專利名稱：產埃坡霉素的微生物的制作方法
本申請是申請號為03822662.6、發明名稱為“埃坡霉素B的制備、分離和純化的方法，及埃坡霉素B的X-射線晶體結構”的專利申請的分案申請。
相關申請
本申請要求以2002年9月23日提交的美國臨時申請序號60/412,994為優先權。
發明領域 本發明涉及埃坡霉素(epothilone)B的生產、分離和純化的改進方法。例如，這些方法包括生產埃坡霉素B的發酵過程、通過在樹脂上吸附的分離以及隨后的純化過程。

背景技術：
埃坡霉素是一類較新的大環內酯化合物，最初由粘細菌(纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum))發酵獲得。由于這類化合物具有抗真菌的性質最初它們是作為植物保護劑進行研究。然后由于它們對動物細胞具有細胞毒活性埃坡霉素變得引人注意，后來將這種細胞毒活性表征為微管蛋白聚合劑。現在知道埃坡霉素能發揮類似于紫杉醇(TAXOL)的穩定微管效應和抗快速增殖細胞如腫瘤細胞或其它過度增殖細胞的疾病的細胞毒活性。埃坡霉素作為化療劑的用途在Bollaget等，Cancer Research 55，2325，1995中有描述。
埃坡霉素A和B(分別為epo A或epo B)具有下面的結構，
埃坡霉素A R＝H 埃坡霉素B R＝Me 獲得埃坡霉素的示意圖由Hofle等在WO 93/10121中揭示。Hofle在含碳源、氮源和無機鹽的介質中培養了纖維堆囊菌的菌株。在該菌株的培養過程中加入了吸附劑樹脂。用溶劑從吸附樹脂上洗脫埃坡霉素。通過反相色譜法分離各種埃坡霉素并使其結晶。然而，Hofle等承認這種方法只能生產低數量的埃坡霉素B，以及在發酵中埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例也低。這種埃坡霉素B相對于埃坡霉素A的低比例使得純埃坡霉素B的回收困難。因此，在技術上需要生產埃坡霉素B優于埃坡霉素A的改進的發酵方法，以及分離和純化埃坡霉素B的改進方法。
發明概述 本發明涉及一種生產埃坡霉素B的改進的發酵方法。
本發明還包括用于埃坡霉素生產的通過誘變獲得的纖維堆囊菌新菌株。
本發明還包括通過對發酵提供添加劑來提高纖維堆囊菌的新菌株生產的埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例的方法。在一優選的實施方案中，添加劑為丙酸鹽、調節至合適的pH的丙酸或另一丙酸鹽前體。
本發明還包括一種用于使用樹脂從發酵培養基中分離埃坡霉素B的改進的萃取方法。還包括減少雜質含量和改進下游處理的洗滌富含埃坡霉素樹脂的方法。
本發明還包括一種純化埃坡霉素B的改進方法。在一實施方案中，利用結晶實現純化。在另一實施方案中，通過色譜法實現純化，其中色譜法包括正相色譜法或反相色譜法。在另一實施方案中，通過結晶與色譜分離法純化樣品相結合實現純化，其中色譜分離法包括正相和反相色譜法。在進一步的實施方案中，樹脂萃取物僅通過結晶處理。
埃坡霉素B(″epo B″)作為中間體用于衍生物1(″D1″)的制備中，(在美國專利6,262,094中作了描述，在此引入作為參考)，其中噻唑環上的2-甲基被胺取代
衍生物1 埃坡霉素B也用于衍生物2(″D2″)的制備中(這種將埃坡霉素B內酯轉化成衍生物2內酰胺的方法在Borzilleri等，J.Amer.Chem.Soc.122，8890，2000以及WO 9902514中作了描述，在此引入作為參考)
衍生物2 此外，埃坡霉素B(″epo B″)還用于衍生物3(埃坡霉素D，″D3″)的制備中(在美國專利6,320,045作了描述，在此引入作為參考)
衍生物3 本發明還包括利用本文中描述的方法和材料生產的埃坡霉素B的晶形。
應當理解以上概述和以下的詳細說明為本發明的示例，而不是限制本發明。
附圖簡述 本發明的優點、特性和各種特點似乎更充分地體現在附圖上。附圖中

圖1顯示的是晶形epoB-EAβ的單斜晶胞中的分子結構，在該單斜晶胞的客通道(guest channel)中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的乙酸乙酯。
圖2顯示的是晶形epoB-ANβ的單斜晶胞中的分子結構，在該單斜晶胞的客通道中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的乙腈。
圖3顯示的是晶形epoB-Ipβ的單斜晶胞中的分子結構，在該單斜晶胞的客通道中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的異丙醇。
圖4顯示的是晶形epoB-Toβ的單斜晶胞中的分子結構，在該單斜晶胞客通道中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的甲苯。
圖5顯示的是埃坡霉素B的乙酸乙酯溶劑合物(晶形epoB-EAβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖5中，模擬圖是根據-33℃下單斜晶結構中提煉的原子參數計算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖6顯示的是埃坡霉素B的甲苯溶劑合物(晶形epoB-TOβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖6中，模擬圖是根據-33℃下單斜晶結構中提煉的原子參數計算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖7顯示的是埃坡霉素B的乙氰溶劑合物(晶形epoB-ANβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖7中，模擬圖是根據-40℃下單斜晶結構中提煉的原子參數計算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖8顯示的是埃坡霉素B的異丙醇溶劑合物(晶形epoB-IPβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖8中，模擬圖是根據-3℃下單斜晶結構中提煉的原子參數計算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖9顯示的是按照實施例7步驟A中描述的方法生產的含甲苯的初級的埃坡霉素B溶劑合物的PXRD觀察圖。
