專利名稱：擬miRNA序列及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNA序列及其制備方法。
背景技術(shù)：
miRNAs是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過酶加工后生成的一類長約21～25nt的非編碼的單鏈RNA分子，廣泛存在于植物和從線蟲到人類的細胞中。微小RNA(miRNA)是一種廣泛存在、對基因表達進行微調(diào)的分子，在人類基因組中miRNA基因約占1％，miRNA的靶向基因多數(shù)是參與轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生的基因，是一類進化上保守、在生命中起著重要調(diào)控作用的分子。miRNA對靶向基因的微調(diào)具有如下優(yōu)點①比從蛋白水平的調(diào)節(jié)更節(jié)省能量；②相對于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，miRNA的效果更快而且是可逆的；③對于一些只需微量蛋白進行調(diào)節(jié)的細胞功能，就可通過miRNA來達到調(diào)控目的；④內(nèi)含子中編碼的miRNA是一種可高效利用的細胞內(nèi)資源。
盡管miRNA的作用也是特異的，特別是5′端的2～8個堿基，特異性靶向于它的靶基因，但是與siRNA(small inference RNA)不同的是miRNA的特異性并不強，在生物體內(nèi)往往一個miRNA作用于多個靶向基因或多個miRNA調(diào)控一個靶向基因，因此缺乏基因特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決miRNA缺乏基因特異性的缺陷，而提供的一種擬miRNA序列及其制備方法。
擬miRNA序列為22nt，序列5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與目標mRNA的3’UTR的延伸序列特異性互補。上述擬miRNA序列按以下步驟制備(一)測定目標mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根據(jù)延伸序列特異性設(shè)計含有22 nt的擬miRNA序列，其中擬miRNA序列5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補，即得到擬miRNA序列。
本發(fā)明通過MirScan、miRseeker、BLAST及mfold等基因序列分析軟件和網(wǎng)上基因序列比對工具測定目標mRNA的3’UTR的延伸序列，并找到目標mRNA的特異性片斷，再根據(jù)延伸序列特異性設(shè)計擬miRNA序列。
本發(fā)明中的擬miRNA序列與傳統(tǒng)的外源性小分子干擾RNA(siRNA)相比具有以下明顯區(qū)別①雖然擬miRNA和siRNA都是外源性RNA，但siRNA必須與靶標基因序列完全配對才能起到基因沉默的作用，而擬miRNA只需與靶標基因序列配對6個核苷酸便可起到基因沉默的作用。設(shè)計擬miRNA比設(shè)計siRNA要更容易，因為在靶標基因上尋找一段較短的基因特異性序列顯然比尋找一段較長的基因特異性序列的機率要高得多。
②作用位置擬miRNA與內(nèi)源性miRNA一致主要作用于靶標基因的3’UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
③作用方式擬miRNA與miRNA都主要抑制目標基因的翻譯，在某些條件下亦可導(dǎo)致目標基因mRNA降解，即擬miRNA在目標基因轉(zhuǎn)錄后抑制起作用；而siRNA通過降解目標基因mRNA而起到基因沉默的作用，不直接影響目標基因的翻譯過程。因此一旦消除了擬miRNA之后完整的目標基因mRNA即可恢復(fù)翻譯過程而合成蛋白，而在消除siRNA之后蛋白翻譯過程須待新的消除基因mRNA完成轉(zhuǎn)錄后才能重新啟動。
人工合成擬miRNA與內(nèi)源性miRNA具有如下區(qū)別人工合成的擬miRNA是根據(jù)目的基因的序列設(shè)計而成，基因作用具有特異性，擬miRNA下游調(diào)控靶點單一且特異；而內(nèi)源性miRNA的作用缺乏選擇性，一個miRNA可以作用于多個基因，產(chǎn)生多重后續(xù)效應(yīng)。本發(fā)明提供的擬miRNA序列因具有基因特異性，為研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，可廣泛應(yīng)用于疾病的基因診斷與治療，并擴展應(yīng)用于生物學領(lǐng)域。
