專利名稱：一種利用微生物細胞制備硒化鎘量子點的方法
技術領域：
本發明屬于納米科學、微生物學、材料合成領域，具體地說，本發明涉及一 種利用微生物細胞制備硒化鎘(CdSe)量子點的方法。
背景技術：
量子點(QuantumDots, QDs)通常指半徑小于或接近激子玻爾半徑的半導體 納米晶粒。它們具有獨特的熒光納米效應，例如其激發譜寬而且連續分布，發射 譜狹窄而對稱，且發光波長可通過改變粒徑和組成進行調控，熒光強度強、漂白 速率慢、靈敏度高，因而近十幾年來引起了人們的廣泛關注，在發光材料、光催 化、光敏傳感器、熒光探針標記等方面有著廣闊的應用前景。尤其是IIB族與VIA 族元素組成的量子點，簡稱為II-VI型量子點(如CdSe、 CdTe等)，由于具有 特殊優良的可見和近紅外光譜區熒光發射性質，有望成為一類新型、方便適用的 生物醫學熒光探針標記物和傳感器。
CdSe是一種應用非常廣泛的II-VI型量子點，它的合成一直倍受關注。1993 年，Murray報道了一種用有機金屬試劑在熱的氧化三正辛基膦(TOPO)溶劑中裂解 制備高質量、單分散(±5%) II-VIQDs的方法，其中重點研究了CdSe量子點的 合成。他們將Cd(CH:,)2和T0PSe(T0P為三正辛基膦)混合到T0P中，然后快速注入 到T0P0溶劑中，這種快速注入使得反應物濃度突然達到過飽和，因而立即發生 成核作用，得到納米顆粒的CdSe，接著經過緩慢的熟化過程和退火處理，再進行 尺寸選擇性沉降和分離即可得到表面被TOPO鈍化的高質量CdSe量子點，量子產 率約為10%，并且通過改變合成溫度，可以控制粒徑(2.4-23nm)，表面的T0P0 可以用吡啶、呋喃等代替。在Murray之后，Alivisatos、 Hines以及0' Brien、 Peng等將這種方法進行改進并對產物的物理化學性質、晶體的生長動力學和產物 形狀的演變機理、形狀的控制等進行了深入研究。盡管用上述方法可以制備高質 量QDs，但是由于Cd(CH:,) 2、 Zn(CH3) 2等金屬有機物劇毒、不穩定、易爆炸，因 此，用它們作原料極其危險，需要的設備條件苛刻。
在此之后，Peng等報道了用CdO代替Cd(CH3) 2，采用己基膦酸(HPA)或十四 垸基膦酸(TDPA)/T0P0 二組分溶劑合成II-VI型QDs的方法。他們發現在熱的 T0P0中，Cd(CH3)2裂解會產生不溶的金屬Cd沉淀，在強的配體，如HPA或TDPA存 在，且MCd/MHPA或MTDPA〈l時，Cd(CH3) 2立即轉變為Cd-HPA/TDPA復合物，再注 入TBPSe (TBP為三丁基膦)，可以生成高質量CdSe納米晶粒。由此，他們推測 Cd(CHj 2并不是必須的反應物。實驗結果表明，用CdO作鎘前體，可以重復性地 單罐合成高質量納米粒子，如CdSe， CdTe， CdS等。而且，由于Cd-HPA/TDPA復 合物相對較高的穩定性，采用這種方法，最初的成核作用可以推遲倒數百秒以后， 這就使得它在實際操作中有幾點重要優點例如注射溫度可以降低，合成的重復 性好；最初的成核作用可以延長；并且CdO既不自燃，也不易爆炸，因此，可以 大量地使用反應原料，這就使得工業規模的合成成為可能。
二十世紀九十年代，那些能夠提供明顯空腔的材料，例如沸石、分子篩、膠 束、共聚物等，被廣泛用作量子點合成的模板，其空腔被用作納米尺度的反應室， 同時，空腔的大小可以起控制粒徑大小的作用。合成過程中，模板既是納米反應 器又是產物的穩定劑，模板大小影響量子點的大小，進而影響它們的光譜性質， 并且，模板表面大量的功能基團使產物幾乎可溶于任何溶劑，還可以與生物配體、 DNA等目標物直接結合。合成的量子點非常穩定。該方法雖然可以在多種多樣的 局限模板里合成一系列納米粒子(如CdSe)，但是合成以后，怎么去掉模板， 或者將粒子從模型中有效分離出來，而不影響粒徑、形狀等性質則是比較麻煩的 問題。
