專利名稱：一種真菌制備草酸脫羧酶的方法
技術領域：
本發明屬生物酶制備技術領域，特別是涉及一種真菌制備草酸脫羧酶的方法。
背景技術：
草酸脫羧酶(Oxalate decarboxylase，EC 4.1.1.2)是一種含錳的酶，該酶能催化草酸分解產生甲酸和二氧化碳(見式1)。該酶有廣泛的潛在應用，譬如在制漿和造紙工業中去除草酸鹽沉淀，在臨床醫學上能用于分析生物樣品的草酸成分以診斷高草酸尿癥和尿結石/腎結石病等，在食品工業中用于分析、控制以及降低食品(如菠菜、巧克力等)中的草酸以生產低草酸健康食品；啤酒工業中可以用于控制和降解富含草酸鹽的啤酒石；氧化鋁冶煉工業中也可以用來處理生產過程中產生的草酸鹽廢棄物。這些應用都需要大量價廉物美的草酸降解酶。根據文獻檢索情況，國外對草酸脫羧酶的研究始于1955年。目前，在這方面研究較多的有英國、美國、瑞典、印度等一些國家。然而到目前為止，有關草酸脫羧酶的文獻報道在國內還沒有被發現，因此，國內在這方面的研究尚處于空白。

式1草酸的酶脫羧反應草酸脫羧酶主要存在于木材腐朽真菌中，尤其是白腐菌，有關這方面的研究已有大量報道。在褐腐菌Postia placenta以及軟腐菌Aspergillus niger和Aspergillus phoenicis中也曾有過報道。在其它真菌中，迄今為止報道相對較少。后來又有人在豚鼠(天竺鼠)的肝臟中發現該酶，其它動物的肝臟中則未見報道。最近，有研究發現枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis在低pH值環境下可以誘導合成草酸脫羧酶，但尚未發現低pH值也能誘導真菌合成該酶。表1給出了已報道的能產草酸脫羧酶的主要菌種。
表1產草酸脫羧酶的主要菌種


這些酶蛋白的表觀分子量有很大的差異，一般在55kDa～264kDa范圍內；皆為單體酶，酶分子中一般都含有兩個錳原子；適宜的反應溫度較低，一般在室溫左右；對底物具有很好的專一性，涉及的底物主要為草酸。但是，不同來源的酶在反應最適pH值和輔助因子方面有一定差異。來源于白腐菌的酶，最適pH值在2.5～3.0范圍內；來源于褐腐菌的酶，最適pH值在2.0～2.2之間；來源于軟腐菌的酶，最適pH值在1.1左右；但它們催化底物的反應都不需要其它輔助因素，僅對氧有少量需求。來源于細菌的酶，最適pH值在6.9左右，催化反應需要ATP、CoA、Mg++、硫胺焦磷酸(ThPP)、醋酸作為輔助條件。由于草酸脫羧酶具有巨大的潛在應用前景，因而該酶的生產研究也越來越受到人們的關注。當前，該酶所面臨的最大問題是產率和產量均偏低，導致成本和價格偏高，難以推廣應用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，該方法簡便易行，成本低，明顯提高了草酸脫羧酶的產率和產量，草酸脫羧酶可廣泛應用于醫藥、食品、飲料、造紙、農業、分析等方面。
本發明的具體工藝路線如下以葡萄糖為碳源，蛋白胨、硫酸銨和尿素等為氮源，添加一定量的無機鹽組成液體培養基，以彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)或黑曲霉(Aspergillus niger)等真菌為產酶菌，在通氣式生物反應器中培養制備草酸脫羧酶。產酶過程中要嚴格控制反應條件。具體要求為在液體培養基中，葡萄糖的初始濃度為7～60g/L，初始pH值為4.5～5.5，控制培養溫度25～28℃，通空氣量為20～30L/L·h，使菌體細胞快速繁殖，菌體濃度迅速提高。在菌體生長快要進入對數生長期時開始添加無機酸或有機酸，添加的量控制在使培養基pH值下降到3.0以下。培養過程中定期取樣測酶活，至酶活最大時終止反應。在培養基中添加20mmol/L草酸的產酶反應歷程見附圖1。
本發明的一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，包括下列步驟(1)配制酸溶液濃度1mol/L～5mol/L的有機酸或無機酸溶液經過120～121℃高溫濕熱滅菌10～30min，或過濾除菌；(2)制備草酸脫羧酶彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)或黑曲霉(Aspergillus niger)、或Aspergillusphoenicis、Aspergillus oryzae、Agaricus bisporus、Collybia velutipes(現名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrotheciumverrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postiaplacenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametes ochracea的液體培養基初始pH值約為4.5～5.5，反應溫度20～28℃，通空氣量為20～30L/L·h，在菌體生長的第三或第四天，快要進入對數生長期時開始添加上述的酸溶液作為誘導劑，使培養基pH值0～3。