本發(fā)明擬miRNA具有轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定、高效表達，安全性高的優(yōu)點。


圖1是miR-HCN2基因序列圖；圖2是miR-HCN4基因序列圖；圖3是H9c2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄HCN2的mRNA水平檢測圖，圖中黑色實心條形柱表示轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-HCN2后H9c2細胞內(nèi)mRNA的水平，圖中白色空心條形柱表示空白對照組H9c2細胞內(nèi)mRNA的水平；圖4是H9c2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄HCN4的mRNA水平檢測圖，圖中黑色實心條形柱表示轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-HCN4后H9c2細胞內(nèi)mRNA的水平，圖中白色空心條形柱表示空白對照組H9c2細胞內(nèi)mRNA的水平。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式擬miRNA序列為22nt，序列5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與目標mRNA的3’UTR的延伸序列特異性互補。
本實施方式擬miRNA序列可通過以下方式導(dǎo)入1、直接將擬miRNA導(dǎo)入體內(nèi)的方法(a)異位導(dǎo)入將擬miRNA導(dǎo)入非病變的細胞，如皮下，肌肉等；(b)原位導(dǎo)入將擬miRNA直接導(dǎo)入病變的部位，如腫瘤細胞、骨髓細胞等；2、擬miRNA治療的體外導(dǎo)入(回輸)即將病人的部分組織或細胞取出在體外培養(yǎng)，在導(dǎo)入擬miRNA后再回輸入體內(nèi)；3、體細胞擬miRNA導(dǎo)入將擬miRNA轉(zhuǎn)移到體細胞(使之發(fā)揮內(nèi)源性miRNA功能，以達到治療的目的)；4、生殖細胞的擬miRNA導(dǎo)入將擬miRNA轉(zhuǎn)移到患者的生殖細胞(精細胞或卵細胞)或中早期胚胎中(使其可以發(fā)育成正常個體，一般采用顯微注射法)。
本實施方式擬miRNA序列可用于多種疾病，如腫瘤、高血壓、哮喘、糖尿病、肥胖癥、心臟病、老年癡呆癥等的協(xié)助診斷和治療。
經(jīng)多組對比實驗證明擬miRNA序列22nt中5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸必須與目標mRNA的3’UTR中延伸序列特異性互補，否則合成出的擬miRNA對目標mRNA的表達無影響。
具體實施方式
二本實施方式擬miRNA序列按以下步驟制備(一)測定目標mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根據(jù)延伸序列特異性設(shè)計含有22nt的擬miRNA序列，其中擬miRNA序列5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補，即得到擬miRNA序列。
在已知因miRNA紊亂而引起的高血壓、心臟病等心血管疾病的基礎(chǔ)上，可采用擬miRNA診斷并治療。如在心肌肥大發(fā)病過程中患者體內(nèi)的miR-29c、miR-93、miR-150、miR-195等miRNA發(fā)生變化，在心衰過程中患者體內(nèi)的miR-24、miR-125b、miR-195、miR-199a、miR-214等miRNA發(fā)生變化，因此采用本實施方式方法制備上述miRNA的擬miRNA序列在基因水平治療這些疾病。
本實施方式制備的擬miRNA序列用于腫瘤的診斷與治療，例如miR-15和miR-16定位在染色體13q14區(qū)段，研究發(fā)現(xiàn)65％的慢性淋巴性白血病(CLL)病人攜帶miR-15與miR-16丟失或突變的癌細胞，在慢性淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和前列腺癌中也常有該區(qū)段的丟失。這兩種miRNA通過抑制Bcl-2蛋白的表達調(diào)節(jié)細胞凋亡過程，Bcl-2蛋白主要通過作用于線粒體來實現(xiàn)其抑制凋亡的生物學活性，因此當miR-15和miR-16丟失或突變，Bcl-2蛋白的表達量上升，腫瘤細胞凋亡受阻，所以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。因此采用本實施方式制備擬miRNA可達到治療上述腫瘤的作用。