科學家還用微波輔助制備量子點的方法，將CdS04與Na2Se03在水溶液中混合 后經微波回流系統處理，即可制得CdSe量子點，改變微波反應時間，可以得到不 同狀態的產物(Zhu J. J. eta丄，2000, /. C/ e瓜及Vol. 104, 7344)。
用微波輻射加熱，操作簡單、快速，但是非熱效應、超熱效應等一些還不甚被人 們了解的微波現象，影響著產物的均勻性等性質。
上述各種方法中，無機合成路線雖然污染相對較小，但是均在一定程度上存 在產物均一性、粒徑大小等問題；而采用金屬化合物-元素有機物合成路線，雖 然已經可以用CdO、 Cd(Ac)2等無機化合物制備出高質量的裸量子點，但是通常 所使用的核/殼結構量子點的制備基本上仍然要用Cd(CH3) 2、 Zn(CH3) 2等有機金屬 化合物作原料，并且都需要較為苛刻的反應條件，所以如果能夠將這些方法進行 改進，選擇價格低廉、性質穩定的原料，在相對安全、溫和的條件下制備核/殼 結構量子點，無疑將具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是在于提供一種利用微生物細胞制備硒化鎘(CdSe)量子點 的方法，通過該方法可以更加靈活有效地、安全地、低毒地進行CdSe量子點的 合成，其反應條件溫和，原料價格低廉，且操作簡單，生物學實驗室都可完成。
1、 一種利用微生物細胞制備硒化鎘(CdSe)量子點的方法，該方法包括下 列步驟
1) 微生物細胞的培養；
2) 對微生物細胞的硒化處理；
3) 對硒化后細胞進行鎘化處理并繼續培養；
4) 細胞內CdSe量子點的提取；
5) CdSe量子點的純化。
在本發明的一種優化制備硒化鎘(CdSe)量子點的方法中，該方法包括下 列步驟
1) 微生物細胞的培養接種單菌落至微生物細胞培養基(如YPD培養基、 LB培養基)中，當培養細胞生長至穩定生長期，待用。實施例中使用的釀酒酵
母細胞。
2) 對微生物細胞的硒化處理向按步驟1)制備好的微生物細胞懸液中加
入亞硒酸鈉(Na2Se03)，其使用終濃度是0.1毫摩爾/升 10毫摩爾/升，然后繼 續培養1 36小時；
3) 對硒化后細胞進行鎘化處理并繼續培養8000轉/分鐘離心收集經過步驟 2)亞硒酸鈉處理后的細胞，并重新懸浮于新鮮的微生物培養基(此處的微生物 細胞培養基與步驟1)中所使用的培養基一致)中，并向培養基中加入氯化鎘(CdCl2)，其使用終濃度是0.1毫摩爾/升 10亳摩爾/升，繼續培養1 24小時， 隨即量子點在細胞內合成；
4) 細胞內CdSe量子點的提取使細胞裂解，釋放細胞內含物；
5) CdSe量子點的純化細胞外的量子點通過梯度離心(1000轉/分鐘、4000 轉/分鐘、16000轉/分鐘、25000轉/分鐘、30000轉/分鐘)、分子篩和高速離心
(45000轉/分鐘)進行純化，隨后得到CdSe量子點。
在本發明的一種更優化制備CdSe量子點的方法中，該方法包括下列步驟
1) 接種釀酒酵母單菌落至YPD培養基中，培養細胞至穩定生長期，待用；
2) 向步驟l)中所制備好的釀酒酵母細胞懸液中加入Na2Se03，其使用終濃 度是5毫摩爾/升，然后繼續培養24小時；
3) 離心收集經過硒化處理后的釀酒酵母細胞，重新懸浮于新鮮的YPD培養 基中，并向培養基中加入CdCb，其使用終濃度是l毫摩爾/升，繼續培養12小 時，隨即量子點在細胞內合成；
4) 細胞裂解，釋放細胞內含物；