圖10顯示的是對于圖9中含甲苯的初級的溶劑合物進行的熱分析(DSC和TGA)。
圖11顯示的是按照實施例7步驟B中描述的方法生產的含甲苯的再結晶的埃坡霉素B的溶劑合物的PXRD觀察圖。
圖12顯示的是對于圖11中含甲苯的再結晶的溶劑合物進行的熱分析(DSC和TGA)。
圖13顯示的是按照實施例7步驟C中描述的方法生產的含乙酸乙酯的埃坡霉素B的溶劑合物的PXRD觀察圖。
圖14顯示的是對于圖13中含乙酸乙酯的溶劑合物進行的熱分析(DSC和TGA)。
圖15顯示的是按照實施例7C描述的方法制備的含甲苯的溶劑合物的PXRD觀察圖(上部)，連同室溫下埃坡霉素B的甲苯溶劑合物的PXRD模擬圖(底下)。
圖16顯示的是對于圖15中含甲苯的溶劑合物進行的熱分析(DSC和TGA)。
應當理解這些圖是為了說明本發明的構思，本質上不是限制本發明。為了清楚在圖1-4中埃坡霉素所有的甲基和亞甲基的氫原子都被忽略。在圖1-4中，分子間氫鍵以虛線條顯示在圖的右下和左上部分，且氫鍵長(埃)是指分子間的氧-氧距離。
發明詳述 本發明描述具體的處理方法和纖維堆囊菌的新突變株，這些突變株一起或單獨地產生增加埃坡霉素B濃度的發酵，這主要是通過減少在發酵過程中埃坡霉素A產生的相對量實現的。例如，纖維堆囊菌或其它合適的微生物的細胞經一個或多個最初的成長期培養擴增，于是用于為產埃坡霉素發酵提供接種物。在發酵的第一時段期間，例如大約24-72小時，當細胞利用介質中的營養素時發生細胞生長。此后，將營養素，如維生素、礦物質、碳水化合物和氨基酸(或其它碳或氮源如氨基酸前體)以有助于埃坡霉素產生的量加入到介質中。在一實施方案中，將營養素如維生素、礦物質、碳水化合物和氨基酸以維持發酵過程中埃坡霉素A或埃坡霉素B的最大生產率的量加入。在一實施方案中，埃坡霉素A或埃坡霉素B的最大生產率是這樣的生產率與不加入添加劑或營養素相比產生更大量的埃坡霉素A或埃坡霉素B，也比添加劑或營養素以低于最佳的量加入時產生更大的生產率。在發酵過程中，將丙酸、其前體或其鹽以有效增加埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例(″產物比例″)的量加入。
本發明還涉及用于生產埃坡霉素的纖維堆囊菌的新菌株。這些新菌株，尤其是菌株SC16408，已經通過誘變繼之以隨機選擇獲得。
纖維堆囊菌最初是1985年從南非Zambesi河的堤岸收集的土樣中分離得到的。Hofle等首先描述了該生物產生埃坡霉素的特征(上面有引用)。Hofle等使用的菌株稱為So ce90，并保藏在Deutsche Sammiungvon Mikroorganismen(German Collection of Microorganisms，DSM)，保藏號為6773。So ce90菌株經過UV誘變繼之以隨機選擇產生Soce90B2菌株。So ce90B2菌株(也稱為SC16224)生產的埃坡霉素B在振搖燒瓶(例如每個燒瓶中含1.8w/v％樹脂)中的滴度為約50mg/L或2.8mg/g樹脂例如可為3.5或4.5mg/g)，且埃坡霉素B/A的比例為約0.6。
本發明中，So ce90B2菌株或其衍生物經歷用亞硝基胍(NTG)誘變、繼之以隨機選擇產生SC16408菌株(以ATCC編號PTA-3880保藏)和SC16449(以ATCC編號PTA-3881保藏)。后面的兩種菌株作為按照布達佩斯條約規定的專利保藏由美國標準菌庫保藏。選擇過程的詳述在實施例中闡述。
在一實施方案中，本發明提供產生(例如，在以下定義的生產條件)下每升肉湯體積至少約100mg埃坡霉素B的纖維堆囊菌菌株。在另一實施方案中，本發明提供在生產埃坡霉素B的同等條件下產生每升肉湯體積至少80mg埃坡霉素B且埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例為至少1的纖維堆囊菌菌株。在一實施方案中本發明提供產生5mg埃坡霉素B/g樹脂的埃坡霉素B、或產生5mg/g樹脂的埃坡霉素B且埃坡霉素B/A的比例為至少1.0的菌株。在另一實施方案中，埃坡霉素B/A的比例為至少1.5。在另一實施方案中，埃坡霉素B/A的比例為至少1.5至4.0。
本發明還涉及通過對發酵供給添加劑提高纖維堆囊菌生產的埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例的方法。在優選的實施方案中，添加劑包括丙酸鹽，在細胞已經生長直到96小時、但優選約24-48小時之后加入。在一些優選的實施方案中，在加入丙酸鹽之前讓細胞生長大約34小時。早期GBF的研究探查了，在影響發酵的其它因素中，丙酸鹽加入到介質中的時間對于埃坡霉素B/埃坡霉素A(B/A)比例增加的改進產生0.1％的影響。本發明的發明人已經意外地發現通過供給丙酸鹽或丙酸鈉能明顯提高埃坡霉素尤其是埃坡霉素B的滴度、以及在振搖燒瓶、14L發酵罐和生產發酵罐中產生的B/A比例是本發明的特點之一。供給丙酸鹽或丙酸鈉引起埃坡霉素B的滴度明顯提高。例如，埃坡霉素B的燒瓶生產可通過以下方式提高一旦開始供給就定期地(例如，每天)補充丙酸鈉至優選范圍0.05到0.80mg/ml(0.005-0.08％)內，更優選在0.005-0.04％的范圍內，這可在培養物中進行監測。在一實施方案中，培養物中丙酸鹽的量定在0.02％或更低。此外，還發現其它丙酸鹽相關的化合物包括但不限于丙酸甲酯和丙酸乙酯能提高埃坡霉素B生產量和B/A比例。
在一實施方案中，尤其是用于燒瓶中的發酵，加入含磷酸二氫鹽和磷酸氫鹽混合物的其它進料，磷酸二氫鹽和磷酸氫鹽所選擇的比例能維持合適的pH。可將這種進料摻入到丙酸鹽進料中或分開加入。
本發明中，描述了大規模的埃坡霉素純化的方法，該方法成功地利用了樹脂的加入。發現這種樹脂的摻入對于埃坡霉素的分離和純化是有用的，它能顯著地提高埃坡霉素的滴度。在本發明的一個優選的實施方案中，樹脂為苯乙烯/二乙烯基苯聚合樹脂，如XAD樹脂，優選XAD-16或同等物(可以Amberlite XAD-16的商品名購自Sigma-Aldrich，St Louis，MO或Rohm和Haas公司，Philadelphia，PA)。其它帶有疏水性表面的Amberlite樹脂也可用于本發明中，如基于苯乙烯的XAD 4、XAD-1180或XAD-1600(Rohm和Haas公司)，還有樹脂如基于苯乙烯的XD-207、HP20、HP21、SP825、SP850、SP700或SP207(由于加入溴基團疏水性更強)(這些樹脂由Mitsubishi，Tokyo，Japan或Mitsubishi Chemical America，Inc.White Plains，NY生產)。可將樹脂以較寬的含量范圍摻入介質中，如0.2w/v％至5.0w/v％，優選1.5w/v％至4.0w/v％。
