專利名稱：轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域中轉基因油菜的檢測，具體地說，涉及一種轉基因油菜外源基因整合事件Rf3的外源插入載體旁側序列及其應用。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲準種植和生產，有的被加工成食品、飼料或用作食品添加劑。由于轉基因產品的生態安全和食用安全一直備受爭議，30多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度。
根據轉基因產品中外源基因的序列信息，外源基因在轉基因構建體上的組合方式，以及構建體在基因組上的整合位點，可以采用基因特異性、載體特異性和事件特異性的檢測方法。
1、基因特異性檢測方法由于大量的轉基因載體使用了相同的外源基因，因此基因特異性檢測方法并不適合當前轉基因產品不斷涌現的現實。
2、載體特異性檢測方法載體特異性檢測方法利用基因元件之間的邊界序列特征，能夠有效鑒定使用類似基因元件的不同構建體，而且存在序列信息容易獲得的特點，因此被很多研究者所使用。但是，由同一構建體可能獲得不止一個不同特性的轉化株，甚至可能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部經過了安全評估。因此載體特異性檢測方法不能識別不同的轉基因品系，也不能判別該轉基因品系是否已經過安全評估。
3、事件特異性的檢測方法事件特異性檢測的基礎是轉基因構建體在基因組DNA序列上的整合位點具有高度特異性，即使是相同的載體多次轉化，整合的位置和整合位點特征也是不可重復的。因此，根據不可重復的整合位點特征序列，開發出了事件特異性的檢測方法。與前兩種方法相比，事件特異性檢測具有最高的特異性，最適合做轉基因產品的定性和定量檢測。但轉基因構建體的完整信息通常難以獲得，而已知序列基因元件可能距邊界有相當的距離，而且在整合的過程中，載體和基因組之間可能發生復雜的重組，因此，分離旁側序列成為事件特異性檢測的關鍵。2000年2月，歐盟為此資助了Qpcrgmofood European Project項目，該項目現已成功分離獲得多個品種旁側序列并用于建立事件特異性檢測方法。當前，事件特異性檢測方法已經被用于轉基因Roundup Ready soybean，Mon810 maize等一系列轉基因商品化品種的檢測。
經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現任何關于轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列和利用此序列建立事件特異性定性、定量PCR(聚合酶鏈式反應)檢測的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術在檢測轉基因油菜Rf3事件和轉基因油菜品種Ms8Rf3中存在的不足，提供一種轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列及其應用。
本發明的目的是這樣實現的本發明以轉基因油菜品種Ms8Rf3為材料，利用引物對MDB2015’GCTTGGACTATAATACCTGAC 3’和MDB2695’GGTTTTCGGAGGTCCGAGACG 3’，以PCR技術(聚合酶鏈式反應)擴增獲得Rf3整合事件邊界序列SEQ NO.1。
轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列的特征是(1)第1至101個堿基來源于外源插入載體序列；(2)第102至694個堿基來源于油菜基因組序列；(3)由來源于外源插入載體的第1至101個堿基和來源于油菜基因組序列的第102至694個堿基共同組成油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列。
上述轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列的應用研究(1)利用該序列特征設計轉基因油菜外源基因整合事件Rf3的事件特異性定性PCR檢測方法；(2)利用該序列特征設計轉基因油菜外源基因整合事件Rf3的事件特異性定量PCR檢測方法；(3)利用該序列特征設計轉基因油菜品種Ms8Rf3的品系特異性定性PCR檢測方法；(4)利用該序列特征設計轉基因油菜品種Ms8Rf3的品系特異性定量PCR檢測方法。
與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下1、本發明首次測序公布轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列。
2、本發明首次分析并確認轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列中不同堿基的來源，并確定外源插入載體序列和油菜基因組序列的接合位點。
3、利用本發明發現的序列特征，建立轉基因油菜Rf3事件以及轉基因油菜品種Ms8Rf3的事件特異性定性、定量PCR檢測方法。
4、本發明適用于建立轉基因油菜Rf3事件和轉基因油菜品種Ms8Rf3的其他事件特異性PCR檢測方法等方面。


圖1-轉基因油菜Rf3事件右邊界結合位點，其結合位點特征序列。
