專利名稱：一種非填充式核酸提取器件及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微流體芯片領域中的非填充式核酸提取器件及其制備方法與應用，特別是涉及一種以塑料為基材制作的非填充式核酸提取器件與其在提取核酸中的應用。
背景技術：
近年來，用于核酸分析的生物芯片技術發展迅速。目前，大多數已報道的核酸分析芯片都是用于對純核酸樣品進行分析，而這些純核酸樣品是用常規實驗室技術提取和純化獲得的。因此，若想將實驗室常規核酸提取步驟微型化，構建核酸提取芯片非常重要，這將有助于構建出真正意義上的集樣品提取、生化反應和結果檢測等步驟集于一體的微型全分析系統。
核酸提取是指從細胞、細菌的裂解液或其它含有核酸的樣品中，提取出具有一定純度的核酸過程。目前文獻中已報道的核酸提取芯片大多是利用核酸固相萃取技術在高濃度離水劑鹽(如鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉等)酸性溶液下，核酸的磷酸骨架通過離水劑鹽陽離子橋特異性吸附到氧化硅表面(如微、納米氧化硅顆粒、氧化硅膜(或氧化硅層)、玻璃珠、玻璃纖維、硅澡土等)，而蛋白、脂類等其它分子則不被吸附，從而實現核酸與蛋白等分子的分離。
根據芯片內氧化硅制作方法的不同，目前已報道的核酸提取芯片大致可分為以下兩大類一類為填充式芯片，是用毛細管或在玻璃等基材上加工出管道，然后在管道中填充微米級的氧化硅顆粒。這類芯片由于需要填充氧化硅顆粒，但每次只能填充一個管道，因此，沒法批量進行自動化加工。兩片填充重復性不好，填充顆粒會造成核酸提取時流體阻力較大，使提取速度減慢，并且細胞裂解殘骸還容易造成管道堵塞。另一類為非填充式芯片，是在硅基材上用深度離子刻蝕技術加工出微結構，然后用離子增強化學氣相沉積(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition，PECVD)技術在微結構表面制作氧化硅層。這類芯片重復性好，性能穩定，缺點是加工費用昂貴。由于PECVD制作氧化硅層需要在高溫下進行(一般大于350攝氏度)，因此，這種方法只能在硅等高熔點材料上制作，很難在塑料基材上制作。迄今為止，以塑料為基材非填充式核酸提取芯片還未見報道或應用。
與玻璃、硅等材料相比，塑料基材(如聚甲基丙烯酸甲酯(Poly(methylmethacrylate)，PMMA)、聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)等)具有不易碎、易于加工大比表面結構、其模具復制技術適于批量加工、成本低廉等優點，PCR芯片、雜交芯片、電泳芯片等越來越多的核酸分析芯片已選用PMMA等塑料材料作為基材。因此，如果能在塑料基底上制作非填充式核酸提取芯片，則會便于將核酸提取步驟和塑料基的其它核酸分析芯片整合到一起，以實現真正意義上的用于核酸分析的微型全分析系統。
溶膠-凝膠機理是由烷氧基硅烷(如正硅酸乙酯、正硅酸甲酯)或類似的有機金屬烷氧化物在常溫下經分解和縮聚而先成溶膠，然后老化成凝膠的一種方法(Hench LL，West J K.The sol-gel process[J].Chemical Review，1990，9033-72.)，最后經干燥可制備成玻璃或陶瓷。此外，氧化硅薄膜的制作方法也是建立在溶膠-凝膠機理基礎之上的。提拉法(Dip-Coating)、旋涂法(Spin-Coating)是制備氧化硅膜常用的方法(Brinker C J.Hydrolysis and condensation of silicateseffectson structure[J].Journal of Non-Crystalline Solids，1988，10031-50.Klein LC.Sol-gel processing of silicates[J].Annual Review of MaterialScience，1985，15227-248.)。
Stber法是制備氧化硅顆粒最常用的方法。1968年，Stber等人發明了從10nm-2μm級氧化硅顆粒的制作方法，該法是以氨水為催化劑，利用了正硅酸乙酯(Tetraethoxysilane，TEOS)可在異丙醇中水解生成納米氧化硅微核，然后團聚生成氧化硅顆粒的原理(Stber W，Fink A，Bohn E.Controlled growth of monodispersesilica spheres in the micron size range[J].Journal Colloid Interface Science，1968，2662-69.)。目前，制備微米級以下氧化硅顆粒及其衍生物的各種方法都是在Stber方法的基礎上發展起來的。

發明內容
本發明的目的是提供一種以塑料為基材制作的非填充式核酸提取器件。
為解決上述技術問題，本發明采取以下技術方案一種非填充式核酸提取器件，它是由至少一個結構單元組成的，所述結構單元包括有均為塑料材質的一蓋體和一樣品吸附載體，所述樣品吸附載體上設有管道、凹槽或腔體，所述蓋體與樣品吸附載體上具有管道、凹槽或腔體的一面緊密貼合，所述管道、凹槽或腔體內壁上設有氧化硅凝膠層，所述蓋體或樣品吸附載體上對應于所述管道、凹槽或腔體的位置設有至少一個進樣孔和一個出樣孔。
所述非填充式核酸提取器件可由兩個、三個或三個以上羅列在一起的結構單元組成。
當所述樣品吸附載體具有腔體結構時，樣品吸附載體可由中間設有通孔的中間層和底板組成，底板緊密連接于中間層的下方，從而形成具有腔體結構的樣品吸附載體。
為方便操作，可將進樣孔和出樣孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定。
可根據實際需要對進樣孔和出樣孔的孔徑進行調整，如0.01-1000mm(優選為0.9mm)。
所述塑料基材的選擇是多種多樣的，可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有機玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛等，優選為聚甲基丙烯酸甲酯。
所述塑料基材可以被加工成片狀或管狀等多種外部型狀。
為獲得更好的提取效果，所述管道、凹槽或腔體內還可以再設有柱形、棱錐、梳形或壩形等多種型狀的突起，以增大內表面積。
本發明的第二個目的是提供一種上述非填充式核酸提取器件的制備方法。
本發明所提供的非填充式核酸提取器件的制備方法，可包括以下步驟1)在塑料基材上形成管道、凹槽或腔體結構，并在所述管道、凹槽或腔體的位置設置至少一個進樣孔和一個出樣孔；2)用溶膠-凝膠方法制備氧化硅凝膠；3)將氧化硅凝膠涂覆在所述管道、凹槽或腔體的內壁上，得到非填充式核酸提取器件。
在上述制備方法中，為方便操作，所述步驟1)中在進樣孔和出樣孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定；所述進樣孔和出樣孔的孔徑可為0.01-1000mm(優選為0.9mm)；塑料基材的選擇是多種多樣的，可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有機玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛等，優選為聚甲基丙烯酸甲酯。
步驟2)中用溶膠-凝膠方法制備氧化硅層的具體方法可為將烷氧基硅烷或有機金屬烷氧化物，體積百分濃度0.01-100％乙醇，體積百分濃度0.01-100％異丙醇，水(優選為超純水)和0.0001-12M(優選為0.12M)鹽酸按體積比為0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100(優選的體積比為31∶23∶23∶19∶4)混合均勻，在0-120℃下(優選為70℃)水浴0-10000小時(優選為4.5小時)，得到氧化硅溶膠；所述烷氧基硅烷為正硅酸乙酯(TEOS)或正硅酸甲酯等；所述有機金屬烷氧化物為異丙氧基鈦或異丙氧基鋁等。
步驟3)中將氧化硅凝膠涂覆于所述管道、凹槽或腔體內壁的線速度可為0.01-1000mm/s(優選為5mm/s)，涂覆后的氧化硅凝膠層可經氮氣流干燥0.01-10000小時(優選為24小時)，氮氣流速可為0.001-1000.0m/s(優選為0.5m/s)。
所述塑料基材可以被加工成片狀或管狀等多種外部型狀。
為獲得更好的提取效果，步驟1)中在所述管道、凹槽或腔體內還可以再設置有柱形、棱錐、梳形或壩形等多種型狀的突起，以增大內表面積。
本發明的另一個目的是提供用上述非填充式核酸提取器件提取核酸的方法。
