專利名稱：以增強型綠色熒光蛋白為報告基因的biv指示細胞系的制作方法
以增強型綠色熒光蛋白為報告基因的BIV指示細胞系
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測牛免疫缺陷病毒感染的細胞系，以及該細胞系的建立方法和 它的具體應用。
背景技術：
牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus ， BIV)與人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus ， HIV)同屬于反轉錄病毒科慢病毒屬，與HIV基因組高度同源， 其遺傳、復制方式、與宿主細胞的相互關系、致病機理等與HIV極其類似，用其作為一種 艾滋病研究模型,用于探討慢病毒基因表達調控、慢病毒與其它病毒超感染后病毒間以及 病毒與宿主細胞間的相互作用，具有很高的安全性。建立BIV指示細胞系是研究BIV的分 子生物學的有力工具。
指示質粒穩定轉染可以被病毒感染的細胞系，該細胞系稱為指示細胞系。該細胞系的 基因組含有被病毒反式激活因子的應答元件調控的報告基因，病毒感染或病毒的反式激活 因子可以特異性啟動病毒反式激活因子的應答元件下游的報告基因的表達，通過檢測報告 基因產物，指示病毒的感染。傳統的在細胞培養中病毒感染的識別方法主要有觀察細胞病 變法。細胞病變法測定的病毒滴度依賴實驗者的肉眼觀察，主觀性較大，不同實驗者可能 得出不同的結果。與傳統的檢測方法相比，指示細胞系具有快速，簡便，靈敏的特點。

發明內容
本發明的目的是提供一株可以快速簡便地檢測牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子 的指示細胞系以及該細胞系的應用。
本發明提供的牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus ，BIV)感染的指示 細胞系，已于2007年5月16日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心"(北京市海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCCNo. 2050 。
本發明提供的細胞系的制備方法如下
首先構建成一個可以應答牛免疫缺陷病毒感染的指示質粒，其具體核苷酸序列如序列 表1所示，即將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因插入到一種特異應答牛免疫缺陷病毒 反式激活因子的應答元件下游，質粒含有G418抗性基因。所述的特異應答牛免疫缺陷病 毒反式激活因子的應答元件是BIV LTR中U3和TAR區，不含有負調控區域U5區。
將該質粒轉染幼倉鼠腎細胞(Baby Hamster Kidney cell, BHK-21)，加入G418進行 篩選穩定表達的細胞系，初篩三周后，將抗性細胞進行單克隆化；通過轉染BIV反式激活-
因子24小時后用熒光顯微鏡觀測綠色熒光來分別鑒定每個單克隆特異響應BIV反式激活 因子的能力，最終挑選無本底表達但經過BIV病毒攻擊后EGFP表達量高的陽性克隆即為 BIV的指示細胞系。
本發明的檢測牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的新方法是BIV感染或BIV反 式激活因子Tat轉染BIV指示細胞系，BIV指示細胞系的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因表達，使細胞發出綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀 察綠色熒光間接指示BIV的感染或BIV Tat的激活，激活作用也可以用流式細胞儀定量檢
該細胞系應用可示例于如下研究BIV Tat及JDV Tat的激活機制，研究BIV原克 隆的感染性，研究病毒的超感染，檢測BIV病毒在上清或凍融裂解液中的感染性，鑒定某 種因子對BIV復制的抑制或促進作用，鑒定某種因子對BIV Tat的抑制或促進作用。
本發明的優點和積極效果
本發明細胞系具有以下優點以EGFP為報告基因，無需外加底物或裂解細胞，操作 簡便易行；可以通過熒光顯微鏡實時觀察，了解感染的動態過程；可以通過流式細胞儀定 量檢測；在病毒感染或反式因子轉染12小時后細胞即可觀察到綠色熒光，即使一兩個綠 色熒光細胞也可以檢測出來，靈敏快速。
本發明的應用價值在于-
(1) BIV分子生物學研究的有力工具。對BIV的深入了解，有助于了解同屬反轉錄病 毒的HIV的分子特性，推動慢病毒的基礎研究。
(2) 應用于JDV的分子生物學的研究。JDV是近年新發現的一種使牛急性發病的反轉 錄病毒，但目前對其了解甚少。JDV基因組與BIV有很高同源性。JDV Tat同樣能夠激活 BIV LTR，應用指示細胞系可以指示JDV Tat的激活作用。
