專利名稱：：疊加式通氣培養(yǎng)鐵皮石斛胚狀體及其干粉工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于現(xiàn)代生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及藥用高等植物工廠化生產(chǎn)原生藥材及干品制備工藝技術(shù)；以鐵皮石斛為例說明該發(fā)明應(yīng)用之途徑。技術(shù)背景進(jìn)入21世紀(jì)，隨著城市進(jìn)程和人口的膨脹，生態(tài)環(huán)境遭到不斷侵蝕，許多種藥用高等植物的原生地遭到破壞，尤其對(duì)于像鐵皮石斛這類生長(zhǎng)緩慢，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，生物量低下的物種，首當(dāng)其沖地遭到枯竭和滅絕。現(xiàn)在真正的天然野生鐵皮石斛到了一枝難求的地步。鐵皮石斛是石斛家族中藥用方面的姣姣者，人們?cè)谏蟼€(gè)世紀(jì)7080年代時(shí)開始試圖用生物技術(shù)加傳統(tǒng)人工引種栽培擴(kuò)大產(chǎn)量，迄今均收效甚微，存在投入量大，周期長(zhǎng)(35年)，成活率低等問題。應(yīng)用生物培養(yǎng)技術(shù)拯救這類名貴中藥材使其有價(jià)有市滿足人們需要是一條行之有效的途徑。在此
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)，盡管已有通過培養(yǎng)方法來制備鐵皮石斛材料，但由于其種子為芽蔟，并采用淺層培養(yǎng)，故而周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是，以鐵皮石斛為例，采用避免常規(guī)植物組織培養(yǎng)中通過脫分化或再分化等的生物技術(shù)過程，以免引起遺傳變異。藥材強(qiáng)調(diào)的"地道"。本發(fā)明直接從原生植株的休眠芽獲取胚狀體，保證源頭上的"原汁原味"。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一套使之從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模向工廠化生產(chǎn)轉(zhuǎn)變的工藝流程和技術(shù)參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，拯救更多更廣泛的藥用資源，滿足人們不斷增長(zhǎng)的需要。本發(fā)明提供的鐵皮石斛胚狀體制備方法，是基于高等植物具有二個(gè)全能性——高等植物細(xì)胞在一定條件下，能形成完整植株的全能性，和合成原生植株藥用有效成份的全能性。本發(fā)明強(qiáng)調(diào)使培養(yǎng)物一直保持在高密度，年輕態(tài)，是為了保證在工廠化生產(chǎn)過程中，使固液比達(dá)到2535%，"比生物生長(zhǎng)速率"達(dá)到8.4毫克/克.天，鮮品得率保證在10%以上，有效成份多糖達(dá)16%以上。具體操作步驟取野外生長(zhǎng)成材鐵皮石斛莖段，在實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)上仔細(xì)剝?nèi)ト~鞘和葉片，50%乙醇浸潤(rùn)(35秒)，放入0.1%升汞中15分鐘，然后轉(zhuǎn)到飽和次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液中78分鐘，在超凈臺(tái)上用滅菌水沖洗三遍，放到滅菌吸水紙上吸干，滅菌刀片切取帶節(jié)的莖段，接種到1/2MS無機(jī)鹽，含NAA，BA，蔗糖3%，瓊脂粉4.5g/升，經(jīng)4050天后起始胚狀體形成，等到起始胚狀體長(zhǎng)成黃豆粒大小時(shí),仔細(xì)剝離外植體，每個(gè)三角瓶按等邊三角形接種3個(gè)點(diǎn)，上述固體培養(yǎng)基上，另加入CH1000毫克/升，2.5%蔗糖0.5%麥芽糖。