專利名稱：密碼子優化的輪狀病毒蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域。具體而言，本發明涉及密碼子優化的輪狀病毒VP6或VP7蛋白的編碼核苷酸序列、含有該序列的重組載體以及 宿車細胞。本發明還涉及通過輪狀病毒結構蛋白基因密碼子的優化提高 蛋白表達量的方法及其在免疫學上的用途。
背景技術：
輪狀病毒A組輪狀病毒(Rotavirus， RV)是引起全世界嬰幼兒嚴重腹瀉的最重 要病原(參見Parashar， U. D., Bresee， J.S., Gentsch, J. R. & Glass, R. I. Rotavirus./"/e". Z)&. 1998， 4: 561-570)。在發展中國家，每年 約600,000至870，000兒童死于輪狀病毒感染。鑒于輪狀病毒危害嚴重且 無有效治療手段，世界衛生組織將發展輪狀病毒疫苗列為最優先發展的 疫苗項目之一。RV屬呼腸病毒科(i Wn'^^)的RV屬，因其在電鏡下 形態酷似車輪而得名("rota"來源于拉丁文，意為"車輪")。1973年， Bishop等首次從腹瀉兒童小腸上皮細胞中分離到人RV (參見Bishop RF, Davidson GP， Holmes IH, Ruck BJ. Virus particles in epithelial cells of duodenal mucosa from children with acute non-bacterial gastroenteritis. Lancet, 1973， 2: 1281-1283)。此后，RV被認為是全世界嬰幼兒嚴重 脫水腹瀉的主要病因。根據RV基因組雙鏈RNA (double stranded RNA, dsRNA)電泳型和 血清學反應的不同，可將RV分為7個組(A G組)，其中A、 B、 C3 個組既可感染人類也可感染動物，D、 E、 F、 G 4個組迄今為止只在動 物中發現。A組RV能引起嬰幼兒嚴重腹瀉已經得到公認，2002年Banyai, K等報道在匈牙利Gl型A組RV也能感染成年人，引起腹灣暴發(參 見Banyai， K. et al. Outbreak of human rotavirus infection in an adult community. Orv. Hetil. 2002, 143: 1347-1352) 。 B組RV主要在中國引.起成人腹瀉的大流行(參見Hung, T. et al. Waterbome outbreak of rotavirus diarrhoea in adults in China caused by a novel rotavirus. Lancet 1, 1983， 1139-1142)，而C組RV則主要引起散發。根據RV外殼蛋白VP4和VP7的特性，可將A組RV可分為不同 的血清型。VP7是糖蛋白，所以VP7的分型又稱為G型，到目前為止， 已發現了 14個G型。其中最常見的感染嬰幼兒的RV為G1 G4型。VP4 對蛋白水解酶敏感，因此VP4的分型又稱為P型，VP4蛋白的血清型 分型系統獨立于VP7 (G)血清型，不同G血清型的毒株可屬于同一P 血清型，而一些相同的G血清型的毒株又可屬于不同的P血清型(參 見Hoshino,Y. & Kapikian, A. Z. Rotavirus antigens. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994， 185: 179-227; Hoshino, Y. & Kapikian， A. Z. Rotavirus vaccine development for the prevention of severe diarrhea in infants and young children. Trends Microbiol. 1994， 2: 242-249.; Kapikian， A. Z. Overview of viral gastroenteritis. Arch. Virol. 1996， Suppl 12: 7-19 )。 目前我國流行的輪狀病毒主要以G3， Gl， G2血清型為主，P血清型以 P[8]多見(參見方肇寅.我國輪狀病毒腹瀉----流行病學和疾病負擔估計. 第二屆輪狀病毒疫苗研討會2005)。輪狀病毒為分節段dsRNA病毒，無包膜，由外層、中間層和內部核 心層3層組成二十面體蛋白衣殼，直徑約70 75nm，基因組由ll個dsRNA 節段組成，分別編碼病毒的6個結構蛋白和5個非結構蛋白。其中，VP7 蛋白是輪狀病毒的主要的中和抗原，是位于病毒外層上的一種糖蛋白， VP7蛋白基因全長1062個核苷酸，編碼297個氨基酸，對于輪狀病毒的分 型和抗體的產生有重要的作用。VP6蛋白是位于中間層的主要的蛋白， 是輪狀病毒的組特異性抗原，基因全長1356個核苷酸，編碼397個氨基 酸，在輪狀病毒的檢測和抗體的產生中都有重要的作用(參見金奇.醫 學分子病毒學，科學出版社，2001)。在生物界，不同種類生物對同義密碼子的使用頻率是不同的，優勢 密碼子與基因表達水平呈正相關(參見Ikemura T and Ozeki H. Codon usage and transfer RNA contents: organism-specific codon-choice patterns in reference to the isoaccepor contents. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1983, 47 Pt2: pl087-97; Bemardi G, et al. Codon usage and genomecomposition. JMolEvoU985，22(4):363-365)。分析表明，野生型輪狀病 毒蛋白基因密碼子與真核細胞密碼子使用頻率存在差異，AT含量明顯偏高，某些氨基酸的同義密碼子在真核細胞中使用頻率很低，而在輪狀病 毒中使用頻率很高。所以，用哺乳動物細胞等表達未經密碼子優化的VP7 和VP6蛋白時，蛋白的表達量很低，這在我室的前期工作中已經得到了 證明(參見姜秀麗.表達人輪狀病毒VP7基因重組腺病毒的免疫效果 研究.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所博士論文.2003)。這將 阻礙其作為疫苗的應用，因為如果想要達到比較好的免疫效果，對于載 體疫苗就要加大載體病毒的用量，而輪狀病毒疫苗的應用人群為5歲以 下的兒童，無疑會增加應用的危險性。為了提高其安全性，提高蛋白的 表達量，減少載體病毒的用量是非常必要的。 密碼子優化生物的遺傳密碼采用61組三連核苷酸(密碼子)編碼20種氨基酸， 并采用3個密碼子終止蛋白質的翻譯。這20種氨基酸中，除了蛋氨酸 (Met)和色氨酸(Trp)由一個密碼子編碼以外，其它氨基酸都由一個 以上的同義密碼子編碼，這種一種氨基酸對應多個密碼子的性質，稱為 "密碼子的簡并性"。密碼子的簡并性使得同一種蛋白可以采用多種不同 的核苷酸序列編碼。然而，同義密碼子的使用是存在偏性的，對于兩種 不同的生物，或者同一種生物的高表達和低表達基因，甚至在同一個操 縱子內部，不同密碼子的使用頻率可能差別很大(參見Gouy，M.and Gautier, C. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity. Nucleic Acids Res, 1982， 10(22): 7055-7074)。迄今為止，科學家仍在 思索是什么進化壓力導致了密碼子使用偏性。 