圖2-轉基因油菜Rf3事件特異性定性PCR擴增，其中M分子量Marker；1-轉基因油菜Ms8Rf3基因組DNA模板；2-轉基因油菜Ms1Rf1基因組DNA模板；3-轉基因油菜Ms1Rf2基因組DNA模板；4-轉基因油菜Oxy-235基因組DNA模板；5-轉基因油菜T45基因組DNA模板；6-轉基因油菜Topas 19/2基因組DNA模板；7-轉基因油菜RT45基因組DNA模板8-非轉基因油菜中油821模板。
圖3-轉基因油菜Rf3事件特異性定量PCR擴增。
具體實施例方式
1、轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列的PCR擴增先將20％SDS預熱到65℃，取15ml SDS抽提buffer(0.1TrisHCl，0.05MEDTA，1M NaCl pH8.0)加入到50ml離心管，再加入2.5μl β-巰基乙醇，混勻；液氮研磨3g左右的葉片，將粉末轉至50ml含抽提buffer的50ml離心管中，在振蕩器上振蕩混勻，加入2ml預熱的20％SDS，混勻，65℃水浴至少30分鐘，其間要輕輕搖動試管；水浴后，迅速將離心管置于冰上，加入3ml 3M KAc，混勻，在冰上放置30分鐘；4℃ 5000g離心5min；將上清轉移到新的50ml離心管中，加入2/3體積的異丙醇，混勻，-20℃放置30min以上；6000g，4℃離心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗一遍，真空干燥，用超純水溶解DNA，溶解后，將溶液轉移到15ml的離心管中；按DNA溶解體積的1％加蛋白酶K，55℃水浴30min；加入等體積苯酚，混勻，輕搖30min，8000g離心10min；轉移上清至新的tube中，加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)，輕搖20min，8000g離心15min；轉移上清至新的tube中，加等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，輕搖20min，8000g離心15min；吸取上清，每管加入5μl RNase，混勻，37℃水浴1hr降解RNA；用等體積的苯酚抽提一次，輕搖20min，8000g離心15min；轉移上清至新的離心管中，加等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，輕搖20min，8000g離心15min；吸上清加入1/10體積3M NaAC，混勻，加入等體積異丙醇，-20℃放置30min，沉淀DNA；6000g，4℃離心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗2遍，離心去掉75％乙醇，真空干燥；干燥后，用超純水溶解DNA備用。
合成引物序列如下MDB2015’GCTTGGACTATAATACCTGAC 3’和MDB2695’GGTTTTCGGAGGTCCGAGACG 3’。
以抽提出的油菜基因組DNA為模板，在Biometra TGradient型PCR儀上進行基因擴增。PCR反應利用KOD Plus試劑盒進行。在50ul反應體系中，以100ngMs8Rf3基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為，KOD Plus Buffer 1x，dNTPs每種200uM，MgSO41mM，引物MDB201和MDB269各300nM，KOD Plus酶1u。反應條件為，94℃ 2分鐘預變性，94℃ 15秒，55℃ 30秒，68℃ 1分鐘，循環35次，68℃保溫2分鐘。
以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit純化PCR產物。
將PCR產物與EcoRV酶切的pZero2(Invitrogen)載體連接。連接體系DNA mixture 22μl；2.5μl 10×T4 DNA Ligase Buffer with 1mM ATP；0.5μlT4 DNA Ligase(NEB)。22℃連接至少1hr。
根據《分子克隆實驗指南》提供的方法制備大腸桿菌TOP10(Invitrogen)感受態細胞，并以連接產物轉化。挑取單克隆，以突變位點特異引物進行菌落PCR檢測重組子。將篩選出的克隆擴大培養，小量制備質粒，酶切驗證。
將篩選出的克隆送測序公司測序。將獲得的序列信息，利用NCBI提供的Blastn軟件，分析不同部分序列的來源，從而判斷基因組和載體的結合位點。
2、應用方法1)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Rf3事件和轉基因油菜品種Ms8Rf3的事件特異性定性PCR檢測方法合成引物序列如下Rf3RG5’TTTGTACAAAACTTGGACCCCTAGGT 3’和Rf3RV5’TTCTTTCAAGATGGGAATTAACATCT 3’。
