專利名稱：：一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶的快速提純方法
技術領域：
：本發明屬于一種提純方法，具體涉及一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶的快速提純方法。技術背景脫氧胞苷激酶(dCK)是細胞質內的四大激酶之一，它廣泛存在于哺乳動物體內及一些細菌細胞內。細胞體內，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷類藥物的磷酸化"n"。研究表明，抗病毒核苷類藥物在人體內通過dCK催化迸行磷酸化，產生與逆轉錄酶結合的底物，而發揮藥效。但是，在一些患者體內細胞的dCK含量很低，無法催化核苷類藥物的磷酸化，因而導致了病毒的抗藥性[5]。因此，對核苷類藥物進行體外磷酸化，是近年來核苷類藥物研究的一大方向。傳統的小牛胸腺dCK的提純主要分為粗提和柱層析兩步。所謂粗提就是將小牛胸腺粉碎勻漿，再對勻漿液進行鹽析，透析后得dCK粗酶。將得到的dCK粗酶進行多次柱層析，就可得精提的dCK了氣該方法的缺點在于柱層析過程較為繁瑣，耗時較長，重復性不高，容易導致dCK的失活和較大的實驗誤差。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服了傳統的小牛胸腺dCK的提純方法的繁瑣，耗時較長、易使dCK的失活和較大的實驗誤差的缺陷，提供了一種快速、簡便、所提dCK活性較好的小牛胸腺dCK的提純方法。本發明提供的是一種利用先進的快速蛋白質層析系統(FPLC)快速提純小牛胸腺dCK的方法，包括如下步驟對小牛胸腺進行粉碎勻漿、鹽析、透析提取dCK粗酶；再利用FPLC的分子篩凝膠柱和離子交換柱層析對上述dCK粗酶進行分離純化。具體步驟如下1、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)將小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎儀中與0.001M0.1M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.0)—起進行勻漿化。(2)將上述勻漿液低溫超速離心1020min，取上清液。向上清液中加入1%10%鏈霉素硫酸鹽溶液進行沉淀。(3)將上述沉淀液低溫超速離心1020min，，取上清液。向上清液中加入10%30%的硫酸銨進行沉淀。(4)將上述沉淀液低溫超速離心1020min，取上清液。向上清液中加入硫酸銨10%20%進行沉淀。(5)將上述沉淀液低溫超速離心1020min，留取沉淀物。用少量0.001M0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.0)溶解沉淀。用0.001M0.1M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，p服.07.0)對上述溶解液進行透析40小時以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提純小牛胸腺dCK(1)分子篩凝膠層析。將上述粗酶液在FPLC系統中層析，條件是分子篩凝膠柱S印hodexG75;洗脫液0.001M0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM疏基乙醇pH6.07.5);平衡2個柱床；洗脫12個柱床；流速0.250.75ml/min。所得的鋒譜圖如圖1。(2)離子交換層析。將上述粗酶液在FPLC系統中用離子交換柱進行分離，條件是離子交換柱HiTripQFFlml;洗脫液A:0.001M0.01M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.5);洗脫液B:0.001M0.01M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，pH9.010.0)+lM2M的NaCl;平衡1025個柱床；沖洗25個柱床；洗脫梯度洗脫液B在510個柱床內保持3%7%，然后在5個柱床內保持10%15%，然后在510個柱床內保持20%25%，然后在510個柱床內保持40%50%;流速0.75lml/min。陰離子交換層析得到三個峰，分別是流穿峰，A峰、B峰和C峰，所得的峰譜圖如圖2。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征(1)SDS-PAGE凝膠電泳將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰進行電泳表征。其中分子篩凝膠層析經過電泳后得到三條條帶；陰離子交換層析得到一條條帶。條件是分離膠濃度為7%15%;濃縮膠濃度為4%5%;電流為1015mA(濃縮膠)、2030mA(分離膠);電泳時間為4080min，電泳槽ReadyGelPrecastGelSystem(Bio-Rad)。電泳圖見圖3。(2)HPLC酶活測定以單位蛋白的dCK催化CDA的磷酸化的量為一個酶活單位。利用HPLC測定CDAMP的生成量。HPLC層析的洗脫液A為去離子水；洗脫液B為HPLC用甲醇；洗脫梯度為在510min內洗脫液A保持95W10(m，洗脫液B保持(m5y。;然后在510min內洗脫液A減少至75%50%，洗脫液B增加至25%50%;最后在510rain內洗脫液A保持75%50%，洗脫液B保持25%50%。表一是各純化步驟所得的收率和純化倍數:表一各純化步驟所得的收率和純化倍數<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1為用快速蛋白質層析系統(FPLC)對小牛胸腺dCK粗酶凝膠分子篩層析得到的色譜圖。圖2為用快速蛋白質層析系統(FPLC)對凝膠分子篩層析的到的收集液陰離子交換層析所得的色譜圖。圖3為用快速蛋白質層析系統(FPLC)陰離子層析所得的蛋白峰進行SDS-PAGE電泳分析所得的電泳圖。圖中MW為蛋白質分子量標準，Sample為FPLC陰離子層析所得的蛋白峰。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例11、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)將小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎儀中與0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)—起進行勻漿化。