一些研究者認為，每種生 物體內同義密碼子之間的突變-選擇平衡可以部分解釋基因組GC含量對 密碼子分布的影響及密碼子使用形式的改變(參見Knight, R.D. et al. A simple model based on mutation and selection explains trends in codon and amino-acid usage and GC composition within and across genomes. Genome Biol, 2001， 2(4),RESEARCH0010.Epub2001Mar0022)。而另一些研 究者認為，密碼子的偏性可以減少tRNA的多樣性，從而降低新陳代謝 負荷，有利于生物在快速生長條件下節約部分能量(參見Andersson， GE. and Kurland, C.G. An extreme codon preference strategy: codonreassignment Mol Biol Evol， 1991， 8 (4): 530-544)。不論是什么原因 導致了密碼子的偏性，已經日益清楚的是密碼子的偏性對異源蛋白質的 表達存在深遠的影響(Kane， J.F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol， 1995， 6 (5), 494-500)。通常，如果一個基因包含越多宿主 細胞罕用的密碼子，就越不可能獲得高水平的異源表達。如果稀有密碼 子出現在或連續出現在基因讀碼框的5'端，則會導致蛋白表達水平的急 劇下降。因此，在異源的宿主細胞中提高目的基因表達量常用的一個策 略就是改變目的基因的稀有密碼子，在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列 的基礎上，使之更接近于宿主細胞的密碼子使用方式，這種旨在提高目 的基因異源表達量的方法就稱為密碼子優化。應用密碼子優化技術，可以使目的基因的異源表達量得到大幅度的 提高。現今應用最為廣泛的是利用大腸埃希桿菌細胞(￡. co//)表達哺 乳動物蛋白。據統計，在￡."http://中表達哺乳動物蛋白時，由密碼子優化 帶來的表達量增加通常在5 15倍之間，占￡. co"中可溶蛋白的5。/。(參 見Claes Gustafsson, et al. Codon Bias and Heterologous Protein Expression. TRENDS in Biotechnology, 2004, 22(7): 346-353)。另外，密 碼子優化還有一個成功的范例就是提高病毒基因在哺乳動物細胞系中 的表達，這種基因優化的方式一般通過重新合成基因實現。病毒是一種 非常特殊的例子，它們的密碼子受到完全不同的進化壓力約束，所以它 們經常通過重疊的讀碼框來負載高密度的信息，而且很多病毒基因還在 編碼序列內部編碼順式調控序列。因此，需要在哺乳動物細胞系中表達 病毒蛋白時，可以按照宿主密碼子偏性重新合成基因，同時破壞病毒基 因內部的調控元件，從而使目的蛋白產量得以提高(參見Graf, M. et al. Concerted action of multiple cisacting sequences is required for Rev dependence of late human immunodeficiency virus type 1 gene expression. J Virol， 2000， 74(22): 10822-10826)。然而通過密碼子優化，尤其是通過對病毒基因的優化來達到提高基 因異源表達量的方法仍然存在諸多不確定的因素，并不是使用某一特定 宿主體系喜用密碼子就可以實現目的基因的高水平表達。重新設計一個基因序列在具體的操作過程中需要考慮多方面的問題。在不考慮其他限制條件的情況下，編碼同一個蛋白質的核苷酸序列可能有很多種。假設
每個氨基酸平均可以被3個不同的密碼子編碼，則一個由100個氨基酸 組成的蛋白，大約能夠被3， (~5xl047)個核苷酸序列編碼產生。這些 可能的序列中有哪些可以帶來高水平的異源蛋白表達，又如何將這些序 列挑選出來是一個繁復的過程。現今優化密碼子的方式是將每個氨基酸 對應使用的一個密碼子更換為被宿主細胞最頻繁使用的那個同義密碼 子。這種"一個氨基酸一一一個密碼子"的優化方法有幾個缺點。首先， 相對于一個tRNA庫而言，由這種基因轉錄產生的大量mRNA將會產生 一個高的密碼子濃度，從而導致tRNA庫失去平衡，并造成密碼子使用 方式的傾斜以及潛在的翻譯錯誤(參見Kurland， C. and Gallant, J. Errors of eterologous protein expression. Curr Opin Biotechnol. 1996， 7 (5), 489-493)。異源表達的蛋白可能占總細胞質量的60%，因此采用單一的 tRNA庫將是一個非常嚴重的問題。有研究發現，在"一個氨基酸——一 個密碼子"優化的基因中引入同義突變可以提高蛋白質的表達水平(參 見Klasen, M. and Wabl, M. Silent point mutation in DsRed resulting in enhanced relative fluorescence intensity. BioTechniques， 2004， 36 (2): 236-237)。第二，在密碼子選擇上如果沒有機動性，則難以避免基因和 轉錄后的mJRNA中產生一些重復元件和二級結構，而抑制核糖體的通 過，導致翻譯過程的阻滯。另外重復元件的存在可能使基因合成的難度 增加。過多的重復元件的存在還會影響基因在宿主內的穩定性。第三， 優化的基因還經常需要在序列中引入或排除一些序列元件，如限制性內 切酶位點，以便于隨后的操作。由此可見， 一個成功的優化基因，不僅 需要消除不利的密碼子配對和極端GC含量、消除重復序列、避免不利 的mRNA二級結構、避免或引入限制性內切酶位點，還需要避免脆性剪 接位點、調控元件、免疫激活或免疫抑制元件(對DNA疫苗而言)、RNA 甲基化信號和許多其它與所使用宿主系統相關的特殊因素，才能達到最 終提高異源表達量的目的。

發明內容
本發明一方面提供了一種DNA分子，其中含有密碼子優化的編碼Gl 型輪狀病毒VP7蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實施方案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:2。
本發明另一方面提供了一種重組載體，其中含有密碼子優化的編碼' G1型輪狀病毒VP7蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在 具體實施方案中，所述密碼子優化的核苷酸序列為SEQIDNO:2。該重 組載體可為病毒、細菌或質粒載體，優選腺病毒載體或桿狀病毒載體。 在一個優選的實施方案中，腺病毒載體為rvAdGlVP7(opt) (opt指優化 后的基因)。在另一個優選的實施方案中，所述桿狀病毒載體為 rvBacGlVP7(opt)。
本發明另一方面還提供了一種宿主細胞，其中含有本發明的重組載 體。該宿主細胞可為原核細胞或者真核細胞。在一個優選的實施方案中， 該宿主細胞為草地貪夜蛾細胞(如Sf9細胞)或293細胞。
本發明另一方面還提供了一種提高G1型輪狀病毒VP7蛋白或者其 免疫原性部分的表達量的方法，該方法包括在適合表達的條件下培養本 發明的宿主細胞并獲得G1型輪狀病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。
