專利名稱：丹參素相關基因的檢測芯片、制備及檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物芯片技術領域，尤其是一種丹參素相關基因的檢測芯片、制備及檢測方法。
背景技術：
丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的根，別名血生根、赤參、血參、紅根，是重要的傳統中藥。丹參素是丹參的主要水溶性成分，英文名稱Danshensu，別名B-3，4-二羥基苯基乳酸，化學名稱Propanoicacid，3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxy，分子式為C5H10O5。丹參素的主要作用為1.具有擴張動脈的作用；2.抗血栓形成的作用；3.對中樞神經系統的作用丹參素可抑制環核昔酸磷酸二醋酶的活力，提高腦內環核昔酸的水平，產生中樞鎮靜作用；4.防治肝纖維化作用；5.對羥自由基、超氧陰離子及亞硝酸根引發的各種反應具有較好的抑制作用。丹參素被廣泛地應用于治療冠心病及心絞痛的中藥復方注射劑、片劑中，其治療效果顯著，市場需求大。
基因芯片技術是一種高通量、快速、平行核酸序列測定及定量分析技術。它將大量特定序列的核酸片段有序地固定在載體上作為探針與標記的待測核酸分子進行雜交，然后通過檢測雜交信號的強弱，進而判斷樣品中靶分子的組成及含量。該技術與傳統生物技術相比是一次重大創新和飛躍，具有十分誘人的前景。基因芯片已經被廣泛應用于基因表達譜研究，通過快速高效地獲取大量基因在mRNA水平的表達信息，并對在不同條件下的大量基因表達情況的平行分析，從而獲得基因的初步功能信息。在基礎研究中還可用于基因鑒別篩選及功能研究、快速DNA序列再測定、基因突變多態性的研究和基因表達測定等多個領域。
我國丹參資源豐富，品種繁多。根據丹參的形態可分為無花丹參、白花丹參、紫花丹參等。其在全國分布廣泛，主要產地有山西、陜西、山東、甘肅、四川、河南、江蘇等。各個產地各種品種的丹參均作藥用，而丹參素的含量各地各品種差別巨大，藥效作用很不一致，因此如何提高作為主要藥理作用的丹參素的含量是急待解決的課題。利用基因芯片技術對丹參素相關基因表達進行研究，進而進行基因工程改造是最佳方法之一。
目前市場上尚無丹參素相關基因的檢測芯片。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種結構簡單，設計科學合理的丹參素相關基因的檢測芯片。
本發明的另一個目的在于提供一種丹參素相關基因檢測芯片的制備方法。
本發明的另一個目的在于提供一種利用丹參素相關基因檢測芯片的檢測方法。
本發明是通過以下技術方案來實現的一種丹參素相關基因的檢測芯片，其特征在于該基因芯片是在玻片上設置丹參素相關基因表達的檢測探針。
而且，所述檢測探針的序列為丹參素相關基因探針編號序列1號5′CTTGGCAGGTCGAGAACTTGCTACACGGGCCCTTATGCTCGTTCGGGTCCATGTCACATG3′2號5′TCCAGTCGAAGTTATGAACCAGAGTCGCCGTAGCCATGTGCAGGATCCGGGTCGCGAGCG3′3號5′AGCGACGATCCACACCACAGAGGGTCTAAAAATGACAGTTACGCGAAGGCAACGAGCTCC3′4號5′CCGCCCATACTAGCACCACCGTAGTTGTGTCCGTTCCACCCGCGATCAAAACCTGGCTCG3′5號5′CCGCCCATACTAGCACCACCGTAGTTGTGTCCGTTCCACCCGCGATCAAAACCTGGCTCG3′6號5′TACTTCTTCAACCACTTCGCCAGGGCCATCACCATTCTCTCCGAGAACAACCCGCTCACC3′7號5′CGTGTTGCTCTTGGTTGAGTCTATCAGCACGGATCCATCACACCCCTCCACAAAGCAGTC3′8號5′TGGTCGTCCCAAATATAACATCAGCAATCGCAGCACCTCCAGCTTGGCCCGGATACCCAG3′9號5′GTTTAGAGCATCGCACCTGTGCCTAATCTCTCCTCTCCTCCCCGTCTTGACGCCATAGAC3′10號5′AGGCTTTGGCAGATTCCCCTCCACACTAGCTGACGTTGAACTCAACCCATCCAGCCTCCC3′11號5′TGAGGCACAGCAGAGCTCTACAAATGCTAATGGAAGCCTCGTGCCGATTCCTGCAGCCCG3′12號5′TCCGATGATCGACAAGCATGCCCTTCCTGTAGAGCCACAGACACGAGCTTAGGCGCCGCG3′13號5′GCAGCTCCATCGTATCATCCTTACCGGAGACAAACCTTTCTGGCCTCCACTCTTCAGGGC3′14號5′GGTCAGCGTGCATCGACATATCCGTCATGGGCACCTTGGCTAAATAATCTTCAGGGTACC3′15號5′ACCCCGACCCGACCCTATTTAGTGATGGCCGAGATGAATGCGCTGTTGAATGCTTTCGGG3′16號5′TTGTAGGGTCAGCGTGCATCGACATATCCGTCATGGGCACCTTGGCTAAATACCTCGTGC3′17號5′CACCTTCTTCACAAGTAGTCGCCACCGGGCATCGTTCACTCGTCTGTCTTGTTGTGCCTT3′18號5′CTCCCACGCCCTCCTCAACCTTAACATCTCCAGAAACGATACCGTCTTCAGCTTGTCTCC3′19號5′GGTCAGCGTGCATCGACATATCCGTCATGGGCACCTTGGCTAAATAATCTTCAGGGTACC3′20號5′TTCCAGTCGAAGTTATGAACCAGAGTCGCCGTAGCCATGTGCAGGATCCGGGTCGCGAGC3′21號5′GGTGAGCGGGTTGTTCTCGGAGAGAATGGTGATGGCCCTGGCGAAGTGGTTGAAGAAGTA3′22號5′AGGAGCAGCAGAATCCAAGGGCATGTTGTCGGGGATACGCACAATGAAATGCTCTTCCGC3′23號5′TCAAGAATTGACAACGGCACAATGAGTTCGAATCTCGCCAACACTTCCGGTCTTAACTCC3′陰性對照探針編號序列24號 5’TTGTCGGGAGGCTGCATGGAAAATAACCCTGCTACTGCGGCGCCTGGAACAGACGTGAGC3’25號 5’GGAACGGAGGTTAATGAGCTGCCTGGGACAGTTTTAATGTAGCCCGCTTCATCAGTGTCG3’26號 5’AAGAGGGGCTTGCGGCGGATGATGAGGTAGAAGGTGATGTCCTGGCGGCTGGGGCTGTCC3’
空白對照點編號 序列27號28號29號而且，所述的陰性對照探針中，24號為大鼠糖皮質激素受體基因探針，NCBI的序列號為M14053；25號為酵母TRP4基因探針，NCBI的序列號為X04273；26號為人乙酰膽堿δ受體基因探針，NCBI的序列號為X55019；所述的三個空白對照點僅含2×SSC溶液。
一種丹參素相關基因的檢測芯片的制備方法，該制備方法步驟如下(1)設計丹參素特異性探針在基因數據庫查找與丹參相關基因和表達序列標簽，應用京都基因與基因組數據庫軟件的比對功能一一確認與丹參素代謝相關基因作為制備芯片所用基因，然后應用oligo6.0軟件設計丹參素特異性探針；(2).合成探針應用DNA合成儀合成丹參素特異性探針；(3).片基的處理采用載玻片蒸餾水沖洗，重鉻酸鉀濃硫酸洗液浸泡20～30小時，然后蒸餾水沖洗、飽和NaOH/乙醇浸泡、蒸餾水沖洗后甩干、多聚賴氨酸溶液涂片后涼干備用；(4).點樣用2×SSC溶液溶解丹參素特異性及陰性對照探針，使用點樣儀在玻片上按預先設定好的順序進行點樣，在三個空白對照點只點2×SSC溶液；(5).將點好的玻片在長波紫外燈下交聯3～5分鐘，使制備成的探針固定在玻片上。