本實施方式制備的擬miRNA序列用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷與治療。如可以定位Alzheimer′s disease(阿耳茨海默病，老年性癡呆)、Parkinson′s disease(帕金森氏病，震顫麻痹)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病miRNA，就可以采用擬miRNA進行治療。
通過人工合成并導(dǎo)入相應(yīng)擬miRNA調(diào)節(jié)失去控制的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以診斷與治療由遺傳因素引發(fā)的疾病，如糖尿病、肥胖癥、哮喘等疾病。
有些miRNA是干細胞特有的(如小鼠干細胞特異表達miR-290～295，人干細胞特異表達miR-371～373)，因此可人工合成相應(yīng)的擬miRNA進行干細胞誘導(dǎo)分化治療相關(guān)疾病。同樣擬miRNA可以應(yīng)用于其它生物學領(lǐng)域，如Notch信號途徑在多細胞生物發(fā)育中極為重要，在果蠅中Notch基因編碼螺旋-環(huán)-螺旋抑制子和羽毛蛋白，最近發(fā)現(xiàn)這些基因的3’UTR K-box、GY-box、Brd-box模序也為miRNA所調(diào)節(jié)，K-box被miR-2、miR-11調(diào)節(jié)，GY-box被miR-7調(diào)節(jié)，Brd-box被miR-4、miR-79調(diào)節(jié)，進而影響翅膀血管空間分布、薄厚等表型，因此可人工合成的擬miR-2、miR-11、miR-7、miR-4及miR-79等，可對其它生物體的器官功能進行調(diào)節(jié)。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(二)中擬miRNA序列5’末端有2～7個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補。其它步驟及所選參數(shù)與實施方式二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(二)中擬miRNA序列5’末端有3～6個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補。其它步驟及所選參數(shù)與實施方式二相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
二的不同點是步驟(二)中擬miRNA序列5’末端有4～5個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補。其它步驟及所選參數(shù)與實施方式二相同。
具體實施方式
六本實施方式經(jīng)檢測證實miR-1和miR-133能夠抑制HCN2的轉(zhuǎn)錄、miR-1能夠抑制HCN4的轉(zhuǎn)錄、miR-1和miR-133也可以用于降低心室肌細胞起搏點活性。首先通過基因序列分析軟件測定目標mRNA的3’UTR的延伸序列，并找到目標mRNA的特異性片斷，再根據(jù)延伸序列特異性設(shè)計22nt的擬miRNA序列miR-HCN2(miR-HCN2基因序列如圖1所示)，擬miRNA序列miR-HCN2的5’末端有8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與目標mRNA的3’UTR的延伸序列特異性互補。然后再構(gòu)建miRNA靶點—螢光素酶指示劑載體(PGL3—靶DNA)以目標mRNA的3’UTR為模板通過PCR技術(shù)合成能與miRNA結(jié)合的寡核苷酸序列，并參照Promega公司螢光素酶檢測系統(tǒng)產(chǎn)品說明書(原英文技術(shù)手冊號碼TB281)中載體的構(gòu)建方法將合成的目標寡核苷酸序列插入到下游螢光素酶基因(采用HindIII和SpeI雙酶切)的多克隆位點上。再將10nM擬miRNA序列miR-HCN2轉(zhuǎn)導(dǎo)入美國標準菌庫(ATCC，Manassas，VA)H9c2細胞(大鼠心室肌細胞株)，再將1μg PGL3—靶DNA以及0.1μg PRL-TK(胸苷激酶驅(qū)動的Renilla螢光素酶表達載體)用lipofectamine 2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染入H9c2細胞，在轉(zhuǎn)染的48小時內(nèi)用雙重的螢光素酶指示劑測定試劑盒(Promega)在發(fā)光測量計上(Lumat LB9507)測量螢光素酶的活性(雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)歸一反應(yīng))。