本發明另一方面還提供了本發明的密碼子優化的G1型輪狀病毒 VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。
本發明還提供了 一種DNA分子，其中含有密碼子優化的編碼G2型輪 狀病毒VP7蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實 施方案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:4。
本發明另 一方面提供了 一種重組載體，其中含有密碼子優化的編碼 G2型輪狀病毒VP7蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在 具體實施方案中，所述密碼子優化的核苷酸序列為SEQIDNO:4。該重 組載體可為病毒、細菌或質粒載體，優選腺病毒載體或桿狀病毒載體。 在一個優選的實施方案中，腺病毒載體為rvAdG2VP7(opt)。在另一個優 選的實施方案中，所述桿狀病毒載體為rvBacG2VP7(opt)。
本發明另一方面還提供了一種宿主細胞，其中含有本發明的重組載 體。該宿主細胞可為原核細胞或者真核細胞。在一個優選的實施方案中， 該宿主細胞為草地貪夜蛾細胞(如Sf9細胞)或293細胞。
本發明另一方面還提供了一種提高G2型輪狀病毒VP7蛋白或者其 免疫原性部分的表達量的方法，該方法包括在適合表達的條件下培養本 發明的宿主細胞并獲得G2型輪狀病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。本發明另一方面還提供了本發明的密碼子優化的G2型輪狀病毒 VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。
本發明還提供了 一種DNA分子，其中含有密碼子優化的編碼G3型輪 狀病毒VP7蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實 施方案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:6。
本發明另一方面提供了一種重組載體，其中含有密碼子優化的編碼 G3型輪狀病毒VP7蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在 具體實施方案中，所述密碼子優化的核苷酸序列為SEQIDNO:6。該重 組載體可為病毒、細菌或質粒載體，優選腺病毒載體或桿狀病毒載體。 在一個優選的實施方案中，腺病毒載體為rvAdG3VP7(opt)。在另一個優 選的實施方案中，所述桿狀病毒載體為rvBacG3VP7(opt)。
本發明另一方面還提供了一種宿主細胞，其中含有本發明的重組載 體。該宿主細胞可為原核細胞或者真核細胞。在一個優選的實施方案中， 該宿主細胞為草地貪夜蛾細胞(如Sf9細胞)或293細胞。
本發明另一方面還提供了一種提高G3型輪狀病毒VP7蛋白或者其 免疫原性部分的表達量的方法，該方法包括在適合表達的條件下培養本 發明的宿主細胞并獲得G3型輪狀病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。
本發明另一方面還提供了本發明的密碼子優化的G3型輪狀病毒 VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。
本發明還提供了一種DNA分子，其中含有密碼子優化的編碼輪狀病 毒VP6蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實施方 案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:8。
本發明另一方面提供了一種重組載體，其中含有密碼子優化的編碼 輪狀病毒VP6蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體 實施方案中，所述密碼子優化的核苷酸序列為SEQIDNO:8。該重組載 體可為病毒、細菌或質粒載體，優選腺病毒載體或桿狀病毒載體。在一 個優選的實施方案中，腺病毒載體為rvAdVP6(opt)。在另一個優選的實 施方案中，所述桿狀病毒載體為rvBacVP6(opt)。
本發明另 一方面還提供了 一種宿主細胞，其中含有本發明的重組載 體。該宿主細胞可為原核細胞或者真核細胞。在一個優選的實施方案中， 該宿主細胞為草地貪夜蛾細胞(如Sf9細胞)或293細胞。
9本發明另一方面還提供了一種提高輪狀病毒VP6蛋白或者其免疫原
性部分的表達量的方法，該方法包括在適合表達的條件下培養本發明的
宿主細胞并獲得輪狀病毒VP6蛋白或者其免疫原性部分。
本發明另一方面還提供了本發明的密碼子優化的輪狀病毒VP6蛋白 或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。


現在，參照旨在說明而非限定本發明的優選的實施方案的附圖，對 本發明的各方面特征進行描述。
圖1 pShuttle-CI載體構建的酶切鑒定結果(Kpnl單酶切鑒定)。
1. DNA分子量標準；2.重組載體pShuttle-CI; 3陰性對照pShuttle; 圖2目的片段連接到載體pShuttle-CI上的酶切鑒定結果。
1. DNA分子量標準；2. pShuttle-CI/GlVP7(opt)(MluI， Sail); 3. pShuttle-CI/G2VP7(opt)(MM，SalI ); 4.pShuttle-CI/G3VP7(opt) (MluI，SalI); 5.pShuttle-CI(MM,SalI); 6. pShuttle-CI/VP6 (opt) (kpnl); 7.pShuttle-CI/VP6(opt)(XhoI，SalI); 8. DNA分子量標準 圖3重組腺病毒質粒的酶切鑒定。
1. DNA分子量標準；2. pShuttle-CI 3. pAdeasy-l/ GlVP7(opt) (Pac I); 4. pAdeasy-l/ G2VP7 (opt) (Pac I); 5. pAdeasy-l/ G3VP7(opt) (Pac I); 6. pAdeasy-1/ VP6(opt) (Pac I); 圖4輪狀病毒蛋白基因在293細胞內表達的Western blot分析。
A: 1.輪狀病毒SA11感染MA104細胞(陽性對照)；2.蛋白分子 量標準；3. rvAdGlVP7(opt) ; 4. rvAdG2VP7 (opt) ; 5. rvAdG3VP7(opt); 6. rvAdVP6(opt); 7. Ad5(空載體對照)；8. 293(空 細胞對照)；
B:肌動蛋白內參，加樣順序和量同A圖
圖5輪狀病毒蛋白基因在293細胞內表達量差異的Western blot分析。 A: rvAdG3VP7密碼子優化前后表達量的差異 第一排1.rvAdG3VP7優化基因；2. rvAdG3VP7原始基因 第二排肌動蛋白內參，加樣順序和量同上。 B: rvAdVP6密碼子優化前后表達量的差異第一排1.rvAdVP6優化基因；2. rvAdVP6原始基因 第二排肌動蛋白內參，加樣順序和量同上。
圖6提取BacmidDNA的PCR鑒定。
l.DNA分子量標準；2.pFBl/GlVP7(opt); 3. pFBl/G2VP7(opt); 4.
pFBl/G3VP7(opt); 5. pFBl/G3VP7; 6. J)NA+Hind111 marker; 7.