本發明所提供的提取核酸的方法，包括以下步驟1)將非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體依次用0-7M鹽酸胍溶液、碘化鈉溶液或異硫氰酸胍等吸附液(優選6M鹽酸胍溶液)，體積百分濃度為50-100％的(優選為80％)的異丙醇水溶液、50-100％乙醇等清洗液，0-1000mM pH 6.0-14.0 Tris溶液(優選為5mM pH 8.5的Tris溶液)、pH 6.0-14.0的水等洗脫液，以及所述吸附溶液各浸泡15-60min；2)將待分離樣品加入所述非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體中，靜置或流動吸附，使樣品中的核酸吸附于非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體內壁上的氧化硅層上；3)用所述清洗溶液對非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體進行清洗；4)用所述洗脫溶液進行洗脫，得到核酸樣品。
在上述核酸提取方法中，步驟1)中的吸附液中可再包含有1-100mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)和/或0.1-10mM乙二胺四己酸納(EDTA)，清洗液的pH值為1.0-9.0。
步驟2)中若非填充式核酸提取器件為腔體式的，可選擇靜置吸附方式，吸附時間可為15-60min(優選為30min)，非填充式核酸提取器件為管道式的，可選擇靜置或流動吸附方式，靜置吸附時間可為15-60min(優選為30min)，流動吸附時待分離樣品液在管道中的流速為1-3mL/h(優選為2mL/h)。
本發明提供了一種非填充式核酸提取器件及其制備方法。該核酸提取器件是先在塑料基材上形成管道、凹槽或腔體結構，然后用溶膠-凝膠方法制備氧化硅凝膠，再將氧化硅凝膠涂覆在所述塑料基材上的管道、凹槽或腔體的內壁上得到的非填充式核酸提取器件。本發明通過溶膠-凝膠方法在塑料基材上管道、凹槽或腔體內壁上生成氧化硅層，主要由烷氧基硅烷(如正硅酸乙酯、正硅酸甲酯等)或類似的有機金屬烷氧化物在常溫下分解和縮聚先成溶膠，然后將溶膠溶液導入腔體中，老化即成凝膠。本發明的非填充式核酸提取器件避免了填充式核酸提取器件由于填充氧化硅顆粒帶來的缺點，同時避免了以前報道的用PECVD方法制備非填充式芯片只能在硅等高熔點基材上制作氧化硅層的限制，實現了在塑料基底上制作用于提取核酸的非填充式核酸提取器件。用“溶膠-凝膠”方法在塑料管道(或腔體)內表面制作的氧化硅層可吸附核酸，從而可用于提取核酸，試驗證明本發明的非填充式核酸提取器件具有較好的核酸提取效果，如所制備的管道式非填充式核酸提取器件，對于靜置提取方式，DNA吸附率達到約為70％，洗脫率約為45-70％，芯片從DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率約為32-50％；對于流動提取方式，DNA吸附率約為50-70％，洗脫率約為37-52％，從DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率約為20-37％。本發明的非填充式核酸提取器件制備方法簡單，成本低廉，將在核酸的提取及其分析研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為實施例1制備的夾心式非填充式核酸提取器件的示意2為夾心式非填充式核酸提取器件分解結構的立體3為封裝好的夾心式非填充式核酸提取器件的立體4為夾心式非填充式核酸提取器件的腔體內表面SiO2層的表面形貌5為用本發明夾心式非填充式核酸提取器件提取的核酸樣品的PCR檢測結果圖6為本發明管道式非填充式核酸提取器件的結構示意7為本發明管道式非填充式核酸提取器件的局部示意8為本發明管道式非填充式核酸提取器件的實物9為用本發明非填充式核酸提取器件及不同提取方式從DNA溶液中提取DNA時對DNA回收率的比較結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、夾心式非填充式核酸提取器件的制備及其核酸提取效果檢測一、制備夾心式非填充式核酸提取器件本