含源自發酵的埃坡霉素的樹脂任選地用水與20-30％乙腈水溶液或甲醇水溶液洗滌以除去極性雜質，或用含洗滌劑和一定量的胺的溶液洗滌(以堿形式加入到溶液中)，其中洗滌劑優選離子型洗滌劑如基于烷基硫酸鹽的洗滌劑。選擇各成分的量以提高后面的由樹脂中獲得的埃坡霉素萃取物的質量。一種優選的水洗滌劑使用了0.5w/v％十二烷基硫酸鈉和0.5w/v％氨。在最后的實施方案中，在溶劑萃取之前優選地將樹脂用水洗滌一次或多次。
優選地將含發酵獲得的埃坡霉素用與水相不混溶的(不發生相分離的)溶劑如乙酸乙酯或甲基叔丁基醚(MTBE)萃取以移去吸附在樹脂上的埃坡霉素。可用于萃取埃坡霉素B的其它溶劑包括正丁醇、乙酸異丙酯、乙酸正丙酯、乙酸正丁酯和乙酸叔丁酯。優選地將富溶劑萃取物濃縮，并將埃坡霉素B從濃縮物中結晶。在一實施方案中，將富溶劑用水洗滌，并將水洗滌過的富溶劑濃縮和任選地研磨過濾。當溶劑合適時，如為乙酸乙酯，通過將蒸鎦溶劑交換到反溶劑中從而使埃坡霉素B結晶出來。換而言之，將相對高沸點的第二種溶劑(埃坡霉素B基本上不溶于其中)加入到富溶劑中，并將富溶劑蒸發至足以產生結晶。可用真空推進或促進蒸餾。在一實施方案中，將溶劑濃縮并加入適量的反溶劑。適用的反溶劑包括甲苯、己烷和庚烷。可將所得的漿液加熱、并冷卻至所選擇的設定溫度以提高產生的晶體的質量。可變化溫度以提高晶體的純度、使粉末減至最少、和產生更快的過濾漿液。對于其它的溶劑，如MTBE，蒸鎦濃縮富溶劑能產生冷卻時的有效結晶環境(不使用反溶劑)。優選地將所得的晶體過濾生產初級的埃坡霉素B。
在萃取和最初的結晶過程中埃坡霉素B與存在于初始萃取物中的大多數雜質尤其是埃坡霉素A分離。初級的埃坡霉素B通常含有埃坡霉素A，它是一種主要雜質。通常還存在由發酵產生的兩種其它的結構相似的雜質，即下面的唑類似物和乙基噻唑類似物
唑 乙基噻唑 隨后使用的本文中描述的用于埃坡霉素B純化的方法(包括再結晶和色譜分離步驟)尤其包括除去這兩種化合物至它們的含量不再顯著。
然后可將初級的埃坡霉素B(即含甲苯的晶形epo B，初級)，優選按上述方法獲得的埃坡霉素B，通過在乙酸乙酯中加熱接著加入甲苯并繼續加熱再結晶。然后冷卻該混合物，將所得的結晶漿液過濾并用甲苯洗滌濾餅得曾經再結晶的埃坡霉素B(即含甲苯的晶形epoB，再結晶的)。另外，可將初級的埃坡霉素B經實施例中描述的制備型高效反相色譜(例如，在RP/C-18柱上)步驟處理。任選地，在將埃坡霉素樣品裝入柱子之前，預先加入一定體積的合適的有機溶劑或有機溶劑的混合物以減少埃坡霉素沉淀。在一實施方案中，有機溶劑為諸如二甲亞砜(DMSO)的有機溶劑。任選地，加入痕量的合適的有機溶劑或有機溶劑的混合物以減少埃坡霉素沉淀。然后用合適的有機溶劑、有機溶劑的混合物或有機溶劑的水溶液洗脫。在一實施方案中，用乙腈和水的混合物洗脫埃坡霉素。例如，使用這類溶劑的洗脫圖可以是線性的或梯度的，對其進行選擇以獲得低的雜質含量。將含埃坡霉素B的部分合并、濃縮、并用包括但不限于乙酸乙酯的溶劑萃取。然后將該富溶劑的萃取物濃縮和結晶(例如通過加入低極性溶劑如正庚烷或庚烷)，任選地冷卻。過濾漿液，用溶劑/反溶劑(所選擇的比例和量不致溶解大量的埃坡霉素B)如比例為2∶1的乙酸乙酯/正庚烷洗滌。將洗滌過的晶體干燥得高質量的埃坡霉素B。
也可使用其它的提純方法，例如在正相(如硅土、或以硅土為基礎的正相等)色譜分離法。例如，可應用高效正相色譜分離法。可將樣品以較低極性的溶劑如二氯甲烷裝在柱子上，并用較高極性的溶劑如乙酸乙酯和庚烷的混合物洗脫埃坡霉素。例如，使用這類溶劑的洗脫圖可以是線性的或梯度的，對其進行選擇以獲得低的雜質含量。將該需要的部分合并、濃縮和結晶，例如通過加入低極性溶劑如正庚烷、庚烷或甲苯從乙酸乙酯中結晶。過濾漿液，用溶劑/反溶劑(所選擇的比例和量不致溶解大量的埃坡霉素B)如比例為2∶1的乙酸乙酯/正庚烷或乙酸乙酯/甲苯洗滌。將洗滌過的晶體干燥得高質量的埃坡霉素B。
在某些情況下不需要除去乙基噻唑或唑類似物，如在D1的合成中，可通過單獨結晶純化埃坡霉素B。例如，將固體埃坡霉素B物溶解在溫熱的乙酸乙酯中并通過冷卻至環境溫度或通過冷卻器結晶(或再結晶)，接著過濾并干燥(例如，在真空中)。可重復結晶以獲得所需的純度，如結晶2至3次。
例如，用于使產埃坡霉素的微生物生長的生長培養基可配制如下 1也可以其它脫脂乳、豆粉、酵母萃取物和Maltrin淀粉替換使用取得同等的結果。
例如用于使產埃坡霉素的微生物生長和用于生產埃坡霉素的生產培養基，尤其是振搖燒瓶中的培養基，可按上述配方進行配制，只是甘油有如下的差異、以及有下述的樹脂的加入 有效的營養料液，尤其是用于振搖燒瓶中的營養料液，含有 這種營養料液可進一步含如下的磷酸二鈉和磷酸一鈉的混合物 選擇磷酸二鈉與磷酸一鈉的比例以使加料時培養物偏離所需的pH的pH變化最小。
為了在發酵罐中使用，優選地將如上所述的除HEPES(優選地將HEPES除掉)之外的營養組分與消泡劑(例如源自Dow Corning，AFEmulsion，食品級)一起使用，消泡劑的加入如下 可將苛性堿(氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液)加入到發酵培養基中以維持有效的pH范圍。樹脂可加入如下 在生產發酵過程中，優選地將丙酸鹽和營養素根據需要分開加入。例如，丙酸鹽進料可含80至150g/L丙酸鈉，所加入的最優選的量應將丙酸鹽含量維持(例如，由HPLC測定)在0.05至0.20mg/ml。可在將起始培養物加入到發酵罐20-40小時之后開始加入丙酸鹽。補充營養素，例如補充下述的無菌原料 對于較長時期的發酵，優選地加入其它營養素，例如加入下述無菌的原料，與前述的原料相比其加入量較大 可對上述兩種營養素進行選擇以防止引發生長期。
本發明包括生產埃坡霉素B的方法，其中埃坡霉素B(″epo B″)被轉化為下式的衍生物1(″D1″)(在美國專利6,262,094中有記載，在此引入作為參考)
衍生物1 本發明還包括生產埃坡霉素B的方法，其中埃坡霉素B被轉化為下式的衍生物2(″D2″)(在Borzilleri等，J.Amer.Chem.Soc.122，8890，2000和WO 99/02514中有記載，在此引入作為參考)
