專利名稱：一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于甾醇生物轉化技術領域。具體涉及利用環糊精及其衍生物的甾醇生物轉化方法及其應用。
背景技術：
甾醇是環戊烷多氫菲為骨架(又稱甾核)的一種物質，在自然界中以游離態和結合態形式存在。外觀呈白色至類白色結晶性粉末。甾醇可分為動物性甾醇，植物性甾醇和微生物甾醇等三大類。動物性甾醇以膽固醇為主，植物性甾醇主要為谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等，存在于植物種子中。
世界上合成甾體藥物的原料80％以上是將甾醇側鏈降解獲得雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾1，4-烯-3，17-二酮(ADD)，微生物轉化甾醇后得到的AD和ADD最為重要，對4-AD和ADD的活性部位進行改造，可以合成出多種甾體藥物。降解側鏈有化學合成法、微生物轉化法和酶轉化法。微生物轉化法因甾醇不溶于水，與微生物細胞內產生的生物酶較難有效接觸，因而底物利用率低，反應速率低。袁東超等人2003年發表于天津輕工業學院學報第四期的文章“分枝桿菌降解大豆甾醇側鏈的發酵研究”，該文章對分枝桿菌(Mycoba cterium sp.)JY-1降解大豆甾醇(BS)側鏈至4-烯-雄甾-3，17-二酮(4-AD)和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮(ADD)的培養基組成、種子培養時間、通氣量、投料方式及時間等發酵條件進行了研究，投料濃度為0.3％，但轉化率最高不超過50％。
中國專利03142115.6公開了雄甾-1，4-雙烯-3，17-雙酮生物轉化濁點系統的優化方法，該發明采用非離子表面活性劑Triton X-100和Triton X-114，底物膽固醇的濃度為0.5-2.0g/100ml，微生物轉化時間5-9天。菌種采用分枝桿菌Mycobacterium sp NRRLB-3683對膽固醇的邊鏈進行切除。張裕卿等人2006發表于微生物學通報第二期雜志上的文章“植物甾醇微生物轉化制備甾體藥物中間體的研究進展”報道了諾卡氏菌、分枝桿菌、節桿菌和假單胞桿菌等微生物都能將甾醇類化合物作為碳源利用，而使甾醇降解。其中分枝桿菌應用最為廣泛。其中包括采用NRRL B-3805處理甾醇得到AD和ADD。申請人阿克佐諾貝爾公司申請的中國專利申請號為03804973.2，名稱為將植物甾醇發酵制備雄二烯二酮的方法專利，該專利將植物甾醇組合物發酵以制備雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮)和隨后的雄二烯二酮(雄-1，4-二烯-3，1-二酮)的方法，其包括在第一營養培養基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養物；將微生物培養物和植物甾醇組合物在生物反應器中放置足夠的時間以將組合物基本上轉化為雄烯二酮(“AD溶液”)；在第二營養培養基中增殖鐮孢屬的真菌培養物；將1)鐮孢屬物種或2)真菌培養物培養基中的一種或多種注入生物反應器中，反應足夠的時間以將AD溶液轉化為雄二烯二酮。
微生物轉化甾醇等疏水性化合物常受到一些因素的嚴重制約底物在水中的溶解度很小，限制了其生物利用度，產物/底物對微生物具有抑制作用，生物轉化時間長，轉化效率低等缺點。
環糊精是從淀粉得到的六個以上D-吡喃葡萄糖單元以alpha-1，4-糖苷鍵連結的具有環狀疏水圓錐型結構(右上旋轉的環糊精模型)的低聚糖非還原性化合物系列。在這個環糊精系列中，它們的命名基于環中葡萄糖基的數量，以6個D-吡喃葡萄糖單元組成的環狀糊精，稱為α-環糊精(alpha-CD)，以此類推，7個的稱為β-環糊精(beta-CD)，8個的稱為γ-環糊精(gamma-CD)。由于環糊精的外部親水而內腔疏水，因而它能夠像酶一樣提供一個疏水的結合部位，作為主體包結各種適當的客體，如有機分子、無機離子以及氣體分子等。這種選擇性的包結作用即通常所說的分子識別，其結果是形成主客體包結物。在α-、β-、γ-CD基礎之上，對其進行修飾如酯化、醚化，烷基化、羥基化得到環糊精衍生物。主要的衍生物有羥丙基、甲基及磺丁基醚-β-環糊精等。這些基團的引入，并不影響中央空穴對客體分子的容納能力，但能夠改善環糊精的某些理化性質和包結能力。環糊精通過改性，可提高包結物或超分子復合體在水中的溶解度，構筑立體幾何關系，形成特殊的手性位點和弱作用力模型，這大大擴展了環糊精的應用領域。
如何有效利用環糊精及其衍生物的特性提高甾醇的生物轉化效率是一個值得探索和研究的課題。這方面的研究對于高效率獲得甾醇生物轉化產品具有重要意義。
本發明介紹的環糊精包結技術是利用環糊精及其衍生物的包埋作用可有效提高轉化底物的溶解性，選擇合適的環糊精與底物之間的分子比率以及作用條件的控制，可提高反應的速率和產物的收率。

發明內容
本發明解決的技術問題是提供一種利用環糊精及其衍生物的甾醇生物轉化方法，本發明也提供了環糊精及其衍生物在甾醇生物轉化方面的應用。