實施例以常用的塑料材料PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)為基材制備夾心式非填充式核酸提取器件，該夾心式非填充式核酸提取器件由兩層塑料基片層(一層為蓋體，一層為底板)及中間設有的中間層構成，其分解結構的立體圖見圖2，其制備方法包括以下步驟1)先將塑料基片層及中間層加工成如圖2所示的形狀及尺寸塑料基片層長75mm，寬25mm，厚1mm，其中一塊作為蓋體1，在進口和出口處用高速鉆孔機各打一個直徑1.2mm的孔(進樣孔2和出樣孔3)，將80μm厚，兩側帶有保護膜的雙面膠的中間區域用刀裁去后得到中間設有通孔的中間層4，通孔部分5形狀如圖1所示，所裁去部分的尺寸為中間部分最長為55mm，最短為35mm，寬13mm。然后揭掉中間層兩面的保護膜，將兩塊塑料基片及中間層上、下對齊，將作為蓋體的塑料基片與中間層的一面粘貼，將作為底板的塑料基片6與中間層的另外一面粘貼，然后將兩根直徑1mm的聚四氟乙烯管分別插入進樣孔和出樣孔中，用改性丙烯酸膠密封固定，從而得到中間具有腔體的夾心式芯片，如圖3所示。
在實際操作中，也可用微機械加工的方法在一個作為樣品吸附載體的塑料基片上直接雕刻出具有上述型狀的通孔或其它型狀的凹槽，然后再與另一片塑料基片(蓋片)熱鍵壓合，在進口和出口處各打至少一個孔，得到具有腔體的非填充式核酸提取器件。為獲得更好的提取效果，所述管道、凹槽或腔體內還可以再設有柱形、棱錐、梳形或壩形等多種型狀的突起，以增大內表面積。
2)用溶膠-凝膠方法制備氧化硅凝膠將正硅酸乙酯(TEOS)3.1mL，無水乙醇和異丙醇各2.3mL，超純水1.9mL和0.12M鹽酸0.4mL混合均勻(終體積10mL)，在70℃下水浴4.5小時，自然冷卻至室溫，得到SiO2溶膠。
3)將氧化硅凝膠涂漬在所述塑料基材上腔體的內壁上形成SiO2層將2mL醫用注射器連接一段10cm長的聚四氟乙烯管，吸取50μl SiO2溶膠，然后將注射器的聚四氟乙烯管用硅膠管連接至入口管，然后將管中的SiO2溶膠注入芯片以涂漬芯片的PMMA內表面，涂漬線速度約為5mm/s，多余的溶膠從出口管流出，最后將涂漬后的PMMA夾心式芯片連接氮氣流干燥24小時，氮氣的流速控制約為0.5m/s，殘留在芯片內表面的SiO2溶膠液膜干燥后變成SiO2固體凝膠，干燥后將一塊塑料基片拆開，用LEO 1530場發射掃描電鏡觀測芯片內表面涂漬的SiO2層表面形貌，觀測之前，SiO2層表面經過噴碳以增加樣品表面的導電性，觀測結果如圖4所示(SiO2表面經小刀敲碎破壞，左下部為暴露的PMMA基底)，由圖4可以看出用上述溶膠-凝膠法在腔體的內表面成功制作了SiO2層，得到了本發明的非填充式核酸提取器件。
二、本發明夾心式非填充式核酸提取器件提取核酸的效果檢測以人血液裂解液為例檢測用本發明夾心式非填充式核酸提取器件提取核酸的效果。人血液裂解液的獲得方法為在412.5μl吸附液中加入50μl新鮮的人血液，25μl Triton X-100，12.5μl蛋白酶K(20μg/μl)，混勻，得到血液裂解液(終體積500μl)。用步驟一制備的夾心式非填充式核酸提取器件從人血液裂解液中提取核酸，具體方法包括以下步驟1)預處理將非填充式核酸提取器件的腔體依次用含6M鹽酸胍(GuHCl)，10mM三羥甲基氨基甲烷和1mM二胺四己酸納的吸附液(pH 6.0)，80％的異丙醇水溶液，5mM pH 8.5的Tris溶液，以及所述吸附液各60μl分別浸泡30min；2)吸附用移液槍吸45μl血液裂解液注入所述夾心式非填充式核酸提取器件的腔體中(每個芯片實際最初的血液量為4.5μl)，靜置吸附30min，使血液裂解液中的DNA充分吸附于非填充式核酸提取器件腔體內壁上的氧化硅層上，然后抽出多余液體；3)用25μl所述80％的異丙醇水溶液(清洗液)對非填充式核酸提取器件的腔體進行清洗，重復兩次，以洗掉殘留在芯片內表面的蛋白等分子；4)將45μl 5mM pH 8.5的Tris溶液(洗脫液)導入非填充式核酸提取器件的腔體進行洗脫，靜置30分鐘，以將吸附到氧化硅層上的DNA充分解吸附下來，然后抽出并收集腔內的洗脫液，得到核酸樣品。