本實施方式中細胞都是在無血清的培養(yǎng)液中饑餓24小時后進行轉(zhuǎn)染。本實施方式每組數(shù)據(jù)通過均數(shù)±標準誤表示，采用非配對student t-檢驗進行統(tǒng)計，雙尾p＜0.05認為有明顯統(tǒng)計學意義，在GraphPad Prism中用非線性最小二乘法進行曲線擬合。
本實施方式中用10nM miR-HCN2處理過的大鼠細胞其HCN2表達水平發(fā)生變化，內(nèi)源的HCN2蛋白下調(diào)約75％。采用與本實施方式相同的方法觀察到針對HCN4的擬miRNA序列miR-HCN4(miR-HCN4基因序列如圖2所示)同樣能夠抑制HCN4的蛋白表達，約抑制70％。經(jīng)檢測H9c2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄HCN2和HCN4的mRNA水平分別如圖3和圖4所示，證實了模擬miRNA的作用實符合天然miRNAs的作用規(guī)律。
miR-HCN2/miR-HCN4的功能關(guān)聯(lián)為了明確miR-HCN2/miR-HCN4能夠干擾HCN2和HCN4的表達，本實施方式評價這些因子對起搏電流(If)、心肌細胞收縮頻率產(chǎn)生的影響。首先將這些因子轉(zhuǎn)染進入乳鼠細胞，以全細胞膜片鉗記錄If電流，所有檢測電位下，相對于陰性對照組，轉(zhuǎn)染了miR-HCN2/miR-HCN4的細胞其If電流明顯降低，在-120mV時miR-HCN2(10nM)與miR-HCN4(10nM)分別降低If電流約66％和41％。乳鼠心肌細胞在培養(yǎng)皿中原代培養(yǎng)時保持原有特性，當轉(zhuǎn)入包被有層粘連蛋白的培養(yǎng)皿中時，基礎(chǔ)收縮同步頻率明顯穩(wěn)定，為59±7次/分鐘。測定收縮率前用TFO-HCN4，miR-HCN2/miR-HCN4孵育細胞48小時(不加脂質(zhì)體)，單層細胞收縮頻率被miR-HCN2及miR-HCN4不同程度抑制，同時應(yīng)用miR-HCN2及miR-HCN4會增加抑制程度，實驗數(shù)據(jù)與蛋白表達及熒光強度的結(jié)果相符。
權(quán)利要求
1.擬miRNA序列，其特征在于擬miRNA序列為22nt，序列5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與目標mRNA的3’UTR的延伸序列特異性互補。
2.如權(quán)利要求1所述擬miRNA序列的制備方法，其特征在于擬miRNA序列按以下步驟制備(一)測定目標mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根據(jù)延伸序列特異性設(shè)計含有22nt的擬miRNA序列，其中擬miRNA序列5’末端有1～8個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補，即得到擬miRNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擬miRNA序列的制備方法，其特征在于步驟(二)中擬miRNA序列5’末端有2～7個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擬miRNA序列的制備方法，其特征在于步驟(二)中擬miRNA序列5’末端有3～6個核苷酸、3’末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補。
全文摘要
擬miRNA序列及其制備方法，它涉及一種RNA序列及其制備方法。它解決了miRNA缺乏基因特異性的缺陷。擬miRNA序列為22nt，序列5′末端有1～8個核苷酸、3′末端有7個核苷酸與目標mRNA的3′UTR的延伸序列特異性互補。擬miRNA序列按以下步驟制備(一)測定目標mRNA的3′UTR的延伸序列；(二)根據(jù)延伸序列特異性設(shè)計含有22nt的擬miRNA序列，其中擬miRNA序列5′末端有1～8個核苷酸、3′末端有7個核苷酸與延伸序列特異性互補，即得到擬miRNA序列。本發(fā)明提供的擬miRNA序列因具有基因特異性，為研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，可廣泛應(yīng)用于疾病的基因診斷與治療，并擴展應(yīng)用于生物學領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/113GK101054580SQ20071007200
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月6日
發(fā)明者王志國, 楊寶峰, 呂延杰, 張勇 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學, 王志國