而且，所述的丹參素特異性探針設計的技術要求為①.G+C含量為50％～65％；②.探針的Tm值上下波動＜5℃；③.單一堿基要保證連續重復5次以下；④.探針分子內部互補堿基少于5bp；⑤.探針之間的二聚體＜6bp；⑥.每個探針與非靶基因的相似性必須＜40％，探針連續同源的堿基數≤20個。
一種丹參素相關基因的檢測芯片的檢測方法，該檢測方法步驟如下(1).總RNA提取采用異硫氰酸胍提取法或Trizol提取法；(2).逆轉錄制備cDNACy3-dUTP標記一組cDNA，Cy5-dUTP標記另一組cDNA；(3).在雜交箱中與芯片進行預雜交及雜交，預雜交為20～30分鐘，雜交為12～16小時；(4).在共聚焦熒光掃描儀上掃描雜交結果；
(5).應用微陣列分析軟件進行定量分析；(6).根據分析結果確定丹參素的相關基因表達量。
本發明的有益效果和優點是1.本發明適用于對丹參素相關基因表達量進行檢測，從而獲得其功能信息。具有如下功用①檢測丹參素相關基因在不同產地和同一產地同一植株不同發育時期、不同組織器官的表達；②研究丹參素相關基因在特定條件下如陽光、溫度、各種生理脅迫、病蟲害侵害、激素誘導等作用時的表達；③研究丹參素形成的遺傳機制；④預測丹參素的生成量。此外，本發明還可以應用于作丹參種質資源的鑒定評價、丹參優勢品種的早期預測、丹參育種和其新品種的產生與鑒定、丹參單核苷酸多態性(SNP)的檢定、新型除草劑和新型農藥的篩選等。這些功能為丹參素的研究和丹參的基因工程改造奠定基礎，對闡述丹參素生物合成的基本規律進而通過基因工程手段提高丹參素的產量具有重要意義。
2.本基因芯片所需基因及EST來自Genbank，使用的是KEGG比對軟件，Genbank和KEGG是目前世界上最權威的基因數據庫；應用oligo6.0軟件設計探針，又有嚴格的限制條件，因而科學性較強；該芯片上的基因是針對丹參素選擇的，特異性強，能較好地說明丹參素相關基因表達的情況；所選擇的探針數量僅有幾十個，Tm值一致性強；采用不同的熒光標記，可直接比較不同情況下的mRNA豐度差異。樣品可采用兩種熒光標記，一次實驗可比較兩種以上的樣品。在同一張芯片雜交，克服了分開雜交的缺陷，是完全平行的檢測，其敏感性較高；利用計算機掃描微陣列能提供兩種不同組織mRNA豐度的量化值。本芯片同時包括了用于質量控制和數據校正的陰性對照和空白對照，準確性更強。
3.本發明所制備的基因芯片具有操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強、準確性好、檢測成本低等特點，主要適用各種丹參丹參素相關基因的檢測。
4.本發明適用于對丹參素相關基因采用PCR擴增靶基因用于雜交檢測，該檢測方法操作簡便、快速、科學，完成全部檢測操作過程只需幾小時，而且檢測的精確度較高；且本基因芯片在常溫下易保存，從而為進行大規模樣品的集中檢測提供了極大的方便。
5.本發明所涉及的基因芯片操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強、準確性好；該基因芯片制備簡單，成本低廉；使用該基因芯片檢測丹參素相關基因的檢測方法簡便、快速、科學，檢測精確度較高，為醫藥制造廠家科學準確地控制丹參素質量提供了支持，為患者的治療提供了保障。
具體實施例方式
本發明通過以下實施例進一步詳述，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
該檢測丹參素含量的基因芯片是在基質上設置檢測丹參素的探針，該基因芯片所使用的基質是玻片。