以未加入DNA模板和未經非填充式核酸提取器件提取的血液裂解液(用洗脫液稀釋10倍)作為陰性對照，以用內腔未經SiO2溶膠涂漬的具有步驟一結構的芯片提取的血液裂解液DNA為對照，用PCR的方法檢測本發明核酸提取器件的核酸提取效果，具體方法為PCR擴增的目的基因為編碼人β珠蛋白的β-actin基因(250bp)，所用上游引物為5‘-CATGTACGTT-GCTATCCAGGC-3’，下游引物為5‘-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3’。PCR反應體系2.5μl10×PCR緩沖液，0.5μl10mM dNTPs，5μM上、下引物各1μl，1μl 10U/μl Taq聚合酶，5μl上述各組的DNA提取液，加水至終體積為25μl。PCR擴增條件為先96℃3分鐘預變性；96℃25秒變性，60℃30秒退火，72℃30秒延伸，變性、退火、延伸共重復35個循環；最后72℃5分鐘充分延伸，4℃保存。反應結束后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果(PCR產物上樣量5μL)，結果如圖5所示(泳道1為陰性對照；泳道2為將血液裂解液用未經SiO2溶膠涂漬的芯片提取的DNA的PCR檢測結果；泳道3，4，5為三個經過SiO2溶膠涂漬的非填充式核酸提取器件從血液裂解液中提取DNA的檢測結果；泳道6為以未經非填充式核酸提取器件提取的血液裂解液(用洗脫液稀釋10倍)作為模板的PCR擴增產物；泳道M為2kb DNA Marker)，泳道1為陰性對照，沒有加入DNA模板，所以沒有250bp長度的DNA片段擴增出來；泳道2為血液裂解液用未經涂漬的核酸提取器件提取DNA的結果，由于芯片內表面沒有經過SiO2溶膠涂漬，壁面沒有SiO2層，因此無法提取DNA，故以此芯片的提取液作為模板，PCR未能擴增出相應的DNA片段；泳道6為用5μl洗脫液稀釋的血液裂解液(用洗脫液代替吸附液，其配比與上述吸附液稀釋的血液裂解液相同)沒有經過DNA提取直接作為模板進行PCR擴增的結果，由于血液中有抑制PCR反應中的聚合酶的蛋白(如血紅素)，導致PCR沒有擴增出相應的目的DNA片斷；而泳道3，4，5分別為本發明三個經過SiO2溶膠涂漬的非填充式核酸提取器件從血液裂解液中提取的DNA的PCR結果，經擴增獲得了250bp大小的DNA條帶，與預期結果相符，表明上述夾心式非填充式核酸提取器件具有較好的核酸提取效果。
實施例2、管道式非填充式核酸提取器件的制備及其核酸提取效果檢測一、管道式非填充式核酸提取器件的制備1、管道的微機械加工與用高分子材料加工管道的其它方式(熱壓、澆注、注塑、LIGA等方式)相比，微機械加工方式是更為快速、廉價的用高分子材料進行微結構加工的方式。此外，由于不需要制作模具，制作出的圖形不需受模具圖形的限制，因此這種方法又具有靈活易用的優點，可以隨時修改圖紙制作不同的圖形。用微機械加工的方法制備如圖6所示的本發明管道式的非填充式核酸提取器件(又稱管道式PMMA核酸提取芯片)，尺寸為104mm×70mm。其制作方法為采用5mm厚的PMMA片，用精雕機雕刻出溝1寬0.3mm、壩(兩溝之間的間隔部分)2寬0.5mm、溝深0.3mm的管道(凹槽)，局部管道的示意圖見圖7，每片采用2×2的芯片陣列，即每片含四個芯片單元，管道有40根連通的單管組成，每單根管長2.5cm，即每塊芯片上管道的總長度為2.5cm×40＝1m。每個小單元出口和入口之間的直線距離為42mm。芯片中每一小的單元的有效尺寸(不包括進樣口和出樣口處管道)為2.5cm×3.2cm，整塊芯片的尺寸面積為10.4cm×7cm＝72.8cm2。
此外，還可用上述相同的方法在PMMA等塑料基片上形成圓形的管道、具有不同深度的半圓形管道或具有其它不同型狀的凹槽。為獲得更好的提取效果，所述管道、凹槽或腔體內還可以再設有柱形、棱錐、梳形或壩形等多種型狀的突起，以增大內表面積。
2、管道式PMMA非填充式核酸提取器件的熱壓鍵合管道式PMMA非填充式核酸提取器件的熱壓鍵合過程包括以下步驟1)打孔在步驟1中經微機械加工后的PMMA基片上的每個管道上的出口和入口處各打一個直徑1mm的進樣口和一個直徑1mm的出樣口；2)清洗對一片步驟1)獲得的設有管道并打孔的PMMA片(5mm厚，樣品吸附載片)與另一片相同尺寸的PMMA片(1mm厚，蓋片)進行清洗，步驟如下(1)蒸餾水沖洗三次；(2)白貓洗滌液洗滌一次；(3)蒸餾水沖洗三次；(4)95％乙醇超聲清洗兩次，每次10min；(5)超純水超聲清洗兩次，每次10min；(6)氮氣吹干。