衍生物2 本發明還包括生產epothiione B的方法，其中epothiione B(″epoB″)被轉化為下式的衍生物3(埃坡霉素D，″D3″)(在美國專利6,320,045中有記載，在此引入作為參考)
衍生物3 埃坡霉素B的晶形 申請人:還利用本發明的方法和本文中描述的物質已經獲得多種埃坡霉素B的晶形。利用不同的溶劑和溶劑體系獲得了多種埃坡霉素B晶體。例如，申請人已經發現了含甲苯的埃坡霉素B溶劑合物晶形，本文中稱為epoB-Toβ，該晶形具有下面的表1所報告的晶胞數據。埃坡霉素B含甲苯的溶劑合物的晶形進一步用本文中的圖9-12和圖15和16說明。申請人還利用乙腈(即epoB-ANβ)、乙酸乙酯(即epoB-Eaβ)、和異丙醇(即epoB-Ipβ)、以及在下面的實施例中所述的溶劑體系獲得了多種埃坡霉素B晶體。這些結晶學的異構形式具有單斜晶籠形結構，其中P21晶架群含有親脂性溶劑通道，這些通道沿b軸貫穿整個晶體(1個通道/晶胞)。每個通道可容納最高達兩個溶劑分子如甲苯、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇、或MTBE(理想地產生1∶1的埃坡霉素B溶劑合物)。從甲苯/乙酸乙酯的溶劑混合物(例如，1∶1混合物)中結晶導致甲苯優先摻入到籠形結構的通道中(即，獲得晶形epoB-TOβ，而不是epoB-EAβ)。埃坡霉素的氫鍵給體(羥基)包含于埃坡霉素間的氫鍵中，不能有效地與客溶劑結合，而是抑制這種結合。
晶形epoB-TOβ、epoB-ANβ、epoB-EAβ和epoB-IPβ顯示出表1所示的晶胞數據獲得這些含甲苯、乙腈、乙酸乙酯和異丙醇的晶形的結晶結晶條件在下面的實施例中給出。利用實施例7中描述的方法制備的晶體的PXRD圖顯示在圖9、11和13中，在下面還作了進一步的描述。
制成表的這些晶形的具體示例性的參數如下，如表1所示 epoB-ANβ、epoB-EAβ、epoB-IPβ和epoB-Toβ的部分原子坐標分別如表2、3、4和5所示。圖9、11和13顯示的PXRD圖由下面的表6、7和8中所列的數據表征。
表1 晶胞數據 1計算的理想密度，假設1∶1溶劑占有率 表2 埃坡霉素B乙腈溶劑合物的部分原子坐標EpoB-ANβ晶形(大部分氫原子被忽略) 表3 埃坡霉素B乙酸乙酯溶劑合物的部分原子坐標 晶形EpoB-EAβ(大部分氫原子被忽略) 表4 埃坡霉素B，異丙醇溶劑合物，EpoB-IPβ晶形的部分原子坐標(大部分氫原子被忽略) 表5 埃坡霉素B乙腈溶劑合物的部分原子坐標 晶形EpoB-TOβ，(大部分氫原子被忽略) 表6 埃坡霉素B含甲苯的溶劑合物的PXRI數據， 利用實施例7的方法步驟A生產如圖9所示 表7 埃坡霉素B含甲苯的溶劑合物的PXRD數據， 利用實施例7的方法步驟B生產，如圖11所示 表8 埃坡霉素B含乙酸乙酯的溶劑合物的PXRD數據，利用實施例7的方法步驟C生產，如圖13所示 定義 就本申請而言，下列術語有如下所述的各自的含義 “埃坡霉素B比較生產條件。”為了測量埃坡霉素B相對于埃坡霉素A的生產量，或菌株之間埃坡霉素B的凈生產量，需要標準的條件。埃坡霉素B比較生產條件″的含義如下。應當注意標準條件可以按實施例中的描述進行適當地換算(例如，按照實施例2中的125mL生產燒瓶換算) 1)F1階段 將1mL冷凍的小瓶或維持燒瓶轉入125mL裝有約(ca.)10mL培養基E(如下所述的組合物)的燒瓶中。將F1燒瓶在30℃和160rpm下保溫3-4天。
2}F2階段 將F1燒瓶(約10mL)中的全部內容物轉入(10％)250mL含90mL培養基E的燒瓶中。將該F2燒瓶同樣在30℃和160rpm下保溫3-4天。
3)生產階段 將生產燒瓶(250mL裝有90mL培養基E的燒瓶，參見下面的培養基配方)以F2階段培養物灌輸至10％的量(10mL)。另外，可以運用″固定燒瓶″，這些固定燒瓶由常規燒瓶每3-4天移植5％至10％的量而來。生產階段摻入至少15g/L的樹脂。一旦接種，生產燒瓶就在30℃和160rpm下保溫14天。摻入進料以提高埃坡霉素B/A的比例。進料從接種后72小時開始加入如下 每個生產燒瓶(100mL培養物容量)每天加入1mL進料，從3-11天開始，需要時繼續加入直到第14天。
含丙酸鹽的進料裝有10％Maltrin-M040、4％丙酸鈉、和3％Tastone-154，這樣當按所述方式以100倍稀釋倍數加入時，每天在培養肉湯中的最終濃度變成0.1％Maltrin-M040、0.04％丙酸鈉、和0.03％Tastone-154(不包括先前加入的剩余含量)。通常采集燒瓶用于接種后14天的分析。
“丙酸前體”是指可以有效產生丙酸的量加入到適當的培養物中的任何化合物，其中丙酸的量能有效增加埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例。例如，丙酸可以用不穩定的酯通過細胞的酶作用自然產生。本領域的普通技術人員能識別用于產生丙酸或用于增加埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例易于試驗的侯選化合物。例子包括丙酸的甲酯和乙酯。
“進料，”是指將至少一種或多種營養素或添加劑，如丙酸鹽、丙酸鈉、含丙酸鈉的混合物或溶液、維生素、礦物質、碳水化合物源或氨基酸源，在發酵過程期間不只一種場合加入，例如定時地、通過脈動進料、通過基本上連續進料等等。應當理解術語“不只一次加入”的含義包括在整個發酵期間連續進料。
“含甲苯”是指一種主要含一定量的甲苯溶劑合物，甲苯的量可由本領域的技術人員運用分析技術進行測量，其中含甲苯的溶劑合物可含有也可不含有一種或多種其它溶劑。
“含乙酸乙酯”是指一種主要含一定量的乙酸乙酯的溶劑合物，乙酸乙酯的量可由本領域的技術人員運用分析技術進行測量，其中含乙酸乙酯的溶劑合物可含有也可不含有一種或多種其它溶劑。
實施例 以下實施例是使用本領域技術人員公知的和常規的標準技術進行的，除另有詳細的說明外。這些實施例是示例性的，但不限制本發明。
實施例1 通過突變和選擇制備SC16408菌株，以及制備細胞庫 SC16408菌株由亞硝基胍(NTG)處理So ce90B2菌株(SC16224)、繼之以隨機選擇而產生。這樣，將SC16224懸浮在10mM Tris-HCl緩沖液中并在pH 8.2下經受1mg/mL NTG處理60分鐘。用NTG處理后，通過菌落選擇獲得菌落細胞系并試驗其埃坡霉素B的生產能力、和B/A的比例。將分離的菌落轉入燒瓶中培養8-14天，接著在生長培養基(培養基E)每隔3-4天轉移一次 用于振搖燒瓶的生長培養基E 將上述組分加入到蒸餾水中并用10％NaOH(或KOH)將pH調至pH 7.2后在121℃下滅菌30分鐘。