所述的探針序列為丹參素相關基因探針編號序列1號5′CTTGGCAGGTCGAGAACTTGCTACACGGGCCCTTATGCTCGTTCGGGTCCATGTCACATG3′2號5′TCCAGTCGAAGTTATGAACCAGAGTCGCCGTAGCCATGTGCAGGATCCGGGTCGCGAGCG3′3號5′AGCGACGATCCACACCACAGAGGGTCTAAAAATGACAGTTACGCGAAGGCAACGAGCTCC3′4號5′CCGCCCATACTAGCACCACCGTAGTTGTGTCCGTTCCACCCGCGATCAAAACCTGGCTCG3′5號5′CCGCCCATACTAGCACCACCGTAGTTGTGTCCGTTCCACCCGCGATCAAAACCTGGCTCG3′6號5′TACTTCTTCAACCACTTCGCCAGGGCCATCACCATTCTCTCCGAGAACAACCCGCTCACC3′7號5′CGTGTTGCTCTTGGTTGAGTCTATCAGCACGGATCCATCACACCCCTCCACAAAGCAGTC3′8號5′TGGTCGTCCCAAATATAACATCAGCAATCGCAGCACCTCCAGCTTGGCCCGGATACCCAG3′9號5′GTTTAGAGCATCGCACCTGTGCCTAATCTCTCCTCTCCTCCCCGTCTTGACGCCATAGAC3′10號5′AGGCTTTGGCAGATTCCCCTCCACACTAGCTGACGTTGAACTCAACCCATCCAGCCTCCC3′11號5′TGAGGCACAGCAGAGCTCTACAAATGCTAATGGAAGCCTCGTGCCGATTCCTGCAGCCCG3′12號5′TCCGATGATCGACAAGCATGCCCTTCCTGTAGAGCCACAGACACGAGCTTAGGCGCCGCG3′13號5′GCAGCTCCATCGTATCATCCTTACCGGAGACAAACCTTTCTGGCCTCCACTCTTCAGGGC3′14號5′GGTCAGCGTGCATCGACATATCCGTCATGGGCACCTTGGCTAAATAATCTTCAGGGTACC3′15號5′ACCCCGACCCGACCCTATTTAGTGATGGCCGAGATGAATGCGCTGTTGAATGCTTTCGGG3′16號5′TTGTAGGGTCAGCGTGCATCGACATATCCGTCATGGGCACCTTGGCTAAATACCTCGTGC3′17號5′CACCTTCTTCACAAGTAGTCGCCACCGGGCATCGTTCACTCGTCTGTCTTGTTGTGCCTT3′18號5′CTCCCACGCCCTCCTCAACCTTAACATCTCCAGAAACGATACCGTCTTCAGCTTGTCTCC3′19號5′GGTCAGCGTGCATCGACATATCCGTCATGGGCACCTTGGCTAAATAATCTTCAGGGTACC3′20號5′TTCCAGTCGAAGTTATGAACCAGAGTCGCCGTAGCCATGTGCAGGATCCGGGTCGCGAGC3′21號5′GGTGAGCGGGTTGTTCTCGGAGAGAATGGTGATGGCCCTGGCGAAGTGGTTGAAGAAGTA3′22號5′AGGAGCAGCAGAATCCAAGGGCATGTTGTCGGGGATACGCACAATGAAATGCTCTTCCGC3′23號5′TCAAGAATTGACAACGGCACAATGAGTTCGAATCTCGCCAACACTTCCGGTCTTAACTCC3′陰性對照探針編號序列24號 5’TTGTCGGGAGGCTGCATGGAAAATAACCCTGCTACTGCGGCGCCTGGAACAGACGTGAGC3’25號 5’GGAACGGAGGTTAATGAGCTGCCTGGGACAGTTTTAATGTAGCCCGCTTCATCAGTGTCG3’26號 5’AAGAGGGGCTTGCGGCGGATGATGAGGTAGAAGGTGATGTCCTGGCGGCTGGGGCTGTCC3’空白對照點編號序列27號28號