3)管道式PMMA核酸提取器件的熱壓鍵合將上述兩片清洗過的PMMA片貼合，置于熱壓機上進行鍵合，鍵合參數如下壓強設為0.2MPa/mm2，溫度100℃20min(從溫度升至100度時計時)，結束后停止加溫，自然冷卻，松開臺鉗，取下芯片，實物圖如圖8所示。
4)接口封裝將0.9mm直徑的聚四氟乙烯管插入進樣口和出樣口處，用紫外膠密封。
3、用溶膠-凝膠方法制備氧化硅凝膠將正硅酸乙酯(TEOS)3.1mL，無水乙醇和異丙醇各2.3mL，超純水1.9mL和0.12M鹽酸0.4mL混合均勻(終體積10mL)，在70℃下水浴4.5小時，自然冷卻至室溫，得到SiO2溶膠。
4、SiO2層的形成將氧化硅凝膠涂漬在所述塑料基材上管道的內壁上形成SiO2層將2mL醫用注射器連接一段10cm長的聚四氟乙烯管，吸取80μl SiO2溶膠，然后將注射器的聚四氟乙烯管用硅膠管連接至入口管，然后將管中的SiO2溶膠注入芯片以涂覆芯片的PMMA內表面，涂覆線速度約為0.5mL/h(約2mm/s)，多余的溶膠從出口管流出，最后將涂覆后的PMMA夾心式芯片連接氮氣流干燥24小時，每個芯片單元氮氣的流速控制約為0.5m/s，殘留在芯片內表面的SiO2溶膠液膜干燥后變成SiO2固體凝膠，干燥后將一塊塑料基片拆開，用LEO 1530場發射掃描電鏡觀測芯片內表面涂覆的SiO2層表面形貌，觀測之前，SiO2層表面經過噴碳以增加樣品表面的導電性，可以看出用上述溶膠-凝膠法在腔體的內表面成功制作了SiO2層，得到了本發明的管道式非填充式核酸提取器件。
二、管道式非填充式核酸提取器件的核酸提取效果檢測以鮭魚精DNA為例檢測用本發明管道式非填充式核酸提取器件提取核酸的效果。將待提取的初始樣品為鮭魚精DNA溶于6M GuHCl TE溶液(pH 6.0)中，DNA的終濃度為5.03ng/μl。與夾心式非填充式核酸提取器件不同的是，管道式非填充式核酸提取器件的性能測定可以兩種方式進行靜置提取方式和流動提取方式。用靜置方式提取時，DNA的吸附、洗脫均在靜置狀態下進行，而流動提取方式時，以上步驟均是使液體以一定速度流過管道時進行。用步驟一制備的管道式非填充式核酸提取器件提取核酸，具體方法包括以下步驟1)預處理將非填充式核酸提取器件的腔體依次用含6M鹽酸胍，10mM三羥甲基氨基甲烷和1mM二胺四己酸納的吸附液(pH 6.0)，80％的異丙醇水溶液，5mM pH8.5的Tris溶液，以及所述6M鹽酸胍溶液各浸泡30min；2)吸附將DNA溶液注入所述管道式非填充式核酸提取器件的腔體中，上樣初始液為60μl，靜置吸附30min，使樣品中的核酸吸附于非填充式核酸提取器件管道內壁上的氧化硅層上，然后抽出多余液體(對于流動提取方式，初始上樣液在入口用針泵推入，流速為2mL/h，出樣口處收集。收集的液體稱為吸附余液。)；3)靜置吸附和流動吸附使用相同的清洗方式用30μl 80％的異丙醇水溶液以5mL/h的速度通過管道，對非填充式核酸提取器件的管道進行清洗，清洗過程重復兩次；4)用60μl 5mM pH 8.5的Tris溶液對所吸附的DNA進行洗脫對于靜置提取方式，洗脫液注入后靜置30分鐘；對于流動洗脫方式，洗脫液以2mL/h速度推過管道，然后出樣口收集，收集的液體稱為洗脫余液，最終得到核酸樣品。
經上述不同方式提取前、后進行DNA總量的測定初始樣品、吸附余液和洗脫余液中的DNA含量的測定用PicoGreenR dsDNA定量試劑盒(Lot No.11496，MolecularProbes，Eugene，OR)，蛋白含量的測定用BCATM蛋白定量試劑盒(Lot No.23225，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)，DNA和蛋白含量的測定均在HTS 7000 Plus生物分析儀(PerkinElmer Inc.，Fremont，CA)上進行，測定方法按照試劑盒說明書進行。