pFBl/G2VP6(opt); 8.DNA分子量標準； 圖7輪狀病毒蛋白基因在Sf9細胞內表達及表達量差異的Western blot 分析。
A: 1.空白Sf9細胞；2.輪狀病毒SA11感染的MA、104細胞)；3. rvBacGlW7(opt); 4. rvBacG2VP7(opt); 5. rvBacG3VP7(opt); 6. rvBacG3VP7; 7. rvBac VP6(opt);其中，3、 4、 5和7為密碼子優 化的基因，6為野生型基因 B:肌動蛋白內參，加樣順序和量同A圖
具體實施例方式
序列說明
SEQIDNO 1:G1型輪狀病毒VP7蛋白基因優化前序列。 SEQIDN0 2: Gl型輪狀病毒VP7蛋白基因優化后序列。 SEQIDNO 3: G2型輪狀病毒VP7蛋白基因優化前序列。 SEQ ID NO 4: G2型輪狀病毒VP7蛋白基因優化后序列。 SEQ ID NO 5: G3型輪狀病毒VP7蛋白基因優化前序列。 SEQ ID NO 6: G3型輪狀病毒VP7蛋白基因優化后序列。 SEQIDNO 7:輪狀病毒VP6蛋白基因優化前序列。 SEQIDNO 8:輪狀病毒VP6蛋白基因優化后序列。 密碼子優化
由于本發明的密碼子優化的基因序列將在來自于人的293細胞中表 達，因此，本發明依據人的優選密碼，首先選取人使用頻率最高的密碼
子(http:〃www.kazusa.or.ip/codon/cgi-bin/showcodon.cgi species=Homo+sapiens+『gbpril)，再根
據總體GC含量在50X 55X和同一密碼子連續不超過3個的原則，調整 所選密碼子，為次選密碼子。調整總體GC含量在50X 55X之間是因 為該含量范圍為哺乳動物細胞中DNA的常見GC含量。而同一密碼子連續不超過3個是為了提高RNA的利用率。然后用相關軟件分析起始端的 RNA的二級結構，防止發夾結構的出現。最后，再在起始端加上KOZAK序列，兩端加上下一步連接到載體上所需要的酶切位點，得到上述所列 優化序列。本發明所用優化密碼子Amino AcidCodonAmino AcidCodonAla(A)GCC/GCTAsn(N)AAC/AATCys(C)TGCPro(P)CCC/CCTAsp(D)GAC/GATGln(Q)CAG/CAAGlu(E)GAG/GAAArg(R)AGAPhe(F)TTCSer(S)AGC/TCCGly(G)GGC/GGAThr(T)ACC/ACAHis冊CACVal(V)GTG/GTCIte(I)ATC/ATTTrp(W)TGGLys(K)AAG/AAATyr(Y)TAC/TATLeu(L)CTG/CTCTGAMet(M)ATG應用在獲得了如前所述的密碼子優化基因的基礎上，將該基因克隆入合 適的載體即可得到有用的重組載體。在該重組載體中，含有本發明的密 碼子優化的核苷酸序列。具體而言，所述密碼子優化的核苷酸序列為SEQIDNO:2、 4、 6或8。該重組載體可為任何合適的載體，包括病毒、 細菌或質粒載體。其中，病毒載體可為桿狀病毒、腺病毒、皰疹病毒、 EB病毒、腺病毒伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、 流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦 病毒、登革病毒等病毒載體。質粒載體可以是復制型的，也可以是非復 制型的。在優選的實施方案中，載體為病毒載體，優選為腺病毒載體或 桿狀病毒載體。在一個優選的實施方案中，所述重組載體為重組腺病毒載體rvAd GlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)。在另一個優選的實施方案中，所述所述重組載體為桿狀病毒載體 rvBacGlVP7(opt)、 rvBacG2VP7(opt)、 rvBacG3VP7(opt)、 rvBacVP6(opt)。將本發明的前述重組載體通過合適的方法引入細胞宿主，即可獲《尋 一種新的宿主細胞，其中含有本發明的重組載體。該宿主細胞可為原核細胞或者真核細胞。所述原核細胞可以是細菌，例如大腸桿菌等。所述真核細胞可以是畢赤酵母等酵母類細胞、Sf9或Sf21細胞等昆蟲細胞、293細胞或中國倉鼠卵巢細胞等哺乳動物細胞系等等。在一個優選的實施方案中，該宿主細胞為草地貪夜蛾細胞Sf9或293細胞。在適合表達的條件下培養本發明的宿主細胞就可以獲得本發明的 輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。由于本發明的宿主細胞中，含有經過優化的核苷酸序列，因此，相對于使用含有相應天然 序列的同樣宿主細胞的情形時，使用本發明的宿主細胞時輪狀病毒VP7 或VP6蛋白或者其免疫原性部分的表達量更高。因此，本發明提供了提 高輪狀病毒VP7或VP6蛋白表達量的方法。適合表達的條件可以根據所使用的宿主細胞確定。宿主細胞生長和 進行蛋白表達的條件有可能不同。使用原核宿主細胞表達外源蛋白基因時，這些重組肽或蛋白經常需 要進一步的修飾。它們常常會失去進行折疊的能力，不能形成二硫鍵。 還可能在細菌內源性蛋白酶的作用下表現出不穩定性，并且容易聚集成 無活性的復合體。因此，與天然的蛋白相比，重組肽或蛋白常常產量較 低，抗原性或免疫原性也降低。而使用真核宿主細胞進行表達時，由于 真核細胞具有翻譯后的加工修飾體系,表達的外源蛋白更接近于天然蛋 白質。因此，在本發明中，使用真核宿主細胞表達輪狀病毒VP7蛋白或 VP6蛋白或者其免疫原性部分。本發明的密碼子優化的輪狀病毒VP7或VP6蛋白或者其免疫原性部 分的編碼核苷酸序列的重組體可以作為疫苗使用。通過注射、口服、滴 鼻或者噴霧等方式對宿主進行免疫。由于載體本身就具有良好的免疫刺 激作用，因此，本發明的密碼子優化的核苷酸序列的重組體作為疫苗時 可以不使用免疫佐劑。根據使用的具體情形，也可以添加合適的佐劑， 以增強免疫應答。本領域的常規佐劑均可以使用，可以由本領域技術人 員根據需要決定添加的量。并且，由于病毒載體疫苗不僅可以直接激發 機體的免疫應答，而且，可以通過在機體內持續進行表達，不斷產生蛋 白或者免疫原性部分，從而進一步引發機體的多種免疫應答。為了更為清楚地說明本發明，下面結合優選實施例進一步闡述本發明。應理解的是，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的 范圍。下列實施例中未注明具體的實驗方法，通常按照常規條件和方法，如分子克隆實驗室手冊(Sambrook, et al. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。實施例1輪狀病毒基因的密碼子優化及在哺乳動物細胞中表達量的提筒本實施例的內容是將輪狀病毒基因進行密碼子優化設計，人工合 成優化后的基因并以腺病毒為載體，在293細胞中表達密碼子優化后 的G1、 G2、 G3型VP7蛋白基因和VP6蛋白基因，并將其表達量與野 生型蛋白基因的表達量相比較，對密碼子優化的效果進行評價。具體 步驟如下1. 四種輪狀病毒蛋白基因密碼子的優化按人類偏愛密碼子(參見 http:〃www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi species=Homo+sapie ns+[gbpri])進行人工設計，委托上海生工生物工程公司合成了我國當前 流行的輪狀病毒Gl、 G2、 G3型外殼蛋白VP7的優化基因和內殼蛋白 VP6的優化基因，其序列分別見SEQIDNO:2、 4、 6或8。為了清楚地 顯示所做的修改，同時列出了未經優化的原始序列。優化后的序列G+C 含量50~55%，被克隆于pUC57 (上海生工公司)載體上，分別命名為 pUC57/GlVP7 (opt)、 pUC57/G2VP7 (opt)、 pUC57/G3VP7 (opt)、 pUC57/VP6 (opt)，所有合成基因經大連寶生物公司和上海博亞生物技 術公司測序確證正確后，用于蛋白的表達。2. 