本發明技術方案如下即在添加有甾醇的微生物轉化反應體系中按一定比例添加環糊精或環糊精衍生物，生物轉化的主要微生物有分枝桿菌和節桿菌，生物轉化的基本過程包括如下步驟
1.微生物菌種活化培養微生物菌種斜面培養后轉接到液體培養基中培養。
2.甾醇生物轉化將活化的液體種子接入加有甾醇的轉化培養基中，在0h～60h時加入環糊精或其衍生物，培養到72h～110h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
微生物菌種活化培養菌種轉接于新鮮斜面上，27～32℃培養2～4d，制備菌懸液，按1％～10％的接種量接入液體培養基中，在27～32℃、160～220r/min條件下培養20～50h；甾醇生物轉化工藝條件將液體種子按照4％～20％的接種量接入轉化培養基中，在27～32℃、160～200r/min條件下培養。
本發明中轉化培養基的合適微生物接種量為4％～15％；本發明中轉化培養基用微生物合適種齡在30-40h；本發明中微生物菌種活化培養合適溫度為27～30℃，優選溫度29℃。
本發明中甾醇與環糊精或其衍生物的摩爾比為1∶0.3～4；甾醇與環糊精或其衍生物的合適摩爾比為1∶1～3。
本發明所用甾醇包括膽固醇、谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇及由各種甾醇按照任意比組成的甾醇混合物。
本發明中所用環糊精及其衍生物包括本發明所述的環糊精或其衍生物分別選用β-環糊精(beta-CD)，γ-環糊精(gamma-CD)，羥丙基-β-環糊精、磺丁基醚-β-環糊精，雙糖基-β-環糊精，二甲基-β-環糊精，羥乙基-β-環糊精。
本發明中采用的微生物主要有分枝桿菌和節桿菌。分枝桿菌有Mycobacteriumsp.NRRL B-3683，分枝桿菌(Mycobacterium sp.)JY-1，Mycobacterium sp.NRRL B-3805；節桿菌為Arthrobacter sp.CICC 10193。
本發明所用的轉化培養基成分主要包括葡萄糖，檸檬酸，檸檬酸亞鐵按，硫酸鎂，磷酸氫二鉀，磷酸氫二銨，pH7.0～pH7.4。本發明所用的轉化培養基組成為(g/L)葡萄糖10，檸檬酸2，檸檬酸亞鐵按0.05，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.5，磷酸氫二銨3.5，pH7.2。
本發明中甾醇可以在轉化培養基配制時加入或轉化培養的30小時內加入，甾醇添加量為轉化培養基的0.3％-2％。
本發明的另一技術方案步驟如下即在微生物轉化培養基中添加環糊精或環糊精衍生物與甾醇的混合體，生物轉化的主要微生物有分枝桿菌和節桿菌，生物轉化的基本過程包括如下步驟
1.微生物菌種活化培養微生物菌種斜面培養后轉接到液體培養基中培養。
2.甾醇生物轉化將活化的液體種子接入轉化培養基中，在0h-60h時加入甾醇，環糊精或其衍生物，培養到72h-170h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
微生物菌種活化培養菌種轉接于新鮮斜面上，27～32℃培養2～4d，制備菌懸液，按1％～10％的接種量接入液體培養基中，在27～32℃、160～220r/min條件下培養20-50h；甾醇生物轉化工藝條件將液體種子按照4％-20％的接種量接入轉化培養基中，在27～32℃、160～220r/min條件下培養。
本發明中轉化培養基的合適微生物接種量為4％～15％；本發明中轉化培養基用微生物合適種齡在30～40h；本發明所用甾醇為菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽固醇或由菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽固醇按照任意比組成的混合物。
本發明中所用環糊精及其衍生物包括本發明所述的環糊精或其衍生物分別選用β-環糊精(beta-CD)，γ-環糊精(gamma-CD)，羥丙基-β-環糊精、磺丁基醚-β-環糊精，雙糖基-β-環糊精，二甲基-β-環糊精，羥乙基-β-環糊精。本發明微生物轉化實驗條件本發明中采用的微生物主要有分枝桿菌和節桿菌。
分枝桿菌有Mycobacterium sp.NRRL B-3683，分枝桿菌(Mycobacterium sp.)JY-1，Mycobacterium sp.NRRL B-3805；節桿菌為Arthrobacter sp.CICC 10193。
本發明中轉化率是產物與所加底物的摩爾比。
本發明中環糊精或其衍生物與甾醇混合物的制備包括下列及其他混合方法1.高速組織搗碎法將環糊精或其衍生物置于高速搗碎機中，加入150ml蒸餾水搗至溶解，將用乙酸乙酯溶解的甾醇加入飽和液中，轉速8000r/min，攪拌30min。
2.超聲波法用0.5％的Tween80乳化甾醇，然后將環糊精或其衍生物加入，用30W-60W的超聲波乳化3min左右。