(2)將上述勻漿液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10%鏈霉素硫酸鹽溶液進行沉淀。(3)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5%的硫酸銨進行沉淀。(4)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸銨13.7%進行沉淀。(5)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)溶解沉淀。用0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)對上述溶解液進行透析40小時以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提純小牛胸腺dCK(1)分子篩凝膠層析。將上述粗酶液在FPLC系統中層析，條件是分子篩凝膠柱S印hodexG75;洗脫液0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇pH7.0);平衡2個柱床；洗脫1個柱床；流速0.5ml/min。得峰譜圖。(2)離子交換層析。將上述粗酶液在FPLC系統中用離子交換柱進行分離，條件是離子交換柱HiTripQFF1ml;洗脫液A:0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0);洗脫液B:0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.0)+2M的NaCI;平衡20個柱床；沖洗5個柱床；洗脫梯度洗脫液B在5個柱床內保持3%，然后在5個柱床內保持10%，然后在5個柱床內保持20%，然后在5個柱床內保持40%;流速1ml/min。陰離子交換層析得到三個峰。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征(1)SDS-PAGE凝膠電泳將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰進行電泳表征。其中分子篩凝膠層析經過電泳后得到三條條帶；陰離子交換層析得到一條條帶。條件是分離膠15%;濃縮膠5%;電流10mA(濃縮膠)、20mA(分離膠)；電泳時間60min;電泳槽ReadyGelPrecastGelSystem(Bio-Rad)。電泳結果表明陰離子交換層析得到的峰為一種純的酶。(2)HPLC酶活測定以單位蛋白的dCK催化CDA的磷酸化的量為一個酶活單位。利用HPLC測定CDAMP的生成量。實施例21、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)將小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎儀中與0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)—起進行勻漿化。(2)將上述勻漿液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10%鏈霉素硫酸鹽溶液進行沉淀。(3)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5%的硫酸銨進行沉淀。(4)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸銨13.7%進行沉淀。(5)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)溶解沉淀。用0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)對上述溶解液進行透析40小時以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提純小牛胸腺dCK分子篩凝膠層析。將上述粗酶液在FPLC系統中層析，條件是分子篩凝膠柱-S印hodexG75;洗脫液0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM巰基乙醇pH7.0);平衡2個柱床；洗脫1個柱床；流速0.5ml/min。得峰譜圖。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC對提純小牛胸腺dCK進行酶活表征。實施例31、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)將小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎儀中與0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)—起進行勻漿化。(2)將上述勻漿液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10%鏈霉素硫酸鹽溶液進行沉淀。(3)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5%的硫酸銨進行沉淀。(4)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸銨13.7%進行沉淀。(5)將上述沉淀液離心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)溶解沉淀。用0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)對上述溶解液進行透析40小時以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提純小牛胸腺dCK離子交換層析。將上述粗酶液在FPLC系統中用離子交換柱進行分離，條件是離子交換柱HiTripQFF1ml;洗脫液A:0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0);洗脫液B:0.01M的Tris-HCI緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.0)+2M的NaCI;平衡20個柱床；沖洗5個柱床；洗脫梯度洗脫液B在5個柱床內保持3%，然后在5個柱床內保持10%，然后在5個柱床內保持20%，然后在5個柱床內保持40%;流速1ml/min。