重組穿梭載體的構建(1)穿梭載體pShuttle-CI的構建將pCI載體(美國Promrga公司)用限制性內切酶BglII單酶切后 用Klenow酶(Prome公司)補平，用Bamffl酶切；同時將pShuttle載 體用Notl酶切，同樣方法補平后，再用BglII酶切。利用Bamffl和BglII 酶切片段末端相互粘合的特點， 一平一粘連接兩個酶切片段，即將pCI 載體上的約1400bp的片段插入pShuttle載體，此時pShuttle載體上原有 的酶切位點殘余一個KpnI。用KpnI酶切鑒定(有1100 bp的片段為連接正確的重組載體pShuttle-CI)(圖1 )。載體pShuttle-CI總長7900bp左 右，多克隆位點中可用的酶有Nhel、 Xhol、 Mlul、 Xbal、 Sail和Notl。 (2)將密碼子優化的蛋白基因克隆入穿梭載體pShuttle-CI用限制性內切酶Sal I和Mlu I雙酶切穿梭質粒pShuttle-CI,體系為 pShuttle-CI 10pg， Sal I和Mlu I各2^1， lOx緩沖液5(il， H20 21^1。置37°C 孵育2h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天為時代公司)回收7900bp的載 體片段，并用稀釋電泳法粗略定量。用Sal I和Mlu I雙酶切含有密碼子優化基因的質粒 pUC57/GlVP7(opt)、 pUC57/G2VP7(opt)、 pUC57/G3VP7(opt)和pUC57/ VP6(opt)，反應體系為質粒10pg， Sal I和Mlu I.各2^1， 10x緩沖液5pl， H20 1^1。置37。C孵育2h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天為時代公司) 回收目的片段并對其定量。將上述載體片段pShuttle-CI分別與目的基因GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)和VP6(opt)片段進行連接反應，反應體系為 載體片段pShuttle-CI l昭，目的片段GlVP7(opt)、 G2VP7(叩t)、 G3VP7(opt)、 VP6(opt)各5嗎，連接緩沖液2|il; T4 DNA連接酶(TAKARA 公司產品)lpl;H20 7.6pl。置16""C反應16h。取10|il連接產物轉化五.co// DH10B感受態細胞。挑取卡那霉素(K+)抗性克隆，用含卡那霉素的LB 培養液培養12 16h后，以堿裂解法小量制備質粒，用Sal I和MM雙 酶切鑒定，得到重組穿梭質粒pShuttle-CI/GlVP7(opt)、 pShuttle-CI/G2VP7(opt)、 pShuttle-CI/G3VP7(opt)和pShuttle誦CI/VP6(opt)(圖2)。 3.重組臁病毒的獲得分別取上述四種克隆有外源基因的重組腺病毒穿梭質粒 pShuttle-CI/Gl VP7(opt)、 pShuttle-CI/G2VP7(opt)、 pShuttle-CI/G3 W7(opt) 和pShuttle-Cl，6(opt)各約500ng，用Pme I (美國New England Biolabs 公司)單酶切以線性化質粒，用無水乙醇沉淀后，溶于6|nl ddH20中備用。用線性化的重組穿梭質粒與約100ngpAdEasy-l腺病毒骨架質粒(美 國Stratagen公司)共同電轉化五co// BJS183(美國Stratagen公司)感受態 細胞(參見He TC， Zhou S， da Costa L, Yu〗，Kinzler KW, Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad.Sci. USA， 1998， 95: 2509-14)，取細菌懸液涂于含50jig/ml卡那霉素的 LB培養板中，于37"C培養16~20h，挑選10~20個較小的菌落，接種于 3ml含有卡那霉素(25嗎/ml)的SOC培養液(美國Invitrogen公司.)內， 置37。C振搖培養12 16h，用堿裂解法小量提取質粒DNA，獲得了重組 腺病毒質粒 pAdEasyGlVP7(opt) 、 pAdEasyG2VP7(opt)、 pAdEasyG3VP7(opt)和pAdEasyVP6(opt)，用0.7°/。瓊脂糖凝膠進行電泳 遷移率分析后，用pac I (美國New England Biolabs公司)酶切進一步鑒 定，可產生4.5Kb或3Kb左右的片段。將所得的重組腺病毒質粒轉化以 氯化鈣法制備的宿主菌五.co/ZDH10B (recAl， endAl)(美國Invitrogen 公司)感受態細胞，在此宿主菌中可產生高拷貝數的質粒，挑取目的克 隆，經PacI酶切鑒定(圖3)后，置-7(TC保存備用。用QIAGEN Plasmid Midi Kit (德國Qiagen公司)提取重組腺病毒 質粒，用PacI酶切后，無水乙醇沉淀回收目的DNA片段，溶于無菌 去離子水中。在轉染前24h將293細胞(美國Invitrogen公司)接種于T-12.5 細胞培養瓶(美國BD公司)中，轉染時細胞的豐度為50。/。 70。/。。將PacI 酶切線性化后的10嗎重組腺病毒DNA及3^1的Lipofectamine 2000(美 國Invitrogen公司)分別與100plM液(無抗生素、無血清的含有谷氨 酰胺及NaHC03的DMEM培養液(美國Invitrogen公司))充分混勻， 置室溫孵育15min后，混合兩種懸液室溫繼續作用30min。在上述等待 的時間里，移去293細胞的原培養液，用2ml M液洗細胞2次。補加 800^1 M液至Lipofectamine2000-DNA的復合物中，輕輕混勻后加至洗 滌過的293細胞上，置37。C， 5。/。C02孵育5h，移去含DNA/脂質體復 合物的培養液，補加含10%新生牛血清(美國Hyclone公司)的DMEM完 全培養液，繼續培養，第二天換為含2。/。新生牛血清的DMEM維持液， 繼續培養。在轉染后6 7天，細胞出現腫脹、變圓等細胞病變(CPE)。 收集細胞與上清液一起-7(TC、 37。C反復凍融3次，取適量的凍融液接種 293細胞，用含2。/。新生牛血清的DMEM培養液于37。C、 5% (202培養 箱中培養，觀察細胞病變，按上述方法收病毒傳代一次。獲得的重組腺 病毒命名為rvAdGlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt) 、 rvAdG3VP7(opt)和 rvAdVP6(opt)。
分另U用 rvAdGlVP7(opt) 、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)感染293細胞，待細胞病變完全后，反復凍融3次，13,000rpm離心10min，取上清，磷鎢酸負染后在透射電子顯微鏡下觀察，可見呈二十面體結構、直徑約為70nm的病毒顆粒，具有典型的腺病毒形態。4.目的蛋白的表達鑒定及表達量的比較待293細胞生長至80% 90%豐度時，分別接種重組腺病毒rvAd GlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)，感染 后48h刮下病變的細胞，于fC、 5000rpm離心10min，收集細胞沉淀， 用PBS洗漆細胞3次，每次4。C、 5000rpm離心10min，將細胞沉淀用200nl 含蛋白酶抑帝!j齊!j (Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Cat. No. 11 873 580 001 ，美國Roche公司)的REPA裂解液(50mmol/LPH=8.0Tris-HCl， 150mmol/L NaCl， 0.1% SDS， 1%NP40， 0.5%脫氧膽酸鈉)冰上裂解lh，于4。