分別取轉基因油菜品種Ms8Rf3，Ms1Rf1，Ms1Rf2，Oxy-235，T45，Topas 19/2，GT73；非轉基因油菜品種中油821，以及擬南芥，白菜，甘藍，芥菜，大豆，水稻、玉米、棉花基因組DNA為模板，分別利用Ms8RG，Ms8RV和Rf3RG，Rf3RV引物組合進行PCR擴增。在25ul反應體系中，以100ng不同來源基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為，PCR Buffer 1x(含10mM Tris·HCl pH8.3，KCl50mM)，dNTPs每種200uM，MgCl22.5mM，引物Rf3RG和Rf3RV各250nM，Hot StartTaq酶1u。反應條件為，94℃ 2分鐘預變性，94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃30秒，循環35次，72℃保溫2分鐘。PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物。
2)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Rf3事件和轉基因油菜品種Ms8Rf3的事件特異性定量PCR檢測方法合成TaqMan探針序列如下Rf3RP5’FAM-TGCCTTTTCTTATCGCGAGATGAAAAAGGC-TAMRA 3’。
針對Rf3事件的引物、探針組合被用于熒光定量PCR分析。熒光定量PCR分析在一臺MJR DNA Engine Opticon 2 Continuous Fluorescence Detector上進行，檢測及分析軟件為Opticon Monitor 2 Version 2.02。
Rf3事件定量檢測反應體積20ul，含模板DNA 100ng，其他組分含量為TaqMan Buffer 1x(50 mM KCl，10mM.Tri s-HCl，10mM EDTA，pH 8.3)，MgCl25.75mM，引物Rf3RG/Rf3RV 400uM，探針Rf3RP 200uM，dATP dCTP dGTP各600uM，dUTP 1200uM，Amperase Uracil N-glycosylase(UNG)0.2u，AmpliTaq Gold1.25u。
TaqMan反應條件為50℃ 2分鐘和95℃ 10分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95℃ 15秒變性，60℃ 1分鐘退火及延伸，讀板。
轉基因油菜Ms8Rf3基因組DNA被相同濃度非轉基因油菜821 DNA稀釋至不同含量，以100ng的混和油菜基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含100，13，1.3，0.13，0.013ng Ms8Rf3基因組DNA的混和DNA樣品被用于建立標準曲線。所有的熒光定量反應都重復3次。
根據標準曲線優化的結果，利用與建立標準曲線相同的PCR反應條件，以標準曲線為參照測定含有Ms8Rf3基因組DNA的混和油菜DNA樣品中Ms8Rf3基因組DNA的量。取100ng基因組DNA為模板，利用不同含量標準樣品做標準曲線，根據獲得的標準曲線和轉基因樣品的Ct值，計算Ms8Rf3基因組DNA的質量，從而計算出Ms8Rf3在樣品中的含量。所有熒光定量反應都重復3次。
3、實驗結果1)轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列的PCR擴增和測序分析利用MDB201/MDB269引物組合，以Ms8Rf3基因組DNA為模板，成功擴增獲得694bp擴增產物。對PCR產物測序，并經Blastn分析，其中101個堿基對來源于載體序列，其右邊界重復序列丟失，同時593個堿基對與白菜基因組序列同源，被認為是油菜基因組序列。具體轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列見SEQ NO.1。
根據以上分析，本發明分離獲得的序列包含轉基因油菜Rf3事件右邊界結合位點，其結合位點特征序列如圖1所示。
2)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Rf3事件和轉基因油菜品種Ms8Rf3的事件特異性定性PCR檢測方法以不同來源轉基因油菜、非轉基因油菜基因組DNA為模板，利用Rf3事件特異性引物組合Rf3RG/Rf3RV，進行PCR擴增，結果如圖2。只有Ms8Rf3基因組DNA可以擴增出特異的PCR產物，而其他轉基因和非轉基因油菜DNA做模板時都沒有擴增產物可觀察到，包括具有相似基因元件和序列的Ms1Rf1和Ms1Rf2品種。同時以其他非油菜植物基因組DNA為模板，也沒有可見的PCR擴增產物。因此，我們認為，該引物組合具有良好的特異性，適合用于事件特異性的檢測。
3)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Rf3事件和轉基因油菜品種Ms8Rf3的事件特異性定量PCR檢測方法根據梯度稀釋模板，3次重復獲得的熒光曲線信息，針對Rf3事件的特異性熒光定量PCR反應標準曲線被建立起來，如圖3所示，其R2值為0.995，表明外源基因的拷貝數與熒光強度都具有良好的對應關系，適合用于外源基因的精確定量。
為了驗證本研究中建立的定量方法的精確性，我們使用了從標準轉基因油菜Ms8Rf3產品中提取的基因組DNA用非轉基因油菜基因組DNA稀釋至一定含量，并以不含轉基因油菜Ms8Rf3的相同量基因組DNA做對照，作為實時熒光定量PCR反應的模板，并根據相同條件下獲得的標準曲線，計算不同樣品中轉基因油菜Ms8Rf3基因組DNA的含量。