研究細胞庫的制備將10mL SC16408菌株的3天培養物轉入裝有90mL培養基E的250mL燒瓶中。然后將燒瓶在30℃、160rpm下保溫2天。在2天結束時，從燒瓶中取出1.8mL試樣量并轉入低溫的小瓶中，然后在-70℃下冷凍。
原始細胞庫的制備將2小瓶源自研究細胞庫的培養物解凍并轉入裝有10mL培養基E的2×125mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫4-5天。下一步，將2×10mL培養物轉入裝有90mL培養基E的2×250mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫2-4天。最后，合并這兩個燒瓶并將1.8mL試樣量轉入低溫的小瓶中，并在冷凍箱中于-70℃下貯存。
工作細胞庫的制備將5小瓶源自原始細胞庫工作單元庫的培養物解凍并轉入裝有10mL培養基E的2×125mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫3-6天。下一步，將5×10mL培養物轉入裝有90mL培養基E的5×250mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫2-4天。用這5個燒瓶內的細胞接種裝有90mL培養基E的12×250mL燒瓶，將其再一次在30℃、160rpm下保溫2-4天。最后，將這些燒瓶一起合并，并將1.8mL試樣量轉入低溫的小瓶中并在冷凍箱中于-70℃下貯存。產生約500-600小瓶供工作細胞庫之用。
實施例2 通過振搖燒瓶發酵培養生產埃坡霉素 將來自冷凍小瓶(1.5mL)中的細胞接種到125mL燒瓶內的45mL培養基E中并使其在30℃和160rpm下生長4-8天(F1階段)。然后，將5mL F1階段的細胞轉入裝有45mL培養基E的125mL新燒瓶中并使其生長3-4天(F2階段)。然后將F2階段的細胞用作埃坡霉素B發酵的接種物。將百分之十的接種物(5.0mL)轉入裝有45mL生產培養基的125mL燒瓶中。然后將這些燒瓶在振蕩器(160rpm)內于30℃保溫2周。生產培養基為改良的培養基E，其中含1.6％(0.8g)XAD-16樹脂。用于振搖燒瓶的生產培養基的組合物顯示如下 用于振搖燒瓶的埃坡霉素B生產培養基 將上述組分溶解于蒸餾水中并用10％NaOH(或KOH)將pH調至pH7.2后在121℃下滅菌30分鐘。
用于振搖燒瓶埃坡霉素B發酵的料液組合物為4％丙酸鈉、10％Maltrin-M040和3％Tastone-154。將進料(100mL在250mL燒瓶中)用NaOH調至pH 6.8-7.0并于121℃下滅菌30分鐘。從接種后第3天到第14天，每天向每個發酵燒瓶中加入0.5mL料液。另外，還發現雙倍進料并在第3、5、7和10天加入時可取得同樣的結果。也可通過以下方式取得改進的結果通過用磷酸鹽(以1.5％磷酸二鈉和0.5％磷酸一鈉的形式)進一步補充上述料液，這樣當進入培養基中稀釋100倍時，最終含量分別為0.015％和0.005％，排除先前加入的剩余含量。加入磷酸鹽的增加的優點是不需進行pH調節。另外通過補充磷酸鹽可提高產率(對于埃坡霉素B)達到10-20％。
至于埃坡霉素的分析，采集樹脂樣品(0.8g)并通過HPLC分析。在第14天振搖燒瓶中的埃坡霉素產物能產生以下的滴度 埃坡霉素A5.0-7.0mg/g樹脂 埃坡霉素B8.0-12.0mg/g樹脂 B/A比例1.1-2.0 與先前的菌株相比，SC16408培養顯然在振搖燒瓶中產生更多的埃坡霉素B。
實施例3 在14L發酵罐中培養生產埃坡霉素 利用培養基E形成用于14L發酵罐的接種物。振搖燒瓶和抽氣瓶階段的高壓滅菌時間分別是30和60分鐘。至于發酵罐，將生產培養基在121℃下滅菌60分鐘。14L發酵罐生產培養基為改良的振搖燒瓶生產培養基(如上所述)，其中HEPES已經被除掉并加入了2.5g/L的消泡劑(Antifoam AF，來自Dow Corning)。在14L發酵罐中配制六升生產培養基(pH調至7.2-7.4)并滅菌。下表對14L發酵罐規模的過程參數進行了匯總 實驗臺的最高發酵罐工藝參數 14L發酵罐內的埃坡霉素B滴度范圍總結如下 埃坡霉素B滴度，mg/g樹脂B/A比例 5-12 1.0-3.0 實施例4 埃坡霉素的生產方法 50L發酵罐接種期 對于F1階段，配制培養基E(2L)并將其分配到17個單獨的250mL燒瓶中，各90mL。然后將燒瓶在121℃下通過高壓滅菌法滅菌30分鐘。將來自一個冷凍小瓶中的細胞接種到每個燒瓶中并使其在大約在約30℃和160rpm下生長4-8天。
對于F2階段，配制27L的培養基E并將其分配到17個單獨的4L燒瓶中，各1.5L，然后按上述方法滅菌。用來自F1階段的燒瓶中的全部內容物接種每個4L燒瓶，然后使其在約30℃和160rpm下生長2-4天。
對于F3階段，配制80L的培養基E并分到兩個50L不銹鋼的種發酵罐中，每個50L發酵罐用來自F2階段的三個4L燒瓶中的內容物接種。使這些50L的發酵罐在30-33℃下生長2-4天，然后合并并用于接種800L的發酵罐。
培養基E*是 800L的發酵罐接種期 使接種物在800L的不銹鋼發酵罐中生長直到細胞群足以接種下一個接種期(5,000L發酵罐)。
將這批培養基E*轉入去離子水(400L)中配制并將該混合物，pH8.7-8.9，在17磅/平方英寸、124℃下滅菌60分鐘。將培養基從殺菌器轉移到800L的發酵罐中，并將pH調至pH 7.1-7.3。然后用80L來自F3階段培養物接種該發酵罐。該批在以下控制設定值下進行 根據需要，加入苛性堿(氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液)使pH從無菌的補充物到維持在7.1-7.3范圍內。每隔一段時間對該批取樣并分析其無菌狀態、pH、沉積以及葡萄糖濃縮。并監測出口氣CO2和O2。在大約48-60小時時，當葡萄糖濃縮開始下降時，將800L發酵罐(大約440-480L)中的內容物轉入5,000L的發酵罐中。
5,000L的發酵罐接種期 在此階段接種物的處理中使用5,000L的不銹鋼發酵罐。使接種物在該發酵罐中生長直到細胞群足以接種40,000L的生產發酵罐。