5) 細胞外的量子點通過梯度離心、分子篩和高速離心進行純化，隨后得到 CdSe量子點。
為了實現上述目的，本發明利用微生物細胞合成硒化鎘(CdSe)量子點的方 法，其步驟是
步驟1.微生物細胞的培養。微生物細胞的培養根據微生物細胞的不同可使 用不同的液體培養基，如YPD培養基或者LB培養基。本發明中具體準備過 程包括首先接種微生物細胞的單菌落至培養基(YPD或LB)中，使細胞生 長至穩定生長期，待用。在本發明的具體實例中，挑取釀酒酵母單菌落至50 毫升YPD液體培養基中，在30'C振蕩培養24小時。其中，YPD成分如下
酵母提取物 10克/升
蛋白胨 20克/升
葡萄糖 20克/升
另外，LB培養液成分如下 酵母提取物 5克/升蛋白胨 10克/升
氯化鈉 10克/升
步驟2.對細胞進行硒化處理。向步驟1中所制備的微生物細胞懸液中加入 含硒的鹽溶液，使硒的使用濃度為0.1毫摩爾/升 10毫摩爾/毫升。然后繼續 培養1 24小時。在本發明的具體實例中，0.5毫升亞硒酸鈉(Na2Se03)溶液被 加入50毫升的釀酒酵母細胞懸液中，3(TC震蕩培養12小時。Na2Se03溶液成分 如下
Na2Se03 100克/升
步驟3.對硒化后細胞進行鎘化處理并繼續培養。8000轉/分鐘離心收集經 過步驟2處理后的細胞，并重新懸浮于新鮮的培養基中(此處的微生物細胞培養 基與步驟1)中所使用的培養基一致)，并向培養基中加入鎘鹽溶液，鎘離子的 工作濃度為0.1毫摩爾/升 10毫摩爾/升。然后繼續培養1 24小時，隨即量 子點在細胞內合成。在本發明的具體實例中，0.5毫升氯化鎘(CdCl2)溶液被加 入50毫升的被硒化的釀酒酵母細胞懸液中，3(TC震蕩培養12小時。CdCl2溶液 成分如下
CdCl2 18.3克/升
步驟4.細胞內CdSe量子點的提取。使細胞裂解，釋放細胞內含物，細胞內 所合成的CdSe量子點隨即被釋放到細胞外部。在本發明的具體實例中，通過使 用30毫克/升的纖維素酶(購買于北京華美生物試劑有限公司)和30毫克/升蝸 牛酶(購買于北京華美生物試劑有限公司)消化釀酒酵母細胞壁，并用低滲和超 聲法促使細胞破裂，從而使其內含物釋放出來。
步驟5.CdSe量子點的純化。步驟4的處理將導致細胞破裂，其胞內的蛋白質、 磷脂、核酸和量子點會被釋放到細胞外部。要得到所需的CdSe量子點，需要進一 步純化。在本發明的具體實例中，通過梯度離心、分子篩和高速離心等方法使CdSe 量子點與細胞破裂所釋放到細胞外的蛋白質、磷脂、核酸相互分離，并最終得到 的純凈的CdSe量子點。
在本發明中，所使用的微生物細胞、細胞培養時期、CdCl2與Na2Se03溶液
的加樣量和加樣后的培養條件都十分重要。他們的變化直接影響所合成CdSe量 子點的性質。這要求研究者依照試驗要求嚴格確定所使用的微生物細胞、細胞培
養時期、CdCl2與Na2Se03溶液的加樣量和加樣后的培養條件，以提高試驗的可重 復性。
采用本發明提供的方法與現在所使用的方法相比，本發明的方法簡便、操作 性強，適合直接在生物學實驗室進行合成。和傳統的水相無機合成路線相比，本 發明提供的方法能夠成功地合成CdSe量子點，且高溫下穩定，合成的量子點比 較容易分離得到，產物的均勻性好。與金屬化合物-元素有機物路線相比，本發 明提供的方法合成條件溫和，未使用像TOPO等有毒性的有機試劑，合成過程及 產物對環境污染小，無需使用合成前體，合成過程穩定、不易爆炸，合成成本低 廉，對設備的要求不苛刻，有助于推動納粹顆粒(含量子點)的工業化合成。總而 言之，本發明所提供的方法在以往的量子點合成方法的基礎上有了很大的提高和 改善。
圖l生物細胞制備CdSe量子點的過程示意圖
圖2為酵母細胞進行CdSe量子點合成的細胞熒光的圖片。
