專利名稱：一種miRNA屏障技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術。
背景技術：
miRNAs是一類長為21～25nt的非編碼的單鏈RNA分子，廣泛存在于植物和從線蟲到人類的細胞中。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種廣泛存在、對基因表達進行微調的分子，在人類基因組中miRNA基因約占1％，是一類進化上高度保守、在生命中起著重要調控作用的分子。miRNA的靶向基因多數是參與轉錄、信號轉導、腫瘤發生的基因，盡管miRNA的作用也是特異的，特別是5′端的2～8個堿基，特異性靶向于它的靶基因，但是與siRNA(smallinference RNA)不同的是miRNA的特異性并不是那么強，在生物體內往往一個miRNA作用于多個靶向基因或多個miRNA調控一個靶向基因。
目前尋找miRNA、篩選miRNA靶向位點的方法比較成熟，例如用MirScan計算機分析工具來尋找miRNA分子已經在線蟲及脊椎動物體內取得了巨大的成功，另外miRseeker、NCBI的BLAST以及mfold軟件也都是尋找miRNA常用的軟件工具，2004年6月吳政道在前述的計算機方法的基礎上提出一種可以進行高通量篩選miRNA靶向位點的方法等。雖然目前尋找、篩選miRNA靶向位點的方法比較成熟，也已經發現了千余個miRNA，但至今為止真正確認功能的miRNA還是微乎其微。

發明內容
為了進一步研究目標mRNA和miRNA對目標mRNA的調控作用，本發明提供了一種miRNA屏障技術。miRNA屏障技術按以下步驟實施(一)測定目標mRNA的3’UTR內與miRNA結合的靶向基因序列；(二)合成可與步驟(一)測得的靶向基因序列嚴密結合的特異性反義寡聚屏障序列；(三)將特異性反義寡聚屏障序列轉導入細胞與目標mRNA結合形成二倍體，即可屏障目標mRNA的miRNA；所述步驟(二)中特異性反義寡聚屏障序列分子兩端的5個核苷酸或脫氧核苷酸鎖定，核糖環被位于2’氧原子和4’碳原子的亞甲基橋連。
本發明miRNA屏障技術與傳統miRNA反義技術的明顯不同點1、本發明miRNA屏障技術根據目標mRNA的3’UTR內與miRNA結合的靶向基因序列設計特異性反義寡聚屏障序列，而傳統miRNA反義技術則是根據該miRNA的序列設計反義寡聚序列(AMO)。
2、本發明miRNA屏障技術通過所合成的特異性反義寡聚屏障序列與目標mRNA的結合，阻止了miRNA對目標mRNA蛋白翻譯的特異性抑制作用，從而增加目標mRNA的表達。傳統miRNA反義技術則是與該miRNA相結合，導致該miRNA失效并降解，從而增加目標mRNA的表達。
3、本發明miRNA屏障技術中所合成的特異性反義寡聚屏障序列與目標mRNA序列完全互補，所以具有基因特異性。而傳統miRNA反義技術僅是根據該miRNA特異性片段設計，不具有基因特異性。同時，由于一個miRNA可能作用于多個靶向基因，所以該miRNA失效可能會影響多個基因的正常表達。
經免疫印跡檢測證實特異性反義寡聚屏障序列轉導進細胞后能夠阻斷內源miRNA到達目的mRNA的結合位點，降低了miRNA的基因表達抑制作用，而且本發明中的特異性反義寡聚屏障序列具有翻轉內源性miRNA引起的目的mRNA抑制的作用。
本發明的技術方法具有導入基因穩定、高效表達，安全性高的優點。本發明不僅表明以基因特異性方式干預miRNA作用的可行性，而且為研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，也使選擇性的基因治療策略成為可能，并為miRNAs基因特異性應用奠定了基礎。


圖1是HCN2 mRNA、HCN4 mRNA、特異性反義寡聚屏障序列X1、X2和X3的序列圖；圖2、圖3和圖4是具體實施方式
四中對比實驗的3項檢測結果圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式miRNA屏障技術按以下步驟實施(一)測定目標mRNA的3’非編碼區(3’UTR)內與miRNA結合的靶向基因序列；(二)合成可與步驟(一)測得的靶向基因序列嚴密結合的特異性反義寡聚屏障序列；(三)將特異性反義寡聚屏障序列轉導入細胞與目標mRNA結合形成二倍體，即可屏障靶向mRNA的miRNA；所述步驟(二)中特異性反義寡聚屏障序列分子兩端的5個核苷酸或脫氧核苷酸鎖定，核糖環被位于2’氧原子和4’碳原子的亞甲基橋連。
本發明中特異性反義寡聚屏障序列導入靶向細胞后阻斷了內源性該miRNA的作用，并可維持長期有效，且對靶向細胞無害。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(二)中特異性反義寡聚屏障序列為22nt。其它步驟及所選參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(三)中采用磷酸鈣-DNA共沉淀法、脂質體介導DNA轉染法或電擊法轉導特異性反義寡聚屏障序列。其它步驟及所選參數與實施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式經檢測證實miR-1和miR-133可以抑制HCN2 mRNA表達，而且HCN4 mRNA是miR-1的又一靶向位點。根據目標HCN2 mRNA和HCN4 mRNA的3’UTR的miRNA結合位點，分別設計特異性反義寡聚屏障序列miRNA-masking antisense ODN1、ODN2和ODN3，HCN2mRNA、HCN4 mRNA及特異性反義寡聚屏障序列miRNA-masking antisenseODN1、ODN2和ODN3的序列如圖1所示；合成特異性反義寡聚屏障序列且序列ODN1、ODN2和ODN3；將特異性反義寡聚屏障序列轉導到細胞中與目標mRNA結合形成二倍體。