29號本芯片共有23個丹參素相關基因的探針，3個陰性對照探針(其中24號為大鼠糖皮質激素受體基因探針，NCBI的序列號為M14053；25號為酵母TRP4基因探針，NCBI的序列號為X04273；26號為人乙酰膽堿δ受體基因探針，NCBI的序列號為X55019)。三個空白對照點(27號、28號、29號)僅含2×SSC溶液，不含任何基因探針。
丹參素相關基因的檢測芯片的制備方法步驟如下1.設計丹參素特異性探針在NCBI(The National Center for BiotechnologyInformation，美國國立生物技術信息中心)的Genbank(基因數據庫)查找與丹參相關基因和EST(Expressed Sequence Tags，表達序列標簽)，然后應用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，京都基因與基因組)數據庫軟件的比對功能一一確認與丹參素代謝相關基因并加以確定，作為制備芯片所用基因。在確定了所用基因之后，應用oligo6.0軟件設計探針。為減少非特異性雜交，保證芯片雜交的敏感度和精確度，探針設計遵循以下6條基本原則①G+C含量為50％～65％②探針的Tm值上下波動＜5℃③避免單一堿基連續重復5次以上；④探針分子內部互補堿基少于5bp⑤探針之間的二聚體＜6bp⑥每個探針與非靶基因的相似性必須＜40％，探針連續同源的堿基數≤20個。對備選探針進行篩選時，各種參數盡量控制在最佳范圍，以保證同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果。
2.合成探針應用DNA合成儀合成上述丹參素特異性探針。
3.片基的處理市售載玻片蒸餾水沖洗，重鉻酸鉀濃硫酸洗液浸泡24小時，蒸餾水沖洗，飽和NaOH/乙醇浸泡，蒸餾水沖洗后甩干，多聚賴氨酸溶液涂片后涼干備用。
4.點樣用2×SSC溶液溶解丹參素特異性及陰性對照探針，使用點樣儀在玻片上按預先設定好的順序進行點樣，三個空白對照只點2×SSC溶液。
5.將點好的玻片在長波紫外燈下交聯3-5分鐘，使探針固定在玻片上。
丹參素相關基因的檢測芯片的檢測方法步驟如下1.總RNA提取異硫氰酸胍提取法或Trizol提取法。
2.逆轉錄制備cDNACy3-dUTP標記一組cDNA，Cy5-dUTP標記另一組cDNA。
3.在雜交箱中與芯片進行預雜交及雜交，預雜交為20～30分鐘，雜交為12小時或過夜。
4.在共聚焦熒光掃描儀(Scan Array Express)上掃描雜交結果。
5.應用微陣列分析軟件進行定量分析。
6.根據分析結果確定丹參素的相關基因表達量。
采用該基因芯片檢測丹參素含量的檢測方法包括如下步驟1.準備工作預熱恒溫水浴箱、預冷低溫高速離心機、超凈工作臺紫外線消毒滅菌、預冷。
2.取丹參樣品約50mg，液氮下研磨。
3.將上面已經研磨成面的樣本倒入eppendorf管中。
4.加入異硫氰酸胍提取液或Trizol 1ml，放置10分鐘。用吸頭反復吹打數次，使混合均勻。
5.加入氯仿200ul，混勻，室溫放置15分鐘。然后，4℃，12000g，離心15分鐘。吸取上層水相至另一eppendorf管中。
6.加入異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置10分鐘。4℃，12000g，離心10分鐘。棄上清，RNA沉淀于管底。
7.加入75％乙醇1ml，溫和震蕩懸浮沉淀。4℃，8000g，離心5分鐘，棄上清，用吸水紙吸干多余乙醇，涼干15-20分鐘。
8.加入經過DEPC處理的去離子水50ul，60℃，10分鐘，取出檢測其完整性及純度。
DnaseI消化總RNA中殘留的DNA1.取20μg總RNA，加入5×Dnase緩沖液4μl，Dnase I(1U/μl)5μl，加DEPC水至總體積為20μl，37℃溫浴10min。
2.反應結束，加入180μlDEPC水，200μl水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(50∶49∶1)抽提一次。