管道式PMMA核酸提取芯片的提取DNA的實驗結果如圖8所示(A1-A4表示為靜置提取方式，B1-B3為流動提取方式)，為了便于敘述，定義以下名詞DNA吸附率＝(初始液中的DNA總量-吸附余液中DNA總量)/初始液中的DNA總量；DNA洗脫率＝回收液中的DNA總量/(初始液中的DNA總量-吸附余液中DNA總量)；DNA回收率＝回收液中的DNA總量/初始液中的DNA總量；蛋白回收率＝回收液中的蛋白總量/初始液中的蛋白總量。由圖8可知，對于靜置提取方式，DNA吸附率達到約為70％，洗脫率約為45-70％，芯片從DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率約為32-50％；對于流動提取方式，DNA吸附率約為50-70％，洗脫率約為37-52％，從DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率約為20-37％。上述實驗結果表明，本發明管道式非填充式核酸提取器件具有較好的核酸提取效果。
權利要求
1.一種非填充式核酸提取器件，它是由至少一個結構單元組成的，所述結構單元包括有均為塑料材質的一蓋體和一樣品吸附載體，所述樣品吸附載體上設有管道、凹槽或腔體，所述蓋體與樣品吸附載體上具有管道、凹槽或腔體的一面緊密貼合，所述管道、凹槽或腔體內壁上設有氧化硅凝膠層，所述蓋體或樣品吸附載體上對應于所述管道、凹槽或腔體的位置設有至少一個進樣孔和一個出樣孔。
2.根據權利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述器件由兩個羅列在一起的結構單元組成。
3.根據權利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于當所述樣品吸附載體具有腔體結構時，樣品吸附載體由中間設有通孔的中間層和底板組成，底板緊密連接于中間層的下方，形成具有腔體結構的樣品吸附載體。
4.根據權利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于將所述進樣孔和出樣孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定。
5.根據權利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述進樣孔和出樣孔的孔徑為0.01-1000mm。
6.根據權利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述塑料基材為聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有機玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛。
7.根據權利要求1-6任一項所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述管道、凹槽或腔體內還設有柱形、棱錐、梳形或壩形的突起。
8.一種制備權利要求1所述的非填充式核酸提取器件的方法，包括以下步驟1)在塑料基材上形成管道、凹槽或腔體結構，并在所述塑料基材上管道、凹槽或腔體的位置設置至少一個進樣孔和一個出樣孔；2)用溶膠-凝膠方法制備氧化硅溶膠；3)將氧化硅溶膠涂覆在所述塑料基材上管道、凹槽或腔體的內壁上，得到非填充式核酸提取器件。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟1)中將所述進樣孔和出樣孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定，所述進樣孔和出樣孔的孔徑為0.01-1000mm；塑料基材為聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有機玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛；所述管道、凹槽或腔體內還設有柱形、棱錐、梳形或壩形的突起。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟2)中用溶膠-凝膠方法制備氧化硅凝膠的方法為將烷氧基硅烷或有機金屬烷氧化物，0.01-100％乙醇，0.01-100％異丙醇，水和0.0001-12M鹽酸按體積比為0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100混合均勻，在0-120℃下水浴0-10000小時，得到氧化硅溶膠；所述烷氧基硅烷為正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；所述有機金屬烷氧化物為異丙氧基鈦或異丙氧基鋁。