C、 12，000rpm離心10min，將上清轉移至另一新的eppendor滑中，按說明書 所述的方法，用BCAtm Protein Assay Kit (Pierce公司)對提取的胞漿蛋 白進行定量，然后加入5xSDS-PAGE電泳緩沖液，IO(TC加熱變性后，取 100嗎總蛋白進行12% SDS-PAGE電泳。電泳結束后，轉印硝酸纖維素膜， 用5%脫脂奶室溫封閉2h后，用羊抗輪狀病毒多抗(Biodesign公司)1:1000 稀釋，室溫孵育2h，用含0.05。/。Tween-20的TBS緩沖液(TBST)洗滌5 6次 后，用辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG(中杉金橋公司)l:2000稀釋室 溫孵育2h。 TBST充分洗滌后，用SuperSignal⑧WestPico化學發光底物(Pierce公司)進行顯色。結果顯示，在44kD和34kD附近有特異性的條 帶出現(圖4),說明腺病毒攜帶的輪狀病毒衣殼蛋白基因在293細胞中 得到有效表達。用同一張膜重新5。/。脫脂奶室溫封閉2h后，再用兔抗肌動 蛋白抗體(中杉金橋公司)l:1000稀釋孵育2h，用TBST洗滌5 6次后， 用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG (中杉金橋公司)l:2000稀釋室溫孵 育lh。 TBST充分洗滌后，用SuperSigna膽WestPico化學發光底物(Pierce 公司)進行顯色，用以檢測上樣量是否一致。由于原始基因在腺病毒中 的表達量很低，無法用Westernblot檢測，因此，將優化基因和原始基因 的加樣量調整為約1:3 (70嗎200嗎)。G3VP7(opt)和野生型基因G3VP7 用同一張膜重新5。/。脫脂奶室溫封閉2h后，VP6(opt)和VP6用另一張膜， 其上樣量相同。再用抗肌動蛋白抗體孵育2h，用TBST洗漆5 6次后，用 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫孵育2h。 TBST充分洗滌后，用)和VP6(opt)的表達量均為相應野生型 基因G3VP7和VP6的表達量的10倍以上(圖5)。而優化基因G1VP7 (opt) 和G2VP7(opt)用Westem很容易檢測，而對應的野生型基因G1VP7和 G2VP7多次用Westem檢測，由于表達量太低，無法檢測到。這說明經過 密碼子優化的基因序列其表達量在哺乳動物細胞中可以顯著提高，由此 證明實驗設計是成功的。原始基因和優化基因Western檢測結果基因名稱原始基因結果優化基因結果優/原G1VP7檢測不到很容易檢測到G2VP7檢測不到可檢測到G3VP7可檢測到，很弱很容易檢測到>10VP6可檢測到，很弱很容易檢測到>10實施例2密碼優化的輪狀病毒基因在昆蟲細胞中表達量的提高為了證明按人類細胞偏愛密碼子優化的輪狀病毒結構蛋白基因其 表達量在昆蟲細胞中也可以提高，在本實施例中我們以桿狀病毒為載 體，分別表達了密碼子優化的輪狀病毒GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)、 VP6(opt)和野生型G3VP7蛋白基因，在昆蟲細胞Sf9中 檢測基因的表達及其表達量的差異。具體步驟如下 1.桿狀病毒表達載體的構建用EcoR I和Sal I (TAKARA公司)雙酶切桿狀病毒表達載體 pFastBac 1 (以下簡稱pFB 1,美國Invitrogen公司)，體系為pFB 1 10嗎 EcoR I和Sal I各2|il， lOx緩沖液5^1, H20 23pl。置37。C孵育3h，用 天為時代公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收載體片段，并用稀釋電泳法 粗略測定其含量。同時用EcoR I和Sal I雙酶切含有優化基因的質粒 pShuttle-CI/GlVP7(opt)、pShuttle-CI/G2VP7(opt)、pShuttle-CI/G3VP7(opt) 和pShuttle-CI/VP6(opt)。反應體系為質粒IO嗎，EcoR I和Sal I各2pJU 10x緩沖液5^d，H20 16|al。置37。C孵育3h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒 (天為時代公司)分別回收目的片段，并用稀釋電泳法粗略測定其含量。再用Hind III和Xhol I (TAKARA公司)雙酶切桿狀病毒表達載體 pFBl,體系為pFBl IO呢，EcoR I和Sal I各2|il， lOx緩沖液5|4 H20 31^il。 37°C孵育3h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天為時代公司)回收 載體片段，用稀釋電泳法粗略測定其含量。同時用Hind III和Xhol I雙酶切含有原始基因的質粒 pGEM(7zf+)/G3VP7。反應體系為質粒IO嗎，Hind III和Xhol I各2^1， 10x緩沖液5pJ， H20 16^1。置37。C孵育3h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天 為時代公司)分別回收目的片段，用稀釋電泳法粗略測定其含量。將上述線性化的載體pFBl分別與目的基因GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)和VP6(opt)及野生型G3VP7進行連接反應， 反應體系為載體pFBl l嗎、目的片段GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)、 VP6(opt)及野生型G3VP7各IO嗎，連接緩沖液2^1; T4 DNA連接酶(TAKARA公司)1^1;補H20至20|il， 16。C連接16h。取 10^1連接產物分別轉化E"/ZDH10B感受態細胞。挑取Amp抗性克隆， 用含Amp的LB培養液培養12 16h后，以堿裂解法小量制備質粒，用 EcoR I和Sal I分別對pFBl/GlVP7(opt) 、 pFBl/G2VP7(opt)、 pFBl/G3VP7(opt)和pFBl/VP6(opt)進行雙酶切鑒定，用EcoR I對 pFBl/G3VP7進行單酶切鑒定并用Hind III和Xhol I對pFBl/G3VP7進 行雙酶切鑒定，得到重組桿狀病毒表達載體pFBl/GlVP7(opt)、 pFBl/G2VP7(opt)、 pFBl/G3VP7(opt)、 pFBl/VP6(opt)和pFBl/G3VP7。 2.重組桿狀病毒表達載體的轉座反應(1) Luria Agar選擇性培養基的制備稱取40g Luria Agar(美國Invitrogen公司)固體培養基溶于1L超純 水，分裝至三角瓶中，10磅高壓20min，待冷卻至50。C左右，迅速加入 卡那霉素(美國Sigma公司)、慶大霉素(美國Sigma公司)、四環素(美 國Sigma公司)、Bluo-gal(美國Invitrogen公司)和ITPG(美國Invitrogen 公司)的貯存液，使其終濃度分別為50pg/ml、 7|ag/ml、 10|ig/ml、 100嗎/ml和鄉g/ml。(2) 轉座反應從-80 °C冰箱取出co/z' DH10Bac感受態細胞(美國Invitrogen公司) 置于冰上解凍，分別加入100ng重組表達載體質粒pFBl/GlVP7(opt)、pFBl/G2VP7(opt)、 pFBl/G3VP7(opt)、 pFBl/VP6(opt)、和pFBl/G3VP7， 輕彈eppendorf管，混勻，置冰浴30 min后于42。C熱休克90 sec，置于 冰浴穩定5 min。 加入900(al SOC培養液(美國Invitrogen公司)，置 37。C緩慢振搖4-6 h。分別取200^1菌液涂布Luria Agar選擇性培養平板， 37。C避光培養至少48h，觀察藍白斑生長情況。3. 