如果添加草酸鹽或草酸，則添加量是使培養基中草酸根離子濃度達到3～40mmol/L。在培養過程中定期取樣測酶活，至酶活最大時終止反應；用離心機于轉速9000～12000rpm條件下離心20～30min收集菌體細胞，或通過過濾得到新鮮的菌體細胞，用0.05～0.2mol/L，pH值為3～3.7的醋酸緩沖溶液淋洗后再次收集，將得到的新鮮菌絲體用液氮迅速冷凍，研磨菌絲體成粉末狀，加入0.05～0.2mol/LpH值為3～3.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液，繼續研磨成糊狀，離心機在12000rpm，離心20～30min，得到草酸脫羧酶液。
所述的彩絨革蓋菌(又名云芝、雜色云芝、彩絨菌、瓦菌，Trametes versicolor，Coriolus versicolor)PRL 572、黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 46890、Aspergillusoryzae CCUG 33812、Aspergillus phoenicis、Agaricus bisporus、Collybia velutipes(現名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrothecium verrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postia placenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametes ochracea等菌種均是可以買到的市售真菌。
步驟1中所述的誘導劑為鹽酸、硫酸、磷酸、草酸(或草酸鹽)、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、檸檬酸、反丁烯二酸等。
步驟1中所述的最好的有機酸誘導劑是草酸，10～30mmol/L的濃度誘導效果最好。
步驟1中所述的有機酸溶液為草酸溶液時，配制離子濃度為0.5mol/L。
步驟2中所述的酸溶液為草酸或草酸鹽時，添加量使得培養基中最終草酸離子濃度為3～40mmol/L。
本發明首次提出采用在真菌培養階段通過添加無機酸或有機酸來促進酶的合成，探索最適宜的培養方式以及最佳生理培養條件優化，提高草酸脫羧酶的產量和產率。本發明的目的是針對真菌，諸如彩絨革蓋菌(又名云芝、雜色云芝、彩絨菌、瓦菌，Trametesversicolor，Coriolus versicolor)、黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillusphoenicis、Aspergillus oryzae、Agaricus bisporus、Collybia velutipes(現名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrotheciumverrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postia placenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametes ochracea在制備草酸脫羧酶的低產率和低產量上的問題，尋求一種能大幅度促進真菌合成草酸脫羧酶的方法。
本發明在真菌生長期間通過在培養基中添加有機酸或無機酸誘導劑(例如鹽酸、硫酸、磷酸、草酸、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、檸檬酸、反丁烯二酸等)，降低培養液pH值至低pH范圍(＜3.5)，并控制其離子強度來提高酶活力，縮短產酶時間及提高酶產量，利用該方法制備得到的草酸脫羧酶活力是未加酸普通方法的8倍以上。


圖1為采用本發明提供的方法，以葡萄糖為碳源，以彩絨革蓋菌(Trametesversicolor)PRL 572為產酶菌，在通氣式生化反應器中間歇式培養制備草酸脫羧酶的過程中，培養液pH值、總酶活力(U)、比酶活(U/mg蛋白質)隨培養時間(d)變化的典型規律。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例11.酸溶液的配制液體酸可以用移液管移取相應的量配成濃溶液，固體酸則稱取一定量的粉末，用去離子水配成相應的濃溶液，濃度一般在1mol/L至2mol/L左右，草酸溶液配制離子濃度為0.5M。配好的酸溶液經過121℃高溫濕熱滅菌20min或過濾除菌后待用。