經過硒化處理和鎘化處理的酵母細胞在熒光顯微鏡下呈現出熒光(圖2a)， 而單獨硒化處理或鎘化處理的酵母細胞確沒有監測到熒光(圖2b， c)。這暗示 細胞內有可發熒光的物質生成，且這種物質與Cd和Se有關。
圖3為經過生物細胞合成后的CdSe量子點電鏡圖
將純化后的產物滴到覆蓋有無定形碳膜的銅網上，烘干后，放入配備有Dual vision 300 W CCD (Gatan corporation)的JE0L-JEM 2010EF透射電子顯微鏡 (HRTEM)進行觀察，加速電壓為200kV。 TEM數據顯示所得的晶體顆粒大小范圍是 2-5nm，形狀為六邊形，且相關晶體參數與以報道的合成的CdSe結構的參數一致。 另外在圖中還可以看到，晶體有很好的單分散性以及粒徑均一性。
圖4為經過生物細胞合成后的CdSe量子點的能譜分析(EDAX)圖
用TEM配帶的EDX對CdSe量子點樣品進行元素分析的結果。結果表明Cd和Se
確實是產物中的主要成分，其中Cd: Se=l. 13: 1 (質量比)，Cd: Se = l: 1.28 (摩
爾比)。說明利用微生物細胞合成的晶體組成為CdSe。
圖5為經過生物細胞合成后的CdSe量子點的電感耦合等離子體一原子發射 光譜(ICP—AES)結果
使用Vario EL III元素分析儀對經過處理的樣品進行電感耦合等離子體—原 子發射光譜測定。結果顯示Cd: Se^.2:l(質量比)，Cd: Se=l: 1.17 (摩爾比)。說 明我們得到的晶體元素組成為CdSe。
圖6不同濃度的Na2Se03處理酵母細胞不同時間對合成CdSe量子點粒徑的 影響。
使用O.l、 1和10毫摩爾/升的Na2SeO3處理酵母細胞0 25小時，然后收集細 胞，并使細胞與l毫摩爾/升的CdC12繼續孵育12小時。TEM下測定CdSe晶體粒徑。
圖7用不同濃度的CdC12處理硒化后的酵母細胞不同時間對合成CdSe量子 點粒徑的影響。
使用1毫摩爾/升Na2Se03處理酵母細胞24小時，然后收集細胞，并使細胞 分別與o.l、 1和10毫摩爾/升的CdC12繼續孵育0 40小時。TEM下測定CdSe 晶體粒徑。
具體實施例方式
下面結合具體實施例。進一步闡述本發明，應當理解，這些實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。
實施例1:
1. 酵母細胞的培養
首先接種釀酒酵母單菌落至YPD培養基中，3(TC震蕩培養24小時；待用。
2. 對釀酒酵母細胞的硒化處理
0.05毫升、0.5毫升、5毫升的Na2Se03 (100毫克/升)溶液分別被加入三 瓶步驟1中所得到的釀酒酵母細胞懸液中(每瓶50毫升細胞懸液)，3(TC震蕩培 養0 25小時。
3. 細胞的鎘化處理合成及細胞內CdSe量子點的合成
經過步驟2后得到的細胞懸液8000轉/分鐘離心3分鐘，棄去上清。并重懸 于新鮮的YPD培養基中。然后再加入0.5毫升100毫摩爾/升的CdC12溶液，30 'C震蕩培養12小時。
4. 細胞內CdSe量子點的提取
經過步驟3得到的細胞懸液8000轉/分鐘離心3分鐘，棄去上清。用1毫 升0. 05摩爾/升的EDTA (pH 7. 3 7. 6)重新使酵母細胞懸起。并再次離心(8000 轉/分鐘，5分鐘)，棄上清。再次用1毫升0. 05摩爾/升的EDTA (pH 7. 3 7. 6) 重新懸起細胞，加入60微升巰基乙醇溶液，3(TC震蕩反應30分鐘。隨后5000轉 /分鐘離心，棄上清，并用1摩爾/升的山梨醇洗滌兩次，再次離心棄去上清， 加入l毫升30毫克/毫升的蝸牛酶和l毫升30毫克/毫升的纖維素酶，震蕩反 應30分鐘。之后離心棄上清，把細胞重新懸于去離子水中，進行10分鐘的超聲 波處理。經過以上步驟，細胞內部合成的CdSe量子點就被釋放到細胞外部了。