(3) BIV與HIV的分子生物學特性相近，但BIV不感染人，可以不用在P3實驗室操 作。應用該指示細胞系和BIV病毒建立抗反轉錄病毒感染的藥物篩選模型，對有抗AIDS 活性的藥物進行初篩，從而降低研究的安全風險，操作簡便。
具體實施方式
實施例1
以EGFP為報告基因的BIV指示細胞系的建立 1.構建指示質粒
以BIV原克隆質粒BIV127為模板，PCR反應擴增BIV LTR中U3+TAR區段，不含有
負調控區U5,這一段啟動子可以更好地響應Tat激活。將其連接到去除CMV啟動子的真 核表達載體pEGFP-Nl中，構建成BIV指示質粒。pEGFP-Nl載體上含有neo基因，可以使 轉染該質粒的細胞具有G418抗性。該質粒中，U3+TAR區在報告基因EGFP上游，直接調 控報告基因的表達。BIV反式激活因子Tat可以結合在TAR上，從而起始下游報告基因的 轉錄，通過觀察EGFP蛋白的綠色熒光可以判斷BIV感染水平。瞬時轉染BIV Tat和指示 質粒，觀察綠色熒光，鑒定指示質粒具有指示BIV感染的功能。 2.建立穩定整合指示質粒的指示細胞系
將指示質粒轉染B服-21細胞，轉染后第二天，在培養基中加入600ug/ml的G418， 一星期后細胞開始大量死亡，到第14天對照孔細胞全部死亡，至20天，細胞開始成簇生 長，此時生長的細胞即為細胞基因組中己經整合了質粒的陽性克隆；經過初篩后，有限稀 釋法進行單克隆化進行單克隆操作，將分離到的單克隆細胞株擴大培養，轉染BIVTat進 行指示功能的鑒定，篩選無本底表達但相應BIVTat蛋白的激活發出較強綠色熒光的陽性 克隆，再用FBL-R29共培養檢測其對BIV病毒的響應。
實施例2
應用BIV指示細胞系指示BIV病毒的感染
將BIV R29感染的FBL與BIV指示細胞系以1: 1的比例共培養，使用熒光顯微鏡觀 察綠色熒光，感染12小時后即可看見微弱熒光，熒光的強度隨時間而增強，發綠色熒光 的細胞和合胞體也逐漸增多，在24小時后即可明顯看到綠色熒光的細胞和合胞體。BIV 指示細胞系的指示功能長期有效，長期培養感染BIV后的指示細胞系，感染兩周后仍可見 綠色熒光。
實施例3
應用BIV指示細胞系指示反式激活因子的激活
1. 指示BIV Tat的激活
以105接種量將BIV指示細胞系鋪到12孔板的兩個孔，24小吋后以PEI為轉染試劑 進行轉染，BIV Tat真核表達質粒和pCDNA3. 1為負對照各500ng， 12小時后轉染BIV Tat 的孔即可觀察到綠色熒光，24小時后綠色熒光明顯可見，而轉染空載體的負對照孔無綠 色熒光。
2. 指示JDV Tat的激活
JDV反式激活因子JDV Tat也能夠激活BIV LTR，而且JDV Tat對BIV LTR的激活作 用更加強烈。
同上述方法，轉染JDV Tat的真核質粒，以pCDNA3. 1為負對照，以BIV Tat為正對 照，JDV Tat轉染細胞系24小時后后綠色熒光明顯可見，且比BIV Tat轉染后細胞發出 更強的綠色熒光，而轉染空載體的負對照孔無綠色熒光。
研究JDVTat的分子機理有助于了解JDV的致病機制，解釋為什么與BIV同是反轉錄 病毒中的慢病毒，JDV引起牛的病變更加強烈。而JDV目前尚不能體外培養，BIV指示細 胞系是研究JDV Tat的有力工具。
實施例4
指示BIV原克隆的感染性
在病毒的分子生物學研究中經常用到病毒的原克隆。BIV127是BIV的原克隆質粒。 將BIV127轉染指示細胞系，每天在熒光顯微鏡下觀察，轉染3天后個別細胞呈現綠色熒 光，之后綠色熒光細胞逐漸增多，開始出現綠色的合胞體。而負對照轉染pCDNA3. 1(-) 則不產生熒光。利用指示細胞系觀察綠色熒光的方法檢測原克隆的感染性，比觀察病變的 方法更靈敏快速，觀察病變的方法在5天后能夠看到典型合胞體。
實施例5
應用BIV指示細胞系研究病毒超感染
病毒攜帶者伴隨有其它病毒的交叉感染，稱為超感染(superinfection) 。 H IV與其 它病毒的超感染不但能激活處于潛伏態的H IV病毒，使已表現A IDS癥狀的個體癥狀加 劇，而且可能使處于潛伏期的攜帶者突發成為AIDS患者；同時H IV又可以相同的效應反 作用于超感染的病毒，比如加劇超感染病毒的癥狀等，這使得病毒病的治療更加撲朔迷 離，困難重重。
以BIV為模型研究其它病毒與BIV的超感染是研究超感染的良好模型。 已知牛泡沫病毒BFV能夠激活BIV LTR，在病毒的超感染中起到重要作用。應用BIV
指示細胞系驗證BFV能夠激活BIV LTR。將牛泡沫病毒原克隆質粒pCMV—BFV轉染BIV指
示細胞系，每天在熒光顯微鏡下觀察，轉染3天后個別細胞呈現綠色熒光，之后綠色熒光
細胞逐漸增多，而負對照轉染pCDNA3. 1(-)則不產生熒光。