29°C±1，室內(nèi)自然光照條件下，擴(kuò)增，達(dá)到要求數(shù)量后，轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基(上述成份去掉瓊脂粉)，置于150毫升三角瓶裝液量75毫升，90轉(zhuǎn)/分回轉(zhuǎn)或搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。每7天繼代一次。34次后進(jìn)入篩選過程。篩選后的胚狀體用于疊加式培養(yǎng)擴(kuò)增。符合工廠化生產(chǎn)要求鐵皮石斛胚狀體篩選過程-在全過程中，密切注意篩選出生長(zhǎng)速率快，胚狀體球狀物生長(zhǎng)密集，從圓球形，大小均勻的年輕態(tài)胚狀體，顏色上保持鮮活淺綠色，及時(shí)淘汰乳白色或叢芽狀，芽簇狀的培養(yǎng)物。這種培養(yǎng)對(duì)于工廠化生產(chǎn)，對(duì)于最終成品的鐵皮石斛多糖含量的穩(wěn)定，得干率，固液比等技術(shù)參數(shù)的滿足是至關(guān)重要的，是成敗關(guān)鍵。用本發(fā)明生產(chǎn)出的鐵皮石斛鮮品，清水沖洗后放到合格認(rèn)證的室內(nèi)，常溫下，涼干至其含水量在5%以后，在55'C烘箱中，烘至絕對(duì)干重，超級(jí)粉碎，定量包裝后，經(jīng)醫(yī)用鈷室伽瑪射線滅活菌。本發(fā)明的工藝流程達(dá)到了如下的結(jié)果-1、本發(fā)明通過鐵皮石斛胚狀體為實(shí)例，獲得的產(chǎn)品，其藥用有效成^—鐵皮石斛多糖達(dá)到16%以上，并保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，生產(chǎn)過程的連續(xù)性。2、通過本發(fā)明生產(chǎn)流程，能大大地提高象鐵皮石斛這一類生長(zhǎng)緩慢，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境苛刻，生物量低下的名貴中藥材，年產(chǎn)量達(dá)到噸位水平，大大超過了任何實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。圖l，疊加式通氣培養(yǎng)鐵皮石斛胚狀體及其干粉工藝流程圖圖2，小容量疊加式通氣培養(yǎng)裝置示意圖。其中，l通氣泵、2通氣管、3配氣閥(三通)、4進(jìn)氣過濾器、5進(jìn)氣管、6容器、7液面層、8排氣頭、9排氣管、IO排氣過濾器。具體實(shí)施案例實(shí)施案例僅為說本發(fā)明，詳細(xì)描述工藝技術(shù)特征,本發(fā)明，不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明下述所涉及的培養(yǎng)基-MS培養(yǎng)基應(yīng)理解，下述實(shí)施例僅用于KN03l卯0mg/LH3B036.2mg/L1650mg/LKI0.83MgS04'7H20370mg/LNa2Mo4-.2H200.25CaCl2.2H20440mg/LMnS04.4H2022.3KH2P。4170mg/LZnS04'7H208.6Na2-EDTA37.3mg/LCoCl2-6H200.025Fe2S0427.8mg/LCuSCV5H200.025CHlOOOmg/L肌醇lOOmg/L蔗糖25g/L50mg/L麥芽糖5g/LB61.5mg/L5%香蕉汁PH5.8NAABA適量121'C1.1大氣壓滅菌21分鐘固體培養(yǎng)基4.5g/L瓊脂粉液體培養(yǎng)基去脫脂瓊即成實(shí)施例1.起始胚狀體的誘導(dǎo)為保證遺傳上的一致性，避免常規(guī)組織培養(yǎng)中，由于脫分化和再生分化過程而帶來的遺傳變異。該工藝的技術(shù)關(guān)鍵是直接從野外生長(zhǎng)的鐵皮石斛原生植株休眠芽上獲得胚狀體,從而保證源頭上的原汁原味。將采集的原生植株莖段經(jīng)滅菌后，在超凈臺(tái)上，切取帶節(jié)的切段，每段含一個(gè)節(jié)。節(jié)上下保留0.5公分，以便減少污染利于成功。每個(gè)150毫升三角瓶中裝50毫升的固體培養(yǎng)基，每瓶插一段。4050天后形成起始胚狀體。實(shí)施例2起始胚狀體的擴(kuò)增將黃豆粒大小的胚狀體"球"，小心地剝離外植體，移到增值培養(yǎng)基上，每瓶放三個(gè)點(diǎn)呈等邊三角形，以利于形成條件培養(yǎng)基，達(dá)到快速增值的目的。