2.酸的添加量及添加時機在菌體生長的第三或第四天，即生長快要進入對數生長期階段時，開始添加誘導劑。草酸或草酸鹽的添加量是使得培養基中最終草酸離子濃度為3～40mmol/L。其它酸的添加量是使培養基的pH值下降到3.0以下。
3.彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)PRL 572產草酸脫羧酶以彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)PRL 572為產酶菌，在通氣式生化反應器中以間歇式、分批添料或連續培養制備草酸脫羧酶。液體培養基中碳源和營養鹽濃度(g/L)如下葡萄糖 20蛋白胨 3.0KH2PO41.0Na2HPO4·12H2O0.2MgSO4·7H2O0.5FeSO4·7H2O0.01MnSO4·H2O 0.001ZnSO4·7H2O0.001CuSO4·5H2O0.002CaCl2·2H2O0.013液體培養基初始pH值約為5.2。反應控制培養溫度25℃，通空氣量為20～30L/L·h，使菌體細胞快速繁殖，菌體濃度迅速提高。在菌體生長快要進入對數生長期時開始添加無機酸或有機酸，添加的量控制在使培養基pH值下降到3.0以下。培養過程中定期取樣測酶活，至酶活最大時終止反應。
用離心機于轉速9000rpm條件下離心20min將菌體細胞收集，或通過過濾得到新鮮的菌體細胞，獲得的菌絲體用0.2mol/L，pH值為3.7的醋酸緩沖溶液淋洗之后再次收集。將得到的新鮮菌絲體利用液氮迅速冷凍，研磨菌絲體，使其成粉末狀。在菌絲體被研磨破碎完全之后加入0.2mol/L pH值為3.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液，繼續研磨片刻，使其成為糊狀，然后利用離心機在12000rpm條件下離心30min。最后，保存離心得到的上清液，即為該草酸脫羧酶液。表2顯示了未加酸時以及添加各種酸后的產酶結果。
表2未加酸時以及添加各種酸后的產酶結果


實施例21.酸溶液的配制液體酸可以用移液管移取相應的量配成濃溶液，固體酸則稱取一定量的粉末，用去離子水配成相應的濃溶液，濃度一般在1mol/L至2mol/L左右，草酸溶液配制離子濃度為0.5M。配好的酸溶液經過121℃高溫濕熱滅菌20min或過濾除菌后待用。
2.酸的添加量及添加時機在菌體生長的第三或第四天，即生長快要進入對數生長期階段時，開始添加誘導劑。草酸的添加量是使得培養基中最終草酸離子濃度為5～40mmol/L。其它酸的添加量是使培養基的pH值下降到3.0以下。
3.黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 46890產草酸脫羧酶以黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 46890為產酶菌，在通氣式生化反應器中以間歇式、分批添料或連續培養制備草酸脫羧酶。液體培養基中碳源和營養鹽濃度(g/L)如下葡萄糖 10～20蛋白胨 1～10檸檬酸三納·2H2O2.5磷酸二氫鉀(無水) 5硝酸氨(無水) 2檸檬酸 0.5005MgSO4·7H2O 0.20.01％Biotin 0.05CaCl2·2H2O0.1ZnSO4·7H2O0.005Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.001CuSO4·5H2O0.00025MnSO4·H2O 0.00005
H3BO3(無水) 0.00005Na2MoO4·2H2O 0.00005Tween 80 0.15pH5.0～5.5液體培養基初始pH值約為5.0～5.5。反應控制培養溫度25℃，通空氣量為20～30L/L·h，使菌體細胞快速繁殖，菌體濃度迅速提高。在菌體生長快要進入對數生長期時開始添加無機酸或有機酸，添加的量控制在使培養基pH值下降到2.0以下。培養過程中定期取樣測酶活，至酶活最大時終止反應。
用離心機于轉速9000rpm條件下離心20min將菌體細胞收集，或通過過濾得到新鮮的菌體細胞，獲得的菌絲體用0.2mol/L，pH值為3.7的醋酸緩沖溶液淋洗之后再次收集。將得到的新鮮菌絲體利用液氮迅速冷凍，研磨菌絲體，使其成粉末狀。在菌絲體被研磨破碎完全之后加入0.2mol/L pH值為3.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液，繼續研磨片刻，使其成為糊狀，然后利用離心機在12000rpm條件下離心30min。最后，保存離心得到的上清液，即為該草酸脫羧酶液。