將按上述方法制備的培養基E(轉入到去離子水中，2,600L)轉入5,000L的發酵罐中，然后用大約440-480L來自800L的發酵罐中的接種物接種。該批在調控設定值下進行并進行如上所述的監測。再將pH維持在7.1-7.3的范圍內。在約48-72小時，當葡萄糖濃縮開始下降時，將5,000L發酵罐中的內容物轉入40,000L的發酵罐中。
40,000L的發酵罐生產階段 在該埃坡霉素的生產階段中使用40,000L的不銹鋼發酵罐。一旦將發酵罐滅菌和裝入無菌培養基后，就用在5,000L發酵罐中制備的接種物接種。一旦達到特定的生產參數，就采集生產發酵罐中的內容物。
用于生產發酵罐的培養基分為兩部分滅菌。將樹脂加入到2,800L的水中并將該混合物在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘 為獲得18,000L的培養基，將下列組分加入到去離子水(15,000L)中并將pH調至7.1-7.3。培養基在連續式殺菌機于150℃下滅菌(持續時間100秒，出口溫度60℃) 將培養基和樹脂轉入生產發酵罐中，然后用約3,100L來自5,000L的發酵罐中的接種物接種。將該批在如上所述的控制設定值下進行，除氣流為0.2-0.4wm外。根據需要，用苛性堿上調pH(在0和80小時之間)。在80小時之后，用硫酸下調pH。根據需要，用消泡劑調節起泡。至少一天一次對該發酵罐取樣分析其無菌狀態、pH、沉積、葡萄糖、丙酸鹽和埃坡霉素B的濃度。監測并記錄出口氣的CO2。在大約30-60小時時開始進料，一直到CO2不低于0.3％。
用1.9L/注(范圍為1.5-3.0)的注料量給發酵罐供給丙酸鈉(102g/L)。注料的時間間隔開始時為60分鐘，每隔12小時遞減，至最短的12分鐘。將丙酸鹽加入到2,800L的去離子水中并將該溶液在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘。在優選的實施方案中，丙酸鈉進料與含其它培養基組分的進料分開。
給該發酵罐進料Maltrin-M040和Tastone-154，注料量為14.5L。注料的時間間隔開始時為60分鐘，在104小時時變化到40分鐘。將備組分加入到去離子水(3,000L)中并在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘。進料含 在該過程中，一些培養基組分如脫脂奶粉、Maltrin-M040和甘油被耗盡。在大約115小時開始，先前的進料被中止，將下述混合物以14.5L的注料量每隔40分鐘加入到生產發酵罐中。將各組分加入到去離子水(3,000L)中，并將該混合物，pH 8.7-8.9，在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘。
當達到所需的埃坡霉素B的濃度時(通常在9-21天之后)，采集容器中的內容物。埃坡霉素B滴度在大約5-24mg/g樹脂之間變化，B/A比例大約為1.5-4。
實施例5 用MTBE從XAD-16樹脂中萃取埃坡霉素B并結晶得到固體埃坡霉素B；用反相色譜分離純化；最后分離高質量的埃坡霉素B 將所收集的并水洗過的含埃坡霉素(大約5.03kg埃坡霉素B)的XAD-16樹脂(大約550kg)與甲醇的水溶液混合并以漿液的形式裝入萃取柱。將該填充的樹脂用甲醇的水溶液(先用30％MeOH然后用50％MeOH各1柱床體積)洗滌以除去不需要的高極性物質。用MTBE洗滌(大約4柱床體積)脫掉埃坡霉素。收集富洗脫液并研磨過濾。在重力沉降除去任何水相之后，濃縮富MTBE液。重力沉降濃縮液，移去水相，向該批中另外加入MTBE(2柱床體積)。將該批再濃縮至大約每升5至15g埃坡霉素B的濃度。通過5-6小時逐漸冷卻至約0℃使該批結晶。將結晶固體過濾、洗滌并干燥。將所得的產物濾餅溶解于溫熱的乙酸乙酯中并研磨過濾。將富濾液在真空下濃縮至大約每升20至45g埃坡霉素B的濃度。加熱至70℃后，然后將該批緩慢冷卻至大約0℃得到結晶漿液，將結晶漿液過濾、用冷的EtOAc洗滌、并在低于40℃下干燥得到分離的再結晶的埃坡霉素B(以樹脂中的量計產率為84％)。然后將該產物通過反相色譜分離法純化。
將填充有反相固定栽體RP/C-18的色譜柱(11cm直徑×40cm層床長度)用乙腈的水溶液(30-50％v/v)平衡。將再結晶的產物溶解于二甲亞砜(DMSO，每公斤1-1.5L)，過濾該混合物以除去不溶物，然后裝在柱子上，裝柱前先加入等份的100％DMSO，追加等體積的DMSO以減少在含水流動相加入時樣品的沉淀。使用乙腈的水溶液(30-50％v/v)從柱中洗脫樣品，并通過UV檢測器在290nm處監測流出物。收集若干部分的埃坡霉素B產物峰。以HPLC分析各部份的埃坡霉素A和B及其它相關的雜質。
將所需的合并柱部份裝入蒸餾箱，并將該批在低于40℃的溫度下真空濃縮以除去乙腈。將產生的水相用乙酸乙酯萃取高達三次，并將該有機溶液在低于40℃的溫度下真空濃縮得到濃度為0.1至0.2g/mL的埃坡霉素B。在40℃下向該批中加入正庚烷(或庚烷)，然后將該批緩慢冷卻到2至-10℃并維持至少2小時。過濾結晶漿液并用乙酸乙酯/正庚烷溶液洗滌，然后將最終的埃坡霉素B濾餅在35-40℃下真空干燥得到3.367kg，效能為91.7％，相當于3.09kg的埃坡霉素B活性。從樹脂中得到的產率為61.4％。HPLC顯示埃坡霉素B占面積的99.6％、埃坡霉素A占面積的0.4％，沒有面積＞0.1％的其它雜質。
實施例6 用乙酸乙酯從XAD-16樹脂中萃取埃坡霉素B并用甲苯作為反溶劑結晶得到固體埃坡霉素B；用反相色譜法分離純化；最后分離出高質量的埃坡霉素B 在振動篩(SWECO TM)上用水洗滌含埃坡霉素B的XAD-16樹脂以凈化該樹脂。將該樹脂的一部分(大約6.6L，含15.6g埃坡霉素B，經檢測每克樹脂2.36mg埃坡霉素B)使用大約5L的水轉入20L的容器中以用水沖冼該樹脂。然后將乙酸乙酯(大約2柱床體積(BV)的進料樹脂)加入到容器中。將漿液攪拌約一小時，并使用600mL螺帽離心容器在3,500rpm下離心5分鐘以分層。傾出第一份富乙酸乙酯的上清液，并測量其體積。接下來，將傾斜的含多水樹脂的底層在容器中合并并向該容器中加入乙酸乙酯(2BV)。將該漿液攪拌約1小時然后離心分層。傾出第二份富乙酸乙酯的上清液，并測量其體積。
然后將水(～0.3BV進料樹脂)加入到合并的第一份和第二份富乙酸乙酯餾份中并攪拌大約5分鐘。讓各層靜置大約30分鐘。接下來，下面的水層與上面的富乙酸乙酯層分離。將洗滌過的富乙酸乙酯層在低于45℃的溫度下濃縮至濃度為大約每升10g的埃坡霉素活度。然后將濃縮的富乙酸乙酯溶液研磨過濾并濃縮至20-25g/L的埃坡霉素B。