分析檢測方法用乙酸乙酯萃取發酵液，離心，取乙酸乙酯相1mL于1.5ml的小離心管中，自然風干后加1mL的流動相，離心后進行HPLC分析。用Phenomenex C18柱，流動相為甲醇∶水(4∶1)，流速為1mL/min，檢測波長為254nm。
有益效果
添加環糊精或其衍生物后甾醇生物轉化的周期縮短，由對照的7d縮短至3-6d；底物濃度和轉化率均大幅度提高，在底物濃度為0.3％～2％的濃度范圍內；轉化率由對照的5％～35％提高為50％～95％；本發明將環糊精或其衍生物加入轉化底物體系中形成一種超分子反應介質系統，有效的增加了疏水性化合物的溶解并促進了生物轉化的進行。
甾醇化合物在水中的溶解度很低，屬難溶性或微溶性化合物。采用添加環糊精或其衍生物后溶解度增加，環糊精或其衍生物與甾醇混合物也同樣達到上述目的；采用還有環糊精的特殊作用使反應底物由固相轉移至反應相，使得底物與生物酶的接觸更為方便，轉化反應速率加快，并在一定程度上解除了底物/產物對生物酶活性的抑制作用，使反應的轉化率提高，提高產物的收率，發酵轉化周期明顯縮短。環糊精作為超分子在生物轉化中形成了一種特殊的超分子介質系統，其本身不參與生物轉化反應，也不影響細胞的生長比速率和細胞密度，僅僅作為甾醇增溶劑和反應載體。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例以混合植物甾醇為例實施例1微生物菌體斜面活化培養取一環斜面菌種轉接于新鮮斜面上，29℃培養3d。
微生物菌體液體種子活化培養用0.5％的Tween80無菌水溶液洗下斜面培養的種子，使菌懸液A600值控制在1.0±0.2，按2％的接種量接入轉化培養基中，在27℃、200r/min條件下活化培養36h。
植物甾醇轉化液體種子按5％的接種量接入轉化培養基(預先加入1％的植物甾醇)中，在30h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到72h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
微生物菌種采用Mycob acterium sp.NRRL B-3683斜面培養基(g/L)磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，檸檬酸鐵銨0.05，檸檬酸2，硝酸銨2，碳酸鈣10，甘油20，葡萄糖5，瓊脂15。
種子培養基(g/L)∶磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，檸檬酸2，硝酸銨2，檸檬酸鐵銨0.05，碳酸鈣10，甘油20，葡萄糖5。
轉化培養基(g/L)∶葡萄糖10，檸檬酸2，檸檬酸亞鐵按0.05，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.5，磷酸氫二銨3.5，植物甾醇10，pH7.2。
植物甾醇由谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇以1∶1∶1的比例組成。植物甾醇與羥丙基-β-環糊精摩爾比為1∶2，經分析檢測轉化率為80.8％。同等條件下對照的轉化率為12.7％。
實施例2基本方法同例1微生物斜面活化培養取一環斜面菌種轉接于新鮮斜面上，29℃培養3d。
微生物菌體液體種子活化培養用0.5％的Tween80無菌水溶液洗下斜面培養的種子，使菌懸液A600值控制在1.0±0.2，按2％的接種量接入轉化培養基中，在30℃、200r/min條件下活化培養30h。
植物甾醇轉化液體種子按5％的接種量接入轉化培養基(預先加入0.5％植物甾醇)中，在24h時加磺丁基醚-β-環糊精，培養到72h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。植物甾醇與磺丁基醚-β-環糊精摩爾比為1∶1.5，微生物菌種采用Mycob acterium sp.NRRLB-3683。植物甾醇由谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇以1∶1∶2的比例組成。
經分析檢測轉化率為90.8％。同等條件下對照的轉化率為27.7％實施例3基本方法同例1微生物在28℃、200r/min條件下活化培養36h，10％的接種量接入轉化培養基(預先加入1％植物甾醇)中，在36h時加入羥丙基-β-環糊精，摩爾比例為羥丙基-β-環糊精植物甾醇＝2∶1，培養到84h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。植物甾醇與羥丙基-β-環糊精摩爾比為1∶2，植物甾醇由谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇以2∶1∶1的比例組成。微生物菌種采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683。轉化率為81.9％，對照實驗轉化率是27.7％。