陰離子交換層析得到三個峰。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC對提純小牛胸腺dCK進行酶活表征。權利要求1.一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，包括如下步驟(1)小牛胸腺dCK粗酶的提取對小牛胸腺進行粉碎勻漿、鹽析、沉淀溶解和透析提取小牛胸腺dCK粗酶；(2)利用FPLC的凝膠分子篩和陰離子交換層析中之一或兩者結合提純小牛胸腺dCK。2.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于歩驟(1)所述的小牛胸腺勻漿是將小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎儀中與0.001M0.1M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，p朋.07.0)—起進行勻漿化，得到勻漿液。3.如權利要求2所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于所述Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)濃度為0.OIM。4.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于步驟(1)所述的鹽析包括鏈霉素硫酸鹽鹽析和兩步硫酸銨鹽析。5.如權利要求4所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于所述的為1%10%鏈霉素硫酸鹽，硫酸銨濃度分別為10%30%、10%20%。6.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于步驟(1)所述的沉淀溶解是用少量0.001M0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM巰基乙醇，p服.07.0)溶解鹽析后的沉淀。7.如權利要求6所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于所述Tris-HC1緩沖溶液(含5raM毓基乙醇，pH7.0)濃度為0.OIM。8.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于步驟(1)所述的透析為用0.001M0.1M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，p朋.07.0)對溶解液進行透析40小時以上。9.如權利要求8所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于所述Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)濃度為0.OIM。10.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于:步驟(2)所述的凝膠分子篩層析所用分子篩凝膠柱:S印hodexG75，用洗脫液為0.001M0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，p服.0~7.5)，平衡2個柱床，洗脫12個柱床，流速0.250.75ml/min。11.如權利要求10所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于所述的凝膠分子篩層析用洗脫液為0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)，平衡2個柱床，洗脫l個柱床；流速0.5ml/tnin。12.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于步驟(2)所述的陰離子交換層析所用的離子交換層析柱為HiTr鄰QFF柱，用洗脫液A為0.001M0.01M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.5);洗脫液B為0.001M0.01M的Tris-HCl緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.010.0)+lM2M的NaCl;平衡為1025個柱床；沖洗為25個柱床；洗脫梯度洗脫液B在510個柱床內保持3%7%，然后在5個柱床內保持10%15%，然后在510個柱床內保持20%25%，然后在510個柱床內保持40%~50%;流速為0.75lml/min。13.如權利要求12所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于所用洗脫液A為0.01M的Tris-HC1緩沖溶液(含5raM巰基乙醇，pH7.0);洗脫液B為0.01M的Tris-HC1緩沖溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.0)+2M的NaCl;平衡為20個柱床；沖洗為5個柱床；洗脫梯度洗脫液B在5個柱床內保持3y。，然后在5個柱床內保持10%，然后在5個柱床內保持20%，然后在5個柱床內保持40%;流速lml/min。14.如權利要求1所述的一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，其特征在于將將陰離子層析和分子篩凝膠層析得到的收集峰進行SDS-PAGE凝膠表征和HPLC酶活表征。全文摘要本發明公開了一種小牛胸腺脫氧胞苷激酶(dCK)的快速提純方法，包括(1)小牛胸腺dCK粗酶的提取對小牛胸腺進行粉碎勻漿、鹽析、沉淀溶解和透析提取小牛胸腺dCK粗酶；(2)利用FPLC的凝膠分子篩和陰離子交換層析中之一或兩者結合提純小牛胸腺dCK。該方法快速、簡便、使純化dCK活性較好。文檔編號C12N9/12GK101130767SQ200710040318公開日2008年2月27日申請日期2007年4月29日優先權日2007年4月29日發明者朱利民,柴艷倩申請人:東華大學