濃縮后，加入甲苯并利用真空在低于50℃下再濃縮至加入甲苯之前該批的體積。使該批經大約1小時冷卻至約18℃，然后在此溫度下攪拌大約16小時以得到產物晶體。接下來，將該批結晶過濾并用甲苯(～0.2BV)洗滌，干燥所得的固體得大約30.4g含13.5g埃坡霉素B活度的固體。從起始樹脂中計算活性產率為87％。
將利用以上處理從樹脂中萃取的固體埃坡霉素B以反相色譜法進行純化。柱子(Phenomenex Luna，15，C18(2)，5.0cm×25cm，柱BV 400mL)用3BV的40％(v/v)乙腈-水預平衡。將大約4-6g的固體埃坡霉素B在約40℃下溶解于大約6mL的DMSO中，然后將混合物經濾膜過濾以除去微粒。將大約1.5mL的DMSO注入到樣品環中以防止埃坡霉素在管中沉淀。然后富含埃坡霉素的濾液注入到樣品環注入之后，用約0.5mL的DMSO洗滌埃坡霉素濾液容器并隨之注入約1mL的DMSO到樣品環中。注入埃坡霉素樣品后注射DMSO可防止在管中產生沉淀。以大約5mL/分鐘的流速將樣品環的內容物裝在柱上。
將埃坡霉素裝在柱上后，然后向柱中泵入40％乙腈水溶液。3-4分鐘后，流速增至大約60ml/分鐘。收集若干部分的埃坡霉素A和B峰。含富含埃坡霉素B的部份一般在2.5L和3.25L洗脫體積之間的餾分中獲得(通常埃坡霉素B峰在約6和8柱床體積之間流出)。該合并的部份的體積為大約0.75L。埃坡霉素B峰幾乎達到基線(＜10％的峰高)后向柱中泵入100％乙腈。當色譜顯示在290nm處的吸收基本上回到基線時，向柱中泵入40％乙腈-水溶液再平衡該柱以進行下一次色譜。通常使用2BV的100％乙腈和3BV 40％乙腈洗滌和再平衡柱子。
利用HPLC分析對各部份進行分析以測定純度，并將所需要的部份合并。通常產率為90-98％。
將合并的埃坡霉素B部份在低于0℃下真空濃縮至大約50％的初始體積。該濃縮部份用乙酸乙酯萃取兩次。將合并的乙酸乙酯extracts在約40℃的浴溫下濃縮至大約0.1g/mL埃坡霉素B。在約15分鐘內邊攪拌邊加入正庚烷(或庚烷) (使用一定量的50％乙酸乙酯溶液)。將萃取物冷卻至5℃并在該溫度下保持至少2小時。將產物晶體過濾并用1∶2(v∶v)的正庚烷∶乙酸乙酯溶液洗滌。最后，將晶體在約40℃下真空干燥大約12小時。HPLC顯示各批中埃坡霉素B占面積的99.5-99.7％，埃坡霉素A占面積的0.3-0.5％。
實施例7 用乙酸乙酯從XAD-16樹脂中萃取埃坡霉素B并用甲苯作為反溶劑結晶，繼之以重結晶得到初級的埃坡霉素B；用正相色譜法分離純化；最后分離出高質量的埃坡霉素B 步驟A，使用EtOAc萃取-甲苯結晶制備初級的埃坡霉素B 將水洗過的富含埃坡霉素B的樹脂(1350g)裝在柱上。用水(2700mL)裝柱和沖冼柱子。以9450mL(7柱床體積)的乙酸乙酯過柱洗脫活性的埃坡霉素。讓乙酸乙酯洗脫液沉降至少一小時。除去棕褐色水層和乳劑層。將富乙酸乙酯溶液在真空下濃縮至目標濃度為大約每升20g埃坡霉素B。讓濃縮液靜置2小時并冷卻至20℃。將冷卻了的濃縮液研磨過濾，并用乙酸乙酯(36mL)洗滌過濾器。將合并的濾液和沖洗液濃縮至大約每升80g埃坡霉素B并加熱至65℃。加入等體積的甲苯，攪拌10-15分鐘以上，同時將溫度保持在60℃以上。將溫度維持在65℃30分鐘，接著在1.5小時內降溫至40℃，然后在2小時內降溫至1℃。將產生的結晶漿液在1℃下攪拌至少60分鐘。濾出固體物并用甲苯(漿液體積的20％)洗滌。(在該方法的多次重復中，母液通常含2-6％的進料的埃坡霉素B活度)。在烘箱中于40-45℃下將固體物真空干燥至少4小時。另外，也可以在烘箱中在40℃和室溫之間的溫度下將固體物真空干燥至少4小時。
該干燥的原始的埃坡霉素B濾餅的重量范圍在8.4至20g之間，埃坡霉素B效能范圍在650至713μg/mg之間。濾餅中還含有12％至26％的埃坡霉素A(面積百分比)。殘留溶劑含0.7％(w/w)EtOAc和13％(w/w)甲苯。
對于5批的計算如下 分離過程中總損失平均為9.4％。對于原始濾餅從樹脂中得到的埃坡霉素A峰相對于埃坡霉素B峰的百分比平均從49％降至19％。在此步驟所述的方法之后得到的晶體溶劑合物的PXRD圖和熱分析分別顯示在圖9和10中。圖9的PXRD圖進一步由上面的表6報告的數據表征。
步驟B，埃坡霉素B的再結晶 將EtOAc(0.14L)加入到15g初級的埃坡霉素B(710μg/mg)中并邊攪拌邊加熱到65-68℃。(埃坡霉素B的目標濃度為每升75-80g活度)。在20分鐘內將甲苯(0.14L)加入同時將溫度維持在60℃以上。將產生的漿液保持在65℃下0.25小時至1小時。然后將該批在3小時內冷卻至40℃。將該批在2小時內繼續冷卻至0-2℃。然后將該批保持在0-2℃下12小時。然后過濾所得的結晶漿液并用甲苯(2×0.028L)洗滌濾餅。通常，不到3％的進料埃坡霉素B活度損失到合并的母液和沖洗液中。在真空烘箱中于42℃和29英寸Hg的壓力下將濾餅干燥2小時。另外，也可以在真空烘箱中在40℃和室溫之間的溫度和29英寸的壓力下將濾餅真空干燥2小時。該干燥的濾餅重量為13.6g，效能為764μg/mg。殘留的溶劑包括EtOAc(0.9wt％)和甲苯(13.2％)。通常，EtOAc和甲苯以13-14wt％的總含量存在。再結晶的濾餅的埃坡霉素A峰相對于埃坡霉素B峰的面積百分比降至平均6.9％。
在此步驟所述的方法之后得到的晶體溶劑合物的PXRD圖和熱分析分別顯示在圖11和12中。圖11的PXRD圖進一步由上面的表7報告的數據表征。
正相色譜分離 配制下列流動相 20％(v/v)乙酸乙酯/正庚烷溶液(～10L)， 40％乙酸乙酯/正庚烷(～10L)，和 100％乙酸乙酯(～10L)。
安裝以下設備 Waters Delta Prep 4000；檢測器UV定在290nm；柱Phenomenex Luna，10微米，硅土(2)，5.0cm×25cm(柱體積～490mL)。
在注射埃坡霉素溶液之前用3柱床體積的20％(v/v)乙酸乙酯/正庚烷溶液平衡柱子。
將埃坡霉素B濾餅(5.5g)溶解于55mL的二氯甲烷中。將該批通過1微米的PTFE濾膜過濾以除去任何可能存在的微粒。用二氯甲烷(2-5mL)沖冼該濾膜。將富二氯甲烷濾液注入柱中，最初的30秒內的初始流速為5mL/分鐘，接著將流速增至20mL/分鐘直到樣品完全裝上。用二氯甲烷(2-5mL)沖洗含埃坡霉素濾液的容器，將沖冼液也輸入柱中。