這種較微弱的超感染作用只有以EGFP為報告基因，才能在細胞水平顯示出來，并且
實時觀察。
實施例6
利用BIV指示細胞系鑒定BIV上清感染性
某些情況下，需要得到無細胞病毒儲液(cell free virus stock),排除因共培養加 入的已經感染病毒的細胞的影響。而BIV的無細胞儲液的獲得一直是個難題，研究BIV病 毒的方法都是將病毒感染的細胞與待測細胞共培養。利用BIV指示細胞系可以實時觀察上 清的感染性。
收集BIV感染FBL后的培養基上清，2800rpm離心3分鐘，取上清，經過0. 45um濾 膜過濾，去除細胞或細胞碎片，制得BIV上清。
將上清加入BIVE指示細胞系，每天觀察綠色熒光，經過7天后細胞發出綠色熒光， 說明上清具有感染性。
通過超速離心或蔗糖密度梯度離心從上清中制備高濃度的病毒顆粒，加入BIV指示細 胞系檢測，觀察綠色熒光，看能否富集上清中有感染性的病毒顆粒。
實施例7
指示細胞系與CPE方法的比較
傳統的病毒測定是基于細胞病變，其中一種經典的方法就是TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50%),即50%組織細胞感染量的測定。在免疫缺陷病毒滴度的測定中， 這種方法被廣泛應用，直到指示細胞系的出現。
BIV R29與FBL共培養，待細胞出現典型的核胞體后，將細胞用0. 25%胰酶消化，分 成等份。將FBL (P10)和指示細胞系分別按1X104細胞鋪96孔板，按照1: 10的稀釋 倍比接入BIV R29感染的FBL。從第二天開始每天觀測細胞病變(FBL)和綠色熒光蛋白 的表達情況， 一直記錄到病毒維持最高滴度。指示細胞系檢測到的最大滴度出現在感染后 4天，而基于細胞病變的檢測到的最大滴度出現在感染后6-7天。此外，指示細胞系檢測 到的病毒滴度要比病變檢測到的病毒滴度高2個數量級，即前者是后者的100倍。由此可 見，BIV指示細胞系方法比CPE的方法更靈敏。
序列表
〈110〉南開大學
〈120〉以增強型綠色熒光蛋白為報告基因的BIV指示細胞系 〈160〉 1 〈210〉 1 〈211〉 488 <212〉 DNA
〈213〉牛免疫缺陷病毒(Bovine Immunodeficiency Virus, BIV) <400>1
cgagctcttacgcgtgctagcccgtagctagccttsaaagggtggactgt50
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tagctccgsgctcccca^cctacagcctga488
權利要求
1、一種用于構建指示細胞系的可以應答牛免疫缺陷病毒感染的指示質粒，具有序列表所示核苷酸序列；該指示質粒是將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因插入到一種特異應答牛免疫缺陷病毒反式激活因子的應答元件下游構建而成，質粒含有G418抗性基因。
2、 根據權利要求1所述的指示質粒，其特征是所述的一種特異應答牛免疫缺陷病毒 反式激活因子的應答元件是BIV LTR中U3和TAR區，不含有負調控區域U5區。
3、 一株由權利要求1中的指示質粒構建的指示牛免疫缺陷毒感染的細胞系，其保藏 號為CGMCC No. 2050 。
4、 根據權利要求3所述的細胞系，其特征是該細胞系的構建過程如下將權利要求 1中的指示質粒轉染BHK-21細胞，加入G418進行篩選穩定表達的細胞系，初篩三周后， 將抗性細胞進行單克隆化；通過轉染BIV反式激活因子24小時后，用熒光顯微鏡觀測綠 色熒光來分別鑒定每個單克隆特異響應BIV反式激活因子的能力，最終挑選無本底表達但 經過BIV病毒攻擊后EGFP表達量高的陽性克隆即為BIV的指示細胞系。
5、 一種權利要求3所述的細胞系的應用，其特征是利用該細胞系實現快速靈敏實時 指示BIV感染性及響應BIV反式激活因子的激活。
全文摘要
一株指示牛免疫缺陷病毒BIV感染的細胞系及其應用。該細胞系可以在BIV感染的特定條件下表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，從而通過檢測該蛋白的表達來間接指示牛免疫缺陷病毒的感染。該細胞系(其保藏號為CGMCC No.2050)的構建過程首先構建成一個可以應答牛免疫缺陷病毒感染的具有序列表所示核苷酸序列的報告質粒，之后，將該質粒轉染BHK-21細胞，篩選穩定表達的細胞系并單克隆化；挑選無本底表達但經過BIV病毒攻擊后高表達EGFP的陽性克隆即為BIV的指示細胞系。本發明具有快速簡便且可以實時指示BIV感染和BIV反式激活因子激活作用的特點。
文檔編號C12N5/10GK101100675SQ20071005767
公開日2008年1月9日 申請日期2007年6月19日 優先權日2007年6月19日
發明者喬文濤, 雪 姚, 耿運琪, 陳啟民 申請人:南開大學