min, 94 。C 45 s, 56°C 90 s, 72 °C 90 s, 35個循環(huán),72 °C 延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片 斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標(biāo)片斷,純化好的目標(biāo)片斷與pEGM-T-Easy vector連接保存;再用相應(yīng)五co/H酶切,膠回收zeoc^目標(biāo)基因,五coiM酶切 線性化質(zhì)粒pCAM 3300;在T4連接酶的作用下連接得到pCAM 3300-zeo"'"。實施例2質(zhì)粒pCAM 3300—zeoc/"轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404將重組質(zhì)粒pCAM 3300—zeoc/"通過電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404, 在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒酶切驗證,得到重組菌LBA4404/pCAM 3300—z固,"。實施例3 根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeo"'w質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘 油假絲酵母 接種含有質(zhì)粒pCAM 3300-2eoc/"的根癌農(nóng)桿菌LBA4404于LB培養(yǎng)基(卡 那霉素50嗎/mL,利福霉素50嗎/mL,鏈霉素30昭/mL)中,3(TC, 200 r/min 搖床培養(yǎng)36h,離心收集菌體,用等體積的IM培養(yǎng)基重懸,培養(yǎng)6h;接種產(chǎn) 甘油假絲酵母于YPD培養(yǎng)基中,30°C、 200 r/min搖床培養(yǎng)過夜;產(chǎn)甘油假絲 酵母的YPD培養(yǎng)液按1:5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)6 h。分別離心收 集釀酒酵母和根癌農(nóng)桿菌菌體,用生理鹽水清洗一次,用IM培養(yǎng)基重懸菌體, 釀酒酵母細胞終濃度達到109個/mL,根癌農(nóng)桿菌細胞終濃度達到1011個/mL, 各取50 pL加入20 mL IM培養(yǎng)基(乙酰丁香酮200 (imol/L,卡那霉素50 嗎/mL,利富霉素50嗎/mL)中3(TC, 200 r/min共培養(yǎng)過夜。取200 fiL培養(yǎng) 液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25'C培養(yǎng)24 h;將玻璃紙轉(zhuǎn) 接到SM培養(yǎng)基(頭孢噻躬200 jimol/L,150 mg/L)上培養(yǎng)兩天,篩選 陽性酵母轉(zhuǎn)化子。將初步確認的產(chǎn)甘油假絲酵母陽性轉(zhuǎn)化子接中于YPD液體培養(yǎng)基中3(TC , 200r/min培養(yǎng)18h,提取染色體進行PCR鑒定,同時作陰性對照,由于產(chǎn)甘油假 絲酵母內(nèi)不含有zeodn基因,根據(jù)zeod"基因和產(chǎn)甘油假絲酵母染色體的差異 設(shè)計的引物,產(chǎn)甘油假絲酵母染色體無法擴增出z "力基因,而陽性轉(zhuǎn)化子可 以擴增得到2 "Vz基因,這說明轉(zhuǎn)化子中已含有了zeoci"基因。PCR鑒定的結(jié) 果初步表明了通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法已實現(xiàn)了^oc/"基因?qū)Ξa(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化。實施例4 重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM3300—^ocz'"介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假 絲酵母WL2002-5的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件(1) IM固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)時間優(yōu)化取培養(yǎng)過夜的IM培養(yǎng)液,適當(dāng)稀釋涂布IM固體培養(yǎng)基,共培養(yǎng)0、 12、 18、 24、 30、 36、 40 h將玻璃紙平行轉(zhuǎn)移到SM固體培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng),觀 察SM平板上轉(zhuǎn)化子的生長情況。同時對IM培養(yǎng)液進行酵母菌落計數(shù),計算 轉(zhuǎn)化率,優(yōu)化的共培養(yǎng)時間為24h。(2) 共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化取109個/mL的酵母細胞10 pL,和1011個/mL的根癌農(nóng)桿菌細胞1、 10、 50、 100、 200、 500 pL混勻共培養(yǎng),篩選陽性轉(zhuǎn)化子并計算轉(zhuǎn)化率。以50 100 pL混勻共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率最佳,折算為產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細胞比例 為1:500-1000時,最高轉(zhuǎn)化率達到2個轉(zhuǎn)化子/104個酵母細胞。
權(quán)利要求