以不含轉基因油菜Ms8Rf3的非轉基因油菜基因組DNA為模板，沒有擴增產物被檢測到。對于混和實驗樣品，用本研究中建立Rf3事件特異性熒光定量檢測方法來檢測，都和理論值非常接近，誤差小于15％。
以上結果可以看出，本發明為轉基因油菜事件Rf3和轉基因油菜Ms8Rf3的定量檢測分析提供了基于簡單、可靠的測定方法，可以用于不同來源、不同含量的混和產品中轉基因油菜Rf3事件以及轉基因油菜品種Ms8Rf3的定量。本發明為轉基因標識提供了一種有用的參考，對轉基因產品的控制提供了必要的手段。
序列表<110>中國農業科學院油料作物研究所<120>轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列及其應用<160>1
<210>1<211>694<212>DNA<213>油菜(Brassica napus cv.Ms8Rf3)gcttggacta taatacctga cttgttattt tatcaataaa tatttaaact atatttcttt 60caagatggga attaacatct acaaattgcc ttttcttatc gcgagatgaa aaaggcattt 120acctaggggt ccaagttttg tacaaatttc agggtttcta attacaaaaa aaaatacttt 180tgcatggtag ttaacatatt tttttagata gatttttatt tttatttgat tttgaattgg 240acttctggtt aaagtaacta ggtttgtgat catttttgct atattttaaa taaaactata 300aagattctac ttctaaaaaa ctgtaaatat tttgatccac attagtcttc tttttatatg 360ctatgagtta gatttatttt gtatatttat gagaatttga taaaaattta taatattttc 420aatatatagt ttactatagt taatttaaat tctaagattt acttttttga cagctaccaa 480tatttcaatc aaaaatttgt atctttgtat ttatattaca aattcatact ttttgttcat 540gatttaaaaa ttttagttta taaaattttg gtgaagaaaa tttagaaaac gtttatgtaa 600taattcaaac ttttgaatgt tatatatata tatatatatg aaaaatatat tatgtaaaat 660gtatttttga actcgtctcg gacctccgaa aacc 69權利要求
1.一種轉基因油菜事件Rf3外源插入載體旁側序列，其特征是(1)第1至101個堿基來源于外源插入載體序列，SEQ NO.1；(2)第102至694個堿基來源于油菜基因組序列，SEQ NO.1；(3)由來源于外源插入載體的第1至101個堿基和來源于油菜基因組序列的第102至694個堿基共同組成的DNA序列，轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列；
2.轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列的應用，其特征是(1)利用該序列特征設計轉基因油菜外源基因整合事件Rf3的事件特異性定性PCR檢測方法；(2)利用該序列特征設計轉基因油菜外源基因整合事件Rf3的事件特異性定量PCR檢測方法；(3)利用該序列特征設計轉基因油菜品種Ms8Rf3的品系特異性定性PCR檢測方法；(4)利用該序列特征設計轉基因油菜品種Ms8Rf3的品系特異性定量PCR檢測方法。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因油菜Rf3事件外源插入載體旁側序列及其應用，涉及生物工程技術領域中轉基因油菜的檢測。本發明以轉基因油菜品種Ms8Rf3為材料，利用引物對MDB2015’GCTTGGACTATAATACCTGAC 3’和MDB2695’GGTTTTCGGAGGTCCGAGACG 3’進行PCR擴增，獲得Rf3事件外源插入載體旁側序列，序列為SEQ NO.1。其中第1－101位堿基與插入載體序列相同，第102－694位堿基與插入載體無同源性，為油菜基因組序列。根據插入載體序列和油菜基因組序列的接合序列，設計了引物Rf3RG5’TTTGTACAAAACTTGGACCCCTAGGT 3’和Rf3RV5’TTCTTTCAAGATGGGAATTAACATCT 3’以及TaqMan探針Rf3RP5’FAM－TGCCTTTTCTTATCGCGAGATGAAAAAGGC－TAMRA 3’，建立了轉基因油菜外源基因整合事件Rf3的事件特異性定性、定量檢測方法。本發明用于建立轉基因油菜Ms8Rf3的其他事件特異性PCR檢測方法研究。
文檔編號C12N15/65GK101016554SQ20071005135
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月24日 優先權日2007年1月24日
發明者盧長明, 吳剛, 武玉花, 肖玲 申請人:中國農業科學院油料作物研究所