在相同實驗條件下，將等劑量的傳統miRNA反義技術合成的miR-1和miR-133的反義寡聚序列及ODN1、ODN2和ODN3轉導到細胞中與空白對照細胞進行對比試驗，實驗結果表明HCN2和HCN4的表達及功能明顯提高，具體檢測結果如圖2、圖3和圖4所示。在ODN1、ODN2和ODN3轉導進細胞后HCN2與HCN4的蛋白水平和起搏電流傳導性都明顯大幅提高，說明HCN2與HCN4的表達和功能明顯提高，證明本實施方式miRNA屏障獲得成功。
具體實施方式
五本實施方式miRNA屏障技術按以下步驟實施(一)測定目標mRNA的3’非編碼區(3’UTR)內與miRNA結合的靶向基因序列；(二)合成可與步驟(一)測得的靶向基因序列嚴密結合的22nt的特異性反義寡聚屏障序列，特異性反義寡聚屏障序列分子兩端的5個核苷酸或脫氧核苷酸鎖定，核糖環被位于2’氧原子和4’碳原子的亞甲基橋連，并構建miRNA靶點—螢光素酶指示劑載體(PGL3-靶DNA)；(三)將特異性反義寡聚屏障序列轉導入購自美國標準菌庫(ATCC，Manassas，VA)的H9c2細胞(大鼠心室肌細胞株)，再將1μg PGL3-靶DNA以及0.1μg PRL-TK(胸苷激酶驅動的Renilla螢光素酶表達載體)利用lipofectamine 2000(Invitrogen)進行共轉染，在轉染的48小時內用雙重的螢光素酶指示劑測定試劑盒(Promega)在發光測量計上(Lumat LB9507)測量螢光素酶的活性(雙螢光素酶報告基因系統歸一反應)。
本實施方式以目標mRNA的3’UTR為模板通過PCR技術合成能與miRNA結合的寡核苷酸序列，并參照Promega公司螢光素酶檢測系統產品說明書(原英文技術手冊號碼TB281)中載體的構建方法將合成的寡核苷酸序列插入到下游螢光素酶基因(采用HindIII和SpeI雙酶切)的多克隆位點上。本實施方式中細胞都是在無血清的培養液中饑餓24小時后進行轉染。本實施方式中反義的寡核苷酸對lipofectamine 2000需有特異性。
目標mRNA轉錄的定量檢測采用傳統的實時RT-PCR技術，從轉染48小時之后的培養的新生大鼠心室肌細胞中提取總的RNA，這種mirVanaTMqRT-PCR檢測試劑盒(Ambion)能夠從總的RNA中能夠靈敏的，快速地定量miRNA的表達。
經多組、多次對照實驗證明采用miRNA屏障技術后mRNA表達蛋白的水平顯著提高70％以上。
進行miRNA屏障技術的基因特異性妨礙miRNA活動的可行性評估，經實驗證明miRNA類似物誘導的靶向基因抑制作用在本實施方式合成的特異性反義寡聚屏障序列存在時也存在；本實施方式合成的特異性反義寡聚屏障序列在阻斷被AMO阻斷的miRNA時與AMOs無疊加效應；而且本實施方式合成的特異性反義寡聚屏障序列對細胞內源性miRNA的水平無影響。
權利要求
1.一種miRNA屏障技術，其特征在于miRNA屏障技術按以下步驟實施(一)測定目標mRNA的3’UTR內與miRNA結合的靶向基因序列；(二)合成可與步驟(一)測得的靶向基因序列嚴密結合的特異性反義寡聚屏障序列；(三)將特異性反義寡聚屏障序列轉導入細胞與目標mRNA結合形成二倍體，即可屏障靶向mRNA的miRNA；所述步驟(二)中特異性反義寡聚屏障序列分子兩端的5個核苷酸或脫氧核苷酸鎖定，核糖環被位于2’氧原子和4’碳原子的亞甲基橋連。
2.根據權利要求1所述的一種miRNA屏障技術，其特征在于步驟(二)中特異性反義寡聚屏障序列為22nt。
3.根據權利要求1所述的一種miRNA屏障技術，其特征在于步驟(三)中采用磷酸鈣-DNA共沉淀法、脂質體介導DNA轉染法或電擊法轉導特異性反義寡聚屏障序列。
全文摘要
一種miRNA屏障技術，它涉及一種生物技術。miRNA屏障技術按以下步驟實施(一)測定目標mRNA的3′UTR內與miRNA結合的靶向基因序列；(二)合成特異性反義寡聚屏障序列；(三)將特異性反義寡聚屏障序列轉導入細胞與目標mRNA結合形成二倍體，即可屏障靶向mRNA的miRNA；所述步驟(二)中特異性反義寡聚屏障序列分子兩端的5個核苷酸或脫氧核苷酸鎖定，核糖環被位于2′氧原子和4′碳原子的亞甲基橋連。本發明的技術方法具有導入基因穩定、高效表達，安全性高的優點。本發明不僅表明以基因特異性方式干預miRNA作用的可行性，而且為研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，也使選擇性的基因治療策略成為可能，并為miRNAs基因特異性應用奠定了基礎。
文檔編號C12N15/09GK101054576SQ20071007200
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月6日 優先權日2007年4月6日
發明者楊寶峰, 王志國, 呂延杰, 王寧, 張瑩 申請人:哈爾濱醫科大學, 王志國