3.取上清液加入3M的醋酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3M，并加2.5倍的無水乙醇，-80℃1h。
4.12000rpm，4℃離心15min，棄上清。
5.沉淀物用75％的乙醇洗兩次，空氣干燥后加入20μl DEPC處理水，調RNA濃度為1μg/μl，-80℃保存備用。
6.探針標記使用Amersham Pharmacia Biotech公司生產的Cy3dUTP/Cy5dUTP標記試劑；7.在雜交箱中與芯片進行預雜交及雜交，預雜交為20～30分鐘，雜交為10小時或過夜。
8.在共聚焦熒光掃描儀(Scan Array Express)上掃描雜交結果9.應用微陣列分析軟件進行定量分析。
10.根據分析結果確定丹參素的含量。
權利要求
1.一種丹參素相關基因的檢測芯片，其特征在于該基因芯片是在玻片上設置丹參素相關基因表達的檢測探針。
2.根據權利要求1所述的丹參素相關基因的檢測芯片，其特征在于所述檢測探針的序列為丹參素相關基因探針
陰性對照探針
空白對照點
3.根據權利要求2所述的丹參素相關基因的檢測芯片，其特征在于所述的陰性對照探針中，24號為大鼠糖皮質激素受體基因探針，NCBI的序列號為M14053；25號為酵母TRP4基因探針，NCBI的序列號為X04273；26號為人乙酰膽堿δ受體基因探針，NCBI的序列號為X55019；所述的三個空白對照點僅含2×SSC溶液。
4.一種如權利要求1所述丹參素相關基因的檢測芯片的制備方法，其特征在于該制備方法步驟如下(1)設計丹參素特異性探針在基因數據庫查找與丹參相關基因和表達序列標簽，應用京都基因與基因組數據庫軟件的比對功能一一確認與丹參素代謝相關基因作為制備芯片所用基因，然后應用oligo6.0軟件設計丹參素特異性探針；(2).合成探針應用DNA合成儀合成丹參素特異性探針；(3).片基的處理采用載玻片蒸餾水沖洗，重鉻酸鉀濃硫酸洗液浸泡20～30小時，然后蒸餾水沖洗、飽和NaOH/乙醇浸泡、蒸餾水沖洗后甩干、多聚賴氨酸溶液涂片后涼干備用；(4).點樣用2×SSC溶液溶解丹參素特異性及陰性對照探針，使用點樣儀在玻片上按預先設定好的順序進行點樣，在三個空白對照點只點2×SSC溶液；(5).將點好的玻片在長波紫外燈下交聯3～5分鐘，使制備成的探針固定在玻片上。
5.根據權利要求4所述丹參素相關基因的檢測芯片的制備方法，其特征在于所述的丹參素特異性探針設計的技術要求為①.G+C含量為50％～65％；②.探針的Tm值上下波動＜5℃；③.單一堿基要保證連續重復5次以下；④.探針分子內部互補堿基少于5bp；⑤.探針之間的二聚體＜6bp；⑥.每個探針與非靶基因的相似性必須＜40％，探針連續同源的堿基數≤20個。
6.一種如權利要求1所述的丹參素相關基因的檢測芯片的檢測方法，其特征在于，該檢測方法步驟如下(1).總RNA提取采用異硫氰酸胍提取法或Trizol提取法；(2).逆轉錄制備cDNACy3-dUTP標記一組cDNA，Cy5-dUTP標記另一組cDNA；(3).在雜交箱中與芯片進行預雜交及雜交，預雜交為20～30分鐘，雜交為12～16小時；(4).在共聚焦熒光掃描儀上掃描雜交結果；(5).應用微陣列分析軟件進行定量分析；(6).根據分析結果確定丹參素的相關基因表達量。
全文摘要
本發明屬于涉及一種丹參素相關基因的檢測芯片、制備及檢測方法，它是在玻片上設置特異性探針制成基因芯片，然后與經過標記的丹參樣品的cDNA雜交，經掃描結果和定量分析確定丹參素的相關基因表達量。該芯片是針對丹參素相關基因而設計，特異性強，能夠準確的檢測丹參素相關基因的表達，適用于對丹參素相關基因表達進行檢測以獲得其功能信息，這為丹參素的研究奠定了基礎，對丹參的基因工程改造具有十分重要的意義。
文檔編號C12N15/11GK101041860SQ20071005717
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月20日 優先權日2007年4月20日
發明者王慶浩, 張伯禮, 王瑞菊 申請人:天津中醫藥大學