11.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于所述烷氧基硅烷或有機金屬烷氧化物，0.01-100％乙醇，0.01-100％異丙醇，水和0.0001-12M鹽酸的體積比為31∶23∶23∶19∶4。
12.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于所述水為超純水；鹽酸的摩爾濃度為0.12M；水浴溫度為70℃，水浴時間為4.5小時。
13.根據權利要求10或11或12所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中將氧化硅凝膠涂漬于所述管道或腔體內壁的線速度為0.01-1000mm/s，涂覆后的氧化硅凝膠層可經氮氣流干燥0.01-10000小時，氮氣流速可為0.001-1000.0m/s。
14.根據權利要求13所述的制備方法，其特征在于所述將氧化硅凝膠涂漬于所述管道或腔體內壁的線速度為5mm/s，涂覆后的氧化硅凝膠層經氮氣流干燥的時間為24小時，氮氣流速為0.5m/s。
15.權利要求1-7任一項所述的非填充式核酸提取器件在提取核酸中的應用。
16.根據權利要求15所述的應用，其特征在于所述提取核酸的方法包括以下步驟1)將非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體依次用吸附液，清洗液，洗脫液，以及所述吸附溶液各浸泡15-60min；所述吸附液為0-7M鹽酸胍溶液、碘化鈉溶液或異硫氰酸胍溶液；所述清洗液為體積百分濃度為50-100％的異丙醇水溶液或50-100％乙醇等；所述洗脫液為0-1000mM pH6.0-14.0的Tris溶液或pH6.0-14.0的水；2)將待分離樣品加入所述非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體中，靜置或流動吸附；3)用所述清洗溶液對非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔體進行清洗；4)用所述洗脫溶液進行洗脫，得到核酸樣品。
17.根據權利要求16所述的應用，其特征在于所述步驟1)中的吸附液為6M鹽酸胍溶液；所述清洗液為體積百分濃度為80％的異丙醇水溶液或80％乙醇；所述洗脫液為5mM pH8.5的Tris溶液。
18.根據權利要求16所述的應用，其特征在于所述步驟1)中的吸附溶液中還包含有1-100mM三羥甲基氨基甲烷和/或0.1-10mM乙二胺四己酸納，溶液pH值為1.0-9.0。
19.根據權利要求16或17或18所述的應用，其特征在于所述步驟2)中若非填充式核酸提取器件為腔體式的，采用靜置吸附方式，吸附時間為15-60min，若非填充式核酸提取器件為管道式的，采用靜置或流動吸附方式，靜置吸附時間為15-60min，流動吸附時待分離樣品液在管道中的流速為1-3mL/h。
全文摘要
本發明公開了一種非填充式核酸提取器件及其制備方法與應用。其目的是提供一種以塑料為基材制作的非填充式核酸提取器件與其在提取核酸中的應用。該非填充式核酸提取器件是由至少一個結構單元組成的，所述結構單元包括有均為塑料材質的一蓋體和一樣品吸附載體，所述樣品吸附載體上設有管道、凹槽或腔體，所述蓋體與樣品吸附載體上具有管道、凹槽或腔體的一面緊密貼合，所述管道、凹槽或腔體內壁上設有氧化硅凝膠層，所述蓋體或樣品吸附載體上對應于所述管道、凹槽或腔體的位置設有至少一個進樣孔和一個出樣孔。本發明的非填充式核酸提取器件制備方法簡單，成本低廉，將在核酸的提取及其分析研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK101016510SQ20071006401
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月16日 優先權日2007年2月16日
發明者劉慣超, 邢婉麗, 程京 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學