實(shí)施例3適合工廠化生產(chǎn)要求的胚狀體蹄選<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>能否篩選出滿足工廠化生產(chǎn)要求的胚狀體，是該工藝的物質(zhì)基礎(chǔ)，技術(shù)保證。將固體培養(yǎng)基上擴(kuò)增獲得胚狀體，按5%(w/w)接種量，接種到液體培養(yǎng)基中，放在回轉(zhuǎn)式(卯轉(zhuǎn)/分)搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，保持室內(nèi)自然光照，29°C±1;每七天繼代一次；經(jīng)34次繼代后，不間斷地進(jìn)行挑選那些保持圓球狀、生長(zhǎng)密集、淺綠色的胚狀體"球"。淘汰那些長(zhǎng)成叢芽狀或芽簇壯的培養(yǎng)物，使培養(yǎng)物一直保持在形態(tài)上的一致性和年輕態(tài)，以利于提高"比生物生長(zhǎng)速率"滿足于工廠化生產(chǎn)。這樣的培養(yǎng)物最終能保證"固液比"和鮮品的得干率(10%以上)，最終獲得較高的生產(chǎn)率。資料顯示，高等植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵是培養(yǎng)物的"比生物生長(zhǎng)速率"能否達(dá)到5.7毫克/克.天。(約自然生長(zhǎng)速率的850倍以上)通過該工藝篩選到的胚狀體其生長(zhǎng)速率達(dá)到8.4毫克/克.天。實(shí)施例4小容量疊加式通氣懸浮培養(yǎng)鐵皮石斛胚狀體的工藝流程該工藝流程專門針對(duì)高等植物在實(shí)驗(yàn)室水平規(guī)模轉(zhuǎn)向工廠化規(guī)模轉(zhuǎn)化而設(shè)計(jì)的。高等植物工廠化懸浮培養(yǎng)中污染關(guān)，種子成本大，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，三大難關(guān)。該工藝的特點(diǎn)是，采用小容量，一對(duì)一接種，分級(jí)連續(xù)培養(yǎng)種子，分級(jí)收集終端成品，使污染風(fēng)險(xiǎn)降到最低，使生產(chǎn)流程連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。以鐵皮石斛這種名貴、生長(zhǎng)緩慢、自然資源極度枯竭的中藥材為例，能以工廠化規(guī)模生產(chǎn)鐵皮石斛干粉，年產(chǎn)量達(dá)到"噸"位水平，滿足人類需要。工藝流程:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例5鐵皮石斛胚狀體多糖含量及穩(wěn)定性的測(cè)定經(jīng)該工藝流程生產(chǎn)的鐵皮石斛多糖，無論在任何一級(jí)收獲的成品，其多糖含量都達(dá)到16%以上，與原生植株含量相似或相等，且成品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。權(quán)利要求1.適合工廠化生產(chǎn)鐵皮石斛胚狀體的篩選程序。該工藝包括下列A.起始胚狀體的誘導(dǎo)將采集的原生植株莖段經(jīng)滅菌后，在超凈臺(tái)上，切取帶節(jié)的切段，每段含一個(gè)節(jié)。節(jié)上下保留0.5公分，以便減少污染利于成功。每個(gè)150毫升三角瓶中裝50毫升的固體培養(yǎng)基，每瓶插一段。40～50天后形成起始胚狀體。B.起始胚狀體的擴(kuò)增將黃豆粒大小的胚狀體“球”，小心地剝離外植體，移到增值培養(yǎng)基上，每瓶放三個(gè)點(diǎn)呈等邊三角形，以利于形成條件培養(yǎng)基，達(dá)到快速增值的目的。C.適合工廠化生產(chǎn)要求的胚狀體篩選將固體培養(yǎng)基上擴(kuò)增獲得胚狀體，按5％(w/w)接種量，接種到液體培養(yǎng)基中，放在回轉(zhuǎn)式，90轉(zhuǎn)/分。搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，保持室內(nèi)自然光照，29℃±1；每七天繼代一次；經(jīng)3～4次繼代后，不間斷地進(jìn)行挑選那些保持圓球狀、生長(zhǎng)密集、淺綠色的胚狀體“球”。