重組Baemid DNA的分離從上述平板上分別挑取3~4個白色菌落，再分別在Lurk Agar平板 上劃線培養過夜，挑取仍為白色的單菌落，轉至3ml LB (卡那霉素 50pg/ml，慶大霉素7ng/ml，四環素10fig/ml)培養液中，于37'C振搖 培養24h。取1.0ml培養物，15000rpm瞬時離心收集菌體，加入0.3ml 溶液1[15麵ol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 10讓ol/LEDTA, 100 ng/ml RNase A (美國Sigma公司產品)]重懸菌體，加入0.3ml溶液II (0.2NNaOH， 1% SDS)混勻，室溫放置5min，加入0.3ml 3mol/L的乙酸鉀(pH5.5)，混 勻，置冰浴5 10min。 13,000 rpm離心10 min，取上清，加入0.8ml異 丙醇，混勻后，置冰浴5 10min， 13,000 rpm離心15min，沉淀用70% 乙醇洗滌，置室溫干燥，溶于50plTE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl， lmmol/L EDTA， pH8.0)中，進行PCR鑒定。PCR反應體系為重組 Bacmid質粒模板按1:25稀釋后取lpl ; M13正鏈引物[gttttcccagtcacgac]0.5(X1 ( TAKARA公司合成)；M13負鏈引物(caggaaacagctatgac) 0.5jil ( TAKARA公司合成)；La Tag PCR Buffer 2.5(il; dNTP (TAKARA公司)2^1; La Tag酶(TAKARA公司)0.5(^1; 補H20至25pl。設置PCR反應進程如下94.0。C5min后，進行如下30 個循環94.0。C45s; 55.0。C45s; 72.0°C 5min，然后72.0°C 10min;共 30個循環。PCR結束后，取5pl PCR產物行0.7n/。瓊脂糖電泳，結果發 現在2500bp和4000bp之間有很明亮的條帶，說明目的片斷成功插入了(圖6)。4. 重組桿狀病毒的獲得昆蟲細胞Sf9的培養液為含10%胎牛血清(杭州四季青公司)和RS. (青霉素100U/ml，鏈霉素lOOpg/ml,華北制藥廠)的Grace培養基(美 國Invitrogen公司)。在轉染前24h，將細胞傳至T12.5細胞培養瓶(美 國BD公司)中，待細胞長至約30~40%豐度時進行轉染。轉染時準備下列溶液溶液A: 2嗎重組Bacmid DNA與95|il無血清無抗生素的 Grace培養基混合，溶液B: 10|il Celifectin 轉染試劑(美國Invitrogen 公司)與90pl無血清、無抗生素的Grace培養基(美國Invitrogen公司) 混合；將上述溶液A與溶液B混合，輕彈管壁混勻，窒溫孵育30min。 在等待的時間內，用2ml無血清無抗生素的Grace培養基洗細胞2次， 每瓶加入2ml無血清、無抗生素的Grace培養基，在轉染混合物孵育結 束后，將轉染復合物逐滴加入細胞中。置27'C孵育5h后，去除轉染液， 換為含10%胎牛血清的細胞培養液繼續于27-C培養過夜。次日換為含 2%胎牛血清的維持液，置27。C培養。轉染48h后，Sf9細胞出現CPE 后，收獲轉染上清，分裝至無菌凍存管中，此即為含重組病毒的原代毒 種，置4"C或-80'C保存。將此病毒感染Sf9細胞進行擴增傳代。電鏡下 可見典型的桿狀病毒形態。 5.目的蛋白的表達鑒定及表達量的比較待Sf9細胞生長至30X 40X豐度時，分別接種等量(MOI=5)重組 桿狀病毒rvBacGlVP7(opt) 、 rvBacG2VP7(opt)、 rvBacG3VP7(opt)、 rvBacVP6(opt)和rvBacG3VP7 。感染48h后用細胞刮子刮下病變的Sf9細 胞，用PBS洗滌后，將細胞沉淀用200nl含蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Cat No. 11 873 580 001，美國Roche公司)的RIPA裂解 液(50mmol/LTris-HCl， 150mmol/LNaCl， 0.1% SDS, 1%NP40， 0.5% 脫氧膽酸鈉)置冰上裂解lh,于4"C 12,000 rpm離心10min，將上清轉移 至另一新的eppendor滑中，按照說明書所述的方法，用BCA Protein Assay Kit(Pierce公司)對提取的胞漿蛋白進行定量后，加入5xSDS-PAGE 電泳緩沖液，煮沸5min后，取100嗎總蛋白行12。/。SDS-PAGE電泳。電 泳結束后，轉印硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶室溫封閉211后，加入羊抗輪 狀病毒蛋白抗體(Biodesign公司)1:1000稀釋于4。C孵育過夜。用含 0.05。/oTween-20的TBS緩沖液(TBST)洗滌5 6次后，用辣根過氧化物酶 標記的兔抗羊IgG (中杉金橋公司)l:2000稀釋于室溫孵育2h。經TBST 充分洗滌后，用SuperSigna跑WestPico化學發光底物(Pierce公司)進 行顯色。結果顯示，在44kD和34kD附近有濃集的特異性條帶出現(圖7)， 說明桿狀病毒攜帶的輪狀病毒衣殼蛋白基因在昆蟲細胞中得到高效表 達。用同一張膜重新5Q/。脫脂奶室溫封閉2h后，再用兔抗肌動蛋白(actin)抗體(中杉金橋公司)l:1000稀釋孵育2h，用TBST洗滌5 6次后，用辣 根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG(中杉金橋公司)l:2000稀釋室溫孵育2h。 經TBST充分洗滌后，用SuperSignal⑧WestPico化學發光底物(Pierce公 司)進行顯色。所有樣品肌動蛋白的蛋白條帶粗細基本一致，說明上樣 量的一致。重復3次實驗，分別用TotalLab軟件進行半定量掃描，結果顯 示密碼子優化基因G3VP7(opt)的表達量明顯高于野生型基因(G3VP7)， 是后者表達量的5 10倍。這說明密碼子經過優化的基因序列在昆蟲細胞 中也可以顯著提高表達量，說明實驗設計是成功的。〈110>王健偉<120>密碼子優化的輪狀病毒蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應用<130> CP扁0594BC< 8<170> Patentln version 3.3<210〉 1<211> 894<212〉 DNA<213> 人(Homo sapiens)〈400> 1atggactacaatttttgttaatttctgtagcattatttgccttaactaaa60gctcagaactatggacttaatataccaa/taacaggatcaatggatactgtatactccaat120tctactcaagaaggagtatttctaacatccacattatgtttgtattatccaactg膽gca180agtaatcaaatcagtgatggtg幼tggaa汪gactcattatcgcaaatgtttcttacaaaa240ggttggccaacaggatcagtctattttaaagagtactcaaatattgttgatttttccgtt300gatcceicaatttataacttagtactaatgaagtatgatcaaaatcttgaa360ttagatatgtcagaattagctgatttgatattgaatgaatggttatgtaatccaatggat420attattaccaacaatcgggagaatcaaataagtggatatcaatgggatca480tcgtgtactgtgaaagtgtgtccactgaatacacaaacgttgggaataggttgtcaaaca540acgaatgtagactcatttgaaacagttgctgagaatgaaaeiatteLgctgLtagtggatgtc600gttgatgggaaataaatttgacaactacgacatgtactattcgaaattgt660aagaagttaggtccaagagagaatgtagctgt汪atacaagttggtggctctaatatatta720gacataacagcggatccaacgactaatccacaaattgagagaatgatgagagtgaattgg780aaaagatggtggcaagta/tttt"actettattaatcagattgtacaggtt840atgtccaaaagatcaagatcattaaattctgctgcgttttattatagagtatag894<210> 