權利要求
1.一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，包括下列步驟(1)配制酸溶液濃度1mol/L～5mol/L的有機酸或無機酸溶液經過120～121℃高溫濕熱滅菌10～30min，或過濾除菌；(2)制備草酸脫羧酶彩絨革蓋菌或黑曲霉液體培養基初始pH值約為4.5～5.5，反應溫度20～28℃，通空氣量為20～30L/L·h，在菌體生長的第三或第四天，快要進入對數生長期時開始添加上述的酸溶液作為誘導劑，使培養基pH值0～3，在培養過程中定期取樣測酶活，至酶活最大時終止反應；用離心機于轉速9000～12000rpm條件下離心20～30min收集菌體細胞，或通過過濾得到新鮮的菌體細胞，用0.05～0.2mol/L，pH值為3～3.7的醋酸緩沖溶液淋洗后再次收集，將得到的新鮮菌絲體用液氮迅速冷凍，研磨菌絲體成粉末狀，加入0.05～0.2mol/LpH值為3～3.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液，繼續研磨成糊狀，離心機在12000rpm，離心20～30min，得到草酸脫羧酶液。
2.根據權利要求1所述的一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，其特征在于所述的彩絨革蓋菌又名云芝、雜色云芝、彩絨菌、瓦菌，Trametes versicolor，Coriolus versicolor。
3.根據權利要求1所述的一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，其特征在于所述的真菌是黑曲霉(Aspergillus niger)、或Aspergillus oryzae、Aspergillus phoenicis、Agaricusbisporus、Collybia velutipes (現名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrothecium verrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postia placenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametesochracea。
4.根據權利要求1所述的一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，其特征在于步驟1中所述的誘導劑為鹽酸、硫酸、磷酸、草酸/草酸鹽、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、檸檬酸或反丁烯二酸。
5.根據權利要求1所述的一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，其特征在于步驟1中所述的有機酸溶液為草酸溶液時，配制離子濃度為0.5mol/L。
6.根據權利要求1所述的一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，其特征在于步驟2中所述的酸溶液為草酸或草酸鹽時，添加量使培養基中草酸根離子濃度為3～40mmol/L。
全文摘要
本發明涉及一種真菌制備草酸脫羧酶的方法，包括(1)有機酸或無機酸溶液經過121℃高溫濕熱滅菌；(2)彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)或黑曲霉(Aspergillus niger)等真菌的液體培養基初始pH值約為5.0～5.5，反應溫度20～25℃，通空氣量為20～30L/L·h，在菌體生長的第三或第四天，快要進入對數生長期時開始添加上述的酸溶液，pH值0～3，用離心收集菌體細胞或過濾得到菌體細胞，用0.05～0.2M pH值為3～3.7的醋酸緩沖溶液淋洗后再次收集，冷凍，研磨菌絲，加入0.05～0.2M pH值為3～3.7的醋酸－醋酸鈉緩沖液，繼續研磨成糊狀，離心得到草酸脫羧酶液。本發明簡便易行，成本低，草酸脫羧酶活力是未加酸的8倍以上。草酸脫羧酶可廣泛應用于醫藥、食品、飲料、造紙、農業、分析等方面。
文檔編號C12N9/88GK101063119SQ20071004031
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者洪楓, 朱翠俠 申請人:東華大學