淘汰那些長(zhǎng)成叢芽狀或芽簇壯的培養(yǎng)物，使培養(yǎng)物一直保持在形態(tài)上的一致性和年輕態(tài)，以利于提高“比生物生長(zhǎng)速率”滿足于工廠化生產(chǎn)。這樣的培養(yǎng)物最終能保證“固液比”和鮮品的得干率(10％以上)，最終獲得較好的生產(chǎn)率。D.疊加式通氣懸浮培養(yǎng)鐵皮石斛胚狀體的工藝流程。該工藝流程專門針對(duì)高等植物在實(shí)驗(yàn)室水平規(guī)模轉(zhuǎn)向工廠化規(guī)模轉(zhuǎn)化而設(shè)計(jì)的。高等植物工廠化懸浮培養(yǎng)中污染關(guān)，種子成本大，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，三大難關(guān)。該工藝的特點(diǎn)是，采用小容量，一對(duì)一接種，分級(jí)連續(xù)培養(yǎng)種子，分級(jí)收集終端成品，最大培養(yǎng)容器體積為1至100升；每個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)單位含10至100個(gè)培養(yǎng)容器。在培養(yǎng)溫室內(nèi)(20C-32C)設(shè)20-200個(gè)培養(yǎng)單位。按此疊加式培養(yǎng)方式，日產(chǎn)量為1公斤至2000公斤。經(jīng)該工藝流程生產(chǎn)的鐵皮石斛多糖，無論在任何一級(jí)收獲的成品，其多糖含量都達(dá)到16％以上，與原生植株含量相似或相等，且成品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。2.—種以權(quán)利要求1所敘述的鐵皮石斛胚狀體，其特征"比生物生長(zhǎng)速率"達(dá)到8.49.2毫克/克'天，每10天增重2倍以上。其有效成份多糖含量達(dá)到16%以上，且保持穩(wěn)定。3.—種以權(quán)利要求1所敘述的小容量疊加式通氣培養(yǎng)鐵皮石斛胚狀體工藝流程，解決了鐵皮石斛胚狀體生產(chǎn)走出實(shí)驗(yàn)室規(guī)模轉(zhuǎn)化為工廠化生產(chǎn)。干品產(chǎn)量達(dá)到噸位/年水平。多糖含量達(dá)到16%以上。4.一種如權(quán)利要求2所述的鐵皮石斛胚狀體的產(chǎn)品用途，所收集鮮品鐵皮石斛胚狀體通過下列方法制成食用和藥用千粉收各級(jí)培養(yǎng)收集的終端成品。用清水沖洗干凈后，在達(dá)標(biāo)的室內(nèi)常溫薄層涼干至含水量5%以下時(shí)，在55"C烘箱中，最后烘到絕對(duì)干重。超級(jí)粉碎，打包，在醫(yī)用伽瑪射線射線室中滅活菌。注意整個(gè)過程中不能超過65。C以上"高溫"。否則會(huì)導(dǎo)致鐵皮石斛產(chǎn)品中許多生理活性物質(zhì)的破壞或變性。全文摘要本發(fā)明公開了利用疊加式工廠化生產(chǎn)鐵皮石斛胚狀體及其干粉的工藝流程和技術(shù)。該發(fā)明克服了高等植物組織培養(yǎng)走出實(shí)驗(yàn)室向工廠化生產(chǎn)轉(zhuǎn)化中，易污染，種子成本高，生產(chǎn)速度慢的難關(guān)；用該工藝流程使鐵皮石斛“比生物生長(zhǎng)速率”達(dá)到8.4～9.2毫克/克·天。用該工藝生產(chǎn)出的鐵皮石斛胚狀體干粉，鐵皮石斛多糖含量達(dá)到16％以上，且多糖含量穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性可靠，生物活性高。生產(chǎn)周期短(十天收獲一次)。年產(chǎn)干品達(dá)到噸位水平。文檔編號(hào)C12P19/00GK101245333SQ20071006400公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2007年2月16日優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日發(fā)明者曹興華申請(qǐng)人:曹興華;馬興凱