1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法,其特征是以質(zhì)粒pPICZB為模板通過PCR技術(shù)獲得zeocin抗性基因,再與線性化質(zhì)粒pCAM 3300連接,獲得重組質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin;質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,再和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng),根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母;(1)zeocin基因的克隆根據(jù)zeocin基因的特異性設(shè)計引物引物R5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’;引物F5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’;PCR擴增zeocin基因得到300 bp的特異條帶;PCR方法如下取質(zhì)粒pPICZB模板1μL,10×PCR緩沖液2μL,引物R、F各1μL,dNTPs 2μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,總反應(yīng)體積為20μL;循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min,94℃45s,56℃ 90s,72℃ 90s,35個循環(huán),72℃延伸10min;通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標(biāo)片斷,純化好的目標(biāo)片斷與pEGM-T-Easyvector連接保存;再用相應(yīng)EcoR I酶切,膠回收zeocin目標(biāo)基因,EcoR I酶切線性化質(zhì)粒pCAM 3300;在T4連接酶的作用下連接得到pCAM 3300-zeocin;(2)質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404將重組質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin通過電擊直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404,在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒酶切驗證,得到重組菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin ;(3)根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母將重組菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin于LB培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min搖床培養(yǎng)36 h,離心收集菌體;用等體積的IM培養(yǎng)基重懸,培養(yǎng)6h;接種產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5于YPD培養(yǎng)基中,30℃、200r/min搖床培養(yǎng)過夜;產(chǎn)甘油假絲酵母的YPD培養(yǎng)液按1∶5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)6h;分別離心收集根癌農(nóng)桿菌菌體和產(chǎn)甘油假絲酵母,用生理鹽水清洗一次,用IM培養(yǎng)基重懸菌體,產(chǎn)甘油假絲酵母細胞終濃度達到109個/mL,根癌農(nóng)桿菌細胞終濃度達到1011個/mL,各取50μL加入20mL IM培養(yǎng)基中30℃200r/min共培養(yǎng)過夜;取200μL培養(yǎng)液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25℃培養(yǎng)24h;將玻璃紙轉(zhuǎn)接到SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天,篩選陽性酵母轉(zhuǎn)化子。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征是重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM 3300—zeocz'n介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件(1) IM固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)時間優(yōu)化優(yōu)化的共培養(yǎng)時間為24h;(2) 共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細胞比例為1:500-1000時,最高轉(zhuǎn)化率達到2個轉(zhuǎn)化子/104個酵母細胞。
全文摘要
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)zeocin抗性基因轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母,將外源基因整合到宿主染色體上,屬于基因工程中轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過構(gòu)建質(zhì)粒pCAM 3300-zeocin,將其電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。通過將含有目的質(zhì)粒pCAM3300-zeocin的根癌農(nóng)桿菌和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng),利用zeocin抗性基因為篩選標(biāo)記,實現(xiàn)了pCAM 3300-zeocin對產(chǎn)甘油假絲酵母的轉(zhuǎn)化。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌的生長特性,對轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化,在共培養(yǎng)時間為24h,細胞比例為1∶500-1000時最高轉(zhuǎn)化率達到2個轉(zhuǎn)化子/10<sup>4</sup>個酵母細胞。初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的轉(zhuǎn)化方法,為進一步研究產(chǎn)甘油假絲酵母打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/31GK101130781SQ20071002414
公開日2008年2月27日 申請日期2007年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者張君勝, 徐美娟, 方慧英, 微 沈, 諸葛健, 饒志明 申請人:江南大學(xué)
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