5. CdSe量子點的純化
使用差速離心的方法，收集4000 16000轉/分鐘的離心沉淀。然后使用葡 聚糖(G200和G25)的分子篩進行分離純化，隨后即得到較純凈的CdSe量子點。
實施例2:
1. 酵母細胞的培養 首先接種釀酒酵母單菌落至YPD培養基中，3CTC震蕩培養24小時；待用。
2. 對釀酒酵母細胞的硒化處理
0. 5毫升的Na2Se03 (100毫克/升)溶液分別被加入50毫升步驟1中所得 到的釀酒酵母細胞懸液中，3(TC震蕩培養24小時。
3. 細胞的鎘化處理合成及細胞內CdSe量子點的合成
經過步驟2后得到的細胞懸液8000轉/分鐘離心3分鐘，棄去上清。并重懸 于新鮮的YPD培養基中。然后再分別加入0. 05毫升、0. 5毫升和5毫升的CdC12 溶液(濃度為100毫摩爾/升)，3(TC震蕩培養0 40小時。
4. 細胞內CdSe量子點的提取
經過步驟3得到的細胞懸液8000轉/分鐘離心3分鐘，棄去上清。用1毫 升0. 05摩爾/升的EDTA (pH 7. 3 7. 6)重新使酵母細胞懸起。并再次離心(8000 轉/分鐘，5分鐘)，棄上清。再次用l毫升0.05摩爾/升的EDTA (pH7.3 7.6) 重新懸起細胞，加入60微升巰基乙醇溶液，3(TC震蕩反應30分鐘。隨后5000轉 /分鐘離心，棄上清，并用1摩爾/升的山梨醇洗滌兩次，再次離心棄去上清， 加入1毫升30毫克/毫升的蝸牛酶和1毫升30毫克/毫升的纖維素酶，震蕩反 應30分鐘。之后離心棄上清，把細胞重新懸于去離子水中，進行10分鐘的超聲 波處理。經過以上步驟，細胞內部合成的CdSe量子點就被釋放到細胞外部了。
5. CdSe量子點的純化
使用差速離心的方法，收集4000 16000轉/分鐘的離心沉淀。然后使用葡 聚糖(G200和G25)的分子篩進行分離純化，隨后即得到較純凈的CdSe量子點。
權利要求
1、一種利用微生物細胞制備硒化鎘量子點的方法，該方法包括下列步驟A、微生物細胞的培養接種單菌落至微生物細胞培養基中，培養基為YPD培養基或LB培養基，當培養細胞生長至穩定生長期，待用；B、對微生物細胞的硒化處理向步驟A制備好的微生物細胞懸液中加入亞硒酸鈉，其使用終濃度是0.1毫摩爾/升～10毫摩爾/升，然后繼續培養1～36小時；C、對硒化后細胞進行鎘化處理并繼續培養8000轉/分鐘離心收集經過步驟B亞硒酸鈉處理后的細胞，并重新懸浮于新鮮的微生物培養基中，并向培養基中加入氯化鎘，其使用終濃度是0.1毫摩爾/升～10毫摩爾/升，繼續培養1～24小時，隨即量子點在細胞內合成；D、細胞內CdSe量子點的提取使細胞裂解，釋放細胞內含物；E、CdSe量子點的純化細胞外的量子點通過梯度離心，1000轉/分鐘、4000轉/分鐘、16000轉/分鐘、25000轉/分鐘、30000轉/分鐘，分子篩和高速離心45000轉/分鐘進行純化，得到CdSe量子點。
全文摘要
本發明公開了一種利用微生物細胞合成硒化鎘量子點的方法，其步驟是A.微生物細胞的制備；B.對微生物細胞進行硒化處理；C.細胞的鎘化處理合成并繼續培養；D.細胞內CdSe量子點的提取；E.CdSe量子點的純化。本發明方法簡便，操作性強，不使用金屬有機化合物，無需使用惰性氣體保護，安全性好，成本低廉。有助于推動納米顆粒(含量子點)的工業化合成。
文檔編號C12N1/20GK101096687SQ20071005269
公開日2008年1月2日 申請日期2007年7月11日 優先權日2007年7月11日
發明者劉茴茴, 然 崔, 龐代文, 謝志雄 申請人:武漢大學