實施例4基本方法同例1微生物在29℃、200r/min條件下活化培養30h，10％的接種量接入轉化培養基中，在30h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到120h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
轉化培養基中預先加入由由谷甾醇、豆甾醇和膽固醇以2∶1∶1的比例組成的混合物。甾醇混合物的添加比例為轉化培養基的2％。甾醇與羥丙基-β-環糊精摩爾比為1∶2，轉化率為72.5％，對照實驗轉化率是7.2％。微生物菌種采用Mycobact eriumsp.NRRL B-3683。
實施例5基本方法同例1微生物在29℃、200r/min條件下活化培養30h，10％的接種量接入轉化培養基中，在30h時加雙糖基-β-環糊精，培養到96h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
轉化培養基中預先加入由由谷甾醇、豆甾醇和膽固醇以2∶1∶1的比例組成的混合物。甾醇混合物的添加比例為轉化培養基的1.5％。甾醇與雙糖基-β-環糊精摩爾比為1∶1.5，轉化率為78.5％，對照實驗轉化率是18.6％。微生物菌種采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683。
實施例6基本方法同例1微生物在30℃、200r/min條件下活化培養30h，15％的接種量接入轉化培養基中，在48h時加入0.4倍(與甾醇摩爾比)的β-環糊精，培養到132h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
轉化培養基中預先加入由菜油甾醇、豆甾醇和膽固醇以2∶1∶1的比例組成的混合物。甾醇混合物的添加比例為轉化培養基的0.5％。甾醇與β-環糊精摩爾比為1∶0.4。微生物菌種采用Mycobact erium sp.NRRL B-3683。
轉化率為54.9％，對照實驗轉化率是35.7％。
實施例7基本方法同例1微生物在30℃、200r/min條件下活化培養28h，15％的接種量接入轉化培養基中，在50h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到96h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
轉化培養基中預先加入0.5％的植物甾醇。羥丙基-β-環糊精/植物甾醇＝2∶1轉化率為91.5％，對照實驗轉化率是34.1％。微生物菌種采用Mycobacteriumsp.NRRL B-3683。
實施例8基本方法同例1微生物在30℃、200r/min條件下活化培養30h，15％的接種量接入轉化培養基中，在12h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到108h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。轉化培養基中預先加入2％的植物甾醇。微生物菌種采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683。
羥丙基-β-環糊精/植物甾醇＝2∶1。轉化率77.3％對照6.8％實施例9基本方法同例1微生物在30℃、200r/min條件下活化培養28h，15％的接種量接入轉化培養基中，在30h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到72h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。轉化培養基中預先加入0.5％的植物甾醇。羥丙基-β-環糊精/植物甾醇＝1∶1。轉化率84.4％對照轉化率27.7％采用的微生物為節桿菌為Arthrobacter sp.CICC 10193。
實施例10基本方法同例1微生物在30℃、200r/min條件下活化培養34h，10％的接種量接入轉化培養基中，在30h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到96h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。轉化培養基中預先加入1.5％的植物甾醇。羥丙基-β-環糊精/植物甾醇＝2∶1。轉化率60.7％對照18.5％。采用的微生物為Mycobacteriumsp.NRRL B-3805。
實施例11基本方法同例1微生物在32℃、160r/min條件下活化培養24h，10％的接種量接入轉化培養基中，在26h時加入羥丙基-β-環糊精，培養到70h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。在轉化培養22h時加入0.5％的植物甾醇。羥丙基-β-環糊精/植物甾醇＝1∶1。轉化率55.4％對照32.3％。采用的微生物為節桿菌Arthrobactersp.CICC 10193。