2 <211〉 894 〈212> MA <213〉人工序列<400〉 2 atggactaca 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3atggactacataatttttagatttttactactcatcgctctgatgtcaccatttgtgagg60acgcaaaa/ttacggcatgtattt汪ccaataaegggatcactagacgatgtatacacaaat120tcaactagtggagaatcatttctaacttcaacgctatgtttatattatccaacagaagct180aaaaatgagatttcagataatgaatgggaaaatactctatcacaattatttttaactaaa240ggatggccgactgggtcagtttattttaaagactacaatgatattactacattttctatg300a.at,ccax:aactgtattgtgattataatgtagtattgatgagatatgataataca>tctga.a_360ttagatgcatcggagttagcagatettatattgaacgaatggctgtgcaatcctatggat420atatcactttactattatcagaatcaaataaatggatatc480gactgcacggtaaaagtttgtccactcaatacacaaactttaggaattggatgeaaaact540acggacgtggatacatttgaga/ttgttgcgtegtctgaaaaattggt幼ttactgatgtt600gt咖tggtgtcaataaatacgtgtactataegtaattgt660aataaactaggaccacgagaaaatgttgctataattcaagttggtggaccggaegcacta720gatatcactgctgatccaacaacagttccacaggttcaacgaattatgcgagtaaattgg780ggcaagtgttttatacagtagttgactatattaaccaa^ttatacaagtt840atgtccaaacggtcaagatcattagacacggetgetttttttag894<210〉 4<211〉 894<212〉 鵬 <213>人工序列<400> 4atggactaca ttatcttcag attcctgctc ctgatcgccc tgatgagece ettegtgaga 60o 1 2 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atggactttattatttacagatttcttttgattatagttatattatcaccactccttaat60gcacaaaattatggaatgaatcttccgatcactggctcaatggacacaccatatacgaac120tcaacgcgagaggaagtattcctaacttcgactttatgtttgtattacccaactgaagca180gcaacagaaattcatggaaggatacactttctcagctatttttaatcaaa240ggatggccaacaggatctatttattttaaagattatactgatattgcctcgttttcagtc300gatccacaactgtattgtgattataa/tttggtattaatgaaatacgacgctacactgcaa360ctggacatgtccgaactagcagatttgttacttaatgagtggttatgtaatcctatggat420atcactttgtattattatcaaca站ctgatgaggcaaataaatggatttcaatgggatca480tcttgtactataaaggtatgtccactaaatacgc肌acattaggaattgggtgcctaaca540actgatacaaacacgtttgaagaagttgcaacagctgaaaaattagtgattactgacgtt600gtagatggcgtcaatcataaattgaacgtgacgacaaacacttgtacgattagaaattgt660gaccaagggaaaacgtagcagttatacaggttggtggcccagatgtgctt720gacataacagctgatccaacgacaatgccagaatgaitgcgagtgaattgg780汪agaaatggtggcaagtgttttatacaatagttgactacgtgaatcaaa/ttgtgcaagca840atgtccaaaetgatcgagatcattaaattctgctgcattctactacagagtatag894<210〉 6<211> 894<212> 腿 〈213〉人工序列<400〉 6 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1. 一種DNA分子，其中含有密碼子優化的編碼輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白的全長蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。
2. 權利要求1的DNA分子，其中所述核苷酸序列為SEQIDNO:2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8 。
3. —種重組載體，其中含有權利要求1或2的核苷酸序列。
4. 權利要求3的重組載體，其中所述載體為腺病毒載體或桿狀病毒 載體。
5. 權利要求3的重組載體，其為rvAdGlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)、 rvAdVP6(opt)、 rvBacGlVP7(opt)、 rvBacG2VP7(opt)、 rvBacG3 VP7(opt)或rvBacVP6(opt)。
6. —種宿主細胞，其中含有權利要求3 — 5之一的重組載體。
7. 權利要求6的宿主細胞，其為Sf9細胞或293細胞。
8. —種提高輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分的表 達量的方法，該方法包括在適合表達的條件下培養權利要求6或7的宿主 細胞并獲得輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。
9. 權利要求域2的DNA分子和權利要求沖的重組載體作為疫苗的 用途。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域。具體而言，本發明涉及密碼子優化的輪狀病毒VP6或VP7蛋白的編碼核苷酸序列、含有該序列的重組載體以及宿主細胞。本發明還涉及通過輪狀病毒結構蛋白基因密碼子的優化提高蛋白表達量的方法及其在免疫學上的用途。
文檔編號C12N15/46GK101245350SQ20071007934
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月17日 優先權日2007年2月17日
發明者弋 束, 濤 洪, 敏 王, 王健偉 申請人:王健偉