實施例12基本方法同例1即在微生物培養基中添加環糊精或環糊精衍生物與甾醇的混合體，生物轉化的基本過程包括如下步驟1.微生物菌種活化培養微生物菌種活化培養菌種轉接于新鮮斜面上，28℃培養2d，制備菌懸液，按10％的接種量接入液體培養基中，在28℃、200r/min條件下培養25h。
2.甾醇生物轉化將活化的液體種子接入轉化培養基中，同時加入谷甾醇與羥丙基-β-環糊精的混合物，培養到96h時將培養液加熱至微沸，中止轉化，自然降至室溫，待分析。
甾醇生物轉化工藝條件將液體種子按照5％的接種量接入轉化培養基中，在28℃、200r/min條件下培養。谷甾醇添加量占培養基的1.5％。谷甾醇與羥丙基-β-環糊精比例為1∶3。采用的微生物為Mycobacterium sp NRRL B-3683。本例中環糊精或其衍生物與甾醇混合物的制備采取下列方法高速組織搗碎法將環糊精或其衍生物置于高速搗碎機中，加入150ml蒸餾水搗至溶解，將用乙酸乙酯溶解的甾醇加入飽和液中，轉速8000r/min，攪拌30min。轉化率為66.8％，轉化時間4d。對照實驗轉化率是18.6％。
權利要求
1.一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于添加有甾醇的微生物轉化反應體系中添加環糊精或環糊精衍生物，微生物為分枝桿菌和節桿菌，生物轉化的基本過程包括如下步驟1.微生物菌種活化培養；2甾醇生物轉化將活化菌種加入有甾醇的轉化培養基中，在0h-60h加入環糊精或其衍生物，培養結束后培養液加熱至微沸，中止轉化。
2.根據權利要求1所述的一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于環糊精及其衍生物為β-環糊精，γ-環糊精，羥丙基-β-環糊精、磺丁基醚-β-環糊精，雙糖基-β-環糊精，二甲基-β-環糊精，羥乙基-β-環糊精。
3.根據權利要求1或2所述的一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于所述甾醇為菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽固醇或由菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽固醇按照任意比組成的混合物。
4.根據權利要求1或2所述的一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于所述活化菌種的合適種齡為20-50h。
5.根據權利要求1所述的一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于所述甾醇與環糊精或其衍生物的摩爾比為1∶0.3-4。
6.根據權利要求1或5所述的一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于所述甾醇與環糊精或其衍生物的摩爾比為1∶1-3。
7.根據權利要求1所述的一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法，其特征在于所述分枝桿菌為NRRL-B3683、NRRL-B3805或JY-1；節桿菌為CICC10193菌種。
8.甾醇生物轉化用培養基組成為(g/L)葡萄糖10，檸檬酸2，檸檬酸亞鐵按0.05，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.5，磷酸氫二銨3.5，pH7.2。
9.一種環糊精及其衍生物在甾醇生物轉化方法，其特征在于甾醇生物轉化培養基中添加環糊精或環糊精衍生物與甾醇的混合體，微生物為分枝桿菌和節桿菌，生物轉化的基本過程包括如下步驟1.微生物菌種活化培養微生物菌種斜面培養后轉接到液體培養基中培養；2甾醇生物轉化將活化的液體種子接入轉化培養基中，在0h-60h時加入甾醇，環糊精或其衍生物，培養到72h-170h時將培養液加熱至微沸，中止轉化。
10.環糊精及其衍生物在甾醇生物轉化中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種利用環糊精的甾醇生物轉化方法及其應用，本發明屬于甾醇生物轉化技術領域。具體涉及利用環糊精及其衍生物的甾醇生物轉化方法及其應用。本發明提供一種利用環糊精及其衍生物的甾醇生物轉化方法及應用。采用在轉化系統中按比例添加環糊精或其衍生物或使底物與環糊精或其衍生物按一定比例形成包結物的方法，使轉化更易進行。本發明方法特別適用于疏水性化合物的微生物轉化，能夠有效提高反應底物在水溶液中的溶解度，提高底物的利用率和反應速率，并在一定程度上解除底物和產物抑制，提高產物的轉化率。采用本發明底物濃度為3～20g/L時，轉化周期縮短為3～4d，對應的轉化率為50％～95％，具有較好的工業應用價值。
文檔編號C12P33/16GK101020919SQ20071005695
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月19日 優先權日2007年3月19日
發明者王敏, 杜連祥, 駱健美, 申雁冰, 肖克勝 申請人:天津科技大學