用20％EtOAc/庚烷開始洗脫，同時將流速增加至118mL/分鐘。在流速達到118mL/分鐘之后，運用泵程序控制器運行期望的的泵程序。應用下述泵程序 收集各部份洗脫液并用HPLC分析純度。
在5批中，所收集的部份中埃坡霉素B的面積百分比為99.59-99.93％，產率平均為91％。
任選地，類似地應用等濃度的40％乙酸乙酯/正庚烷洗脫步驟、類似的100％乙酸乙酯沖洗柱步驟繼之以40％乙酸乙酯再平衡進行色譜分離。使用同樣的色譜分離設備，其中使用直徑較小的柱1.0cm×25cm。在中心餾份中埃坡霉素B的色譜分離產率為86％且所收集的部份中埃坡霉素B的面積百分比為99.4％。上述等濃度方法還可在11cm軸向壓縮柱上進行，其中中心餾份中洗脫的epo B為31-35gm，色譜的產率為90-94％。所收集的中心餾份中埃坡霉素B的面積百分比為99.6-99.9％。柱子可重復行使多次。
步驟C，最后的結晶 將需要的中心部餾份合并得到1.62-1.73L的批量體積。在40-45℃下真空除去溶劑。目標蒸餾體積為25-28mL(埃坡霉素B的濃度為大約200-210g/L)。向濃縮液中加入溫熱的(大約40℃)庚烷(50mL)。另外，也可以在此步驟將溫熱的(約40℃)EtOAc(50mL)加入到濃縮液中。將產生的漿液在約40℃下攪拌約2小時，然后在約5小時內冷卻至約0℃并在約0℃下再攪拌至少5小時。在整個結晶期間應用中等速度的機械攪拌。將結晶漿液過濾并用冷的1∶1 EtOAc/庚烷(25mL)洗滌。在真空烘箱中于40-45℃下將固體物干燥5-6小時。另外，也可以在真空烘箱中在40℃和室溫之間的溫度下將固體物干燥5-6小時。自再結晶的(一次)埃坡霉素B分離得到的埃坡霉素B的重量(對于5批)為大約4.2-5.0g(83.5-85.6％活度產率)，其HPLC純度為99.78至99.93％面積百分比(平均99.80％)。對于色譜分離的埃坡霉素B活度進料而言損失到母液中的埃坡霉素B為大約4％。濾餅中殘留的溶劑為EtOAc(5.8-6.0％w/w)和庚烷(0.6-0.7％v/v)。最終的埃坡霉素B濾餅的效能范圍為91.5至92.7％w/w。HPLC純度在99.7面積百分比以上。使用此步驟所述的方法得到的晶體溶劑合物的PXRD圖和熱分析分別顯示在圖13和14中。從圖14可以看出，按照上述操作制備和干燥所得的乙酸乙酯溶劑合物的熔點為約102℃。圖13的PXRD圖進一步由上面的表8報告的數據表征。
另外，也可以將合并的含4.83Kg Epo B中心餾份(1790L)在＜30℃下真空濃縮至目標濃度為200-210g/L，然后加入正庚烷(60kg)。重復該濃縮操作然后另外加入60kg庚烷。將漿液在三小時內冷卻至20℃，然后收集并用30Kg庚烷洗滌。將所得固體物在真空下于20-36℃干燥16小時。總共獲得5.141Kg固體，其HPLC純度＞99.6面積％。濾餅中的殘留溶劑為10.6％乙酸乙酯和1.4％庚烷。
實施例7A 從樹脂中萃取埃坡霉素B，接著重復再結晶 將水洗過的含估計量4.10Kg埃坡霉素B活度(面積％埃坡霉素B＝58.0％；埃坡霉素A＝29.2％)富含埃坡霉素的樹脂(549.8kg)用水勻漿并裝柱(700L)。排去柱中液體并用氮氣吹柱。然后用乙酸乙酯(2969Kg)洗脫，以每小時～1柱床體積的速率通過柱子，總共～6柱床體積。讓合并的富含乙酸乙酯的洗脫液重力沉降～1小時，然后除去下層的水相。然后將富乙酸乙酯濃縮至～574kg。然后將濃縮的富乙酸乙酯在研磨過濾之前于～20℃下靜置～2天。將濾膜和管道用乙酸乙酯(總共～115kg)洗滌。然后將研磨濾液和沖洗液濃縮至體積為～64L，然后溫熱至～65℃。然后邊攪拌邊加入等體積溫熱的甲苯并將所得物保持在～65℃下～30分鐘。然后將該批在～4小時內緩慢冷卻至～40℃，接著在～2.5小時內冷卻至0℃。然后將冷漿液在～0℃下保持～1小時。然后過濾所得的結晶漿液并用甲苯(～64L)洗滌濾餅。將產生的濾餅在真空下略微干燥，然后用溫熱的乙酸乙酯(200kg)從過濾干燥裝置將其再溶解。
類似地通過將富乙酸乙酯濃縮至～65L進行第一次再結晶。在溫熱至65℃之后邊攪拌邊加入等體積的甲苯并將所得物保持在～65℃下～30分鐘。類似地按照上述方法將該批冷卻，并使用上述同樣的操作和設備過濾和洗滌所產生著結晶漿液。
如上所述再進行兩次類似的再結晶得到埃坡霉素B結晶濾餅(4.384Kg)(81.5％w/w)(3.573kg埃坡霉素B)(HPLC面積％埃坡霉素B＝97.18；埃坡霉素A＝1.40；埃坡霉素F＝0.30；唑類似物＝0.30和乙基噻唑類似物＝0.56)。沒有可檢測的(＞HPLC 0.1面積％)別的雜質。產物中含13.8％w/w甲苯和0.8％w/w乙酸乙酯。從樹脂到分離純化的埃坡霉素B總活度產率為87％。
實施例7B 從母液流回收Epo B 將MTBE或EtOAc萃取物Epo B結晶后的母液合并，母液每升溶液中含2.2g Epo B和4.8g Epo A。在50℃下將十升該溶液真空濃縮至濃度為每升11-15g Epo B。加入1體積的甲苯開始形成固體物；繼續蒸餾直至達到11-15g Epo B/L的濃度。再加入1體積的甲苯，并將蒸餾再重復一次至達到11-15g Epo B/L。在1小時內將漿液冷卻至室溫，然后攪拌90分鐘。然后將混合物再加熱至～50℃，攪拌1小時并在1小時內冷卻至室溫。在攪拌至少3小時之后，通過過濾收集固體物，用甲苯洗滌然后在～40℃下真空干燥得到～92％Epo B活度的回收率。對固體物進行分析42.9％w/w Epo B，16％w/w甲苯。母液中含66％的進料埃坡霉素A并僅含5％的進料埃坡霉素B。
實施例7C 按實施例7中所述的正相色譜分離操作合并的中心餾份(200mL)含646mg Epo B，將其緩慢加入到43mL的甲苯中同時在水套內冷卻水溫度為～65℃下真空濃縮至～43ml。在真空的條件下加入甲苯(43mL)，同時在水套內冷卻水溫度為～65℃下繼續蒸餾。將所得漿液濃縮至～43mL然后讓其在～3小時內冷卻至～20℃。收集所得晶體，用2×5mL甲苯洗滌并在～40℃下真空干燥(29″Hg)30分鐘得到729mg的分離出的結晶濾餅85.3％w/w Epo B)。HPLC純度為99.77面積％(不包括甲苯的面積％)。濾餅中殘留的溶劑為15.3％w/w甲苯和0.3％w/w EtOAc。母液和沖洗液僅含0.5％的埃坡霉素B進料活度。
按此步驟中描述的方法得到的晶體溶劑合物PXRD觀察圖顯示在圖15中(上圖)，伴有一幅室溫下甲苯溶劑合物的PXRD模擬圖(下圖)。該晶體溶劑合物的熱分析如圖16所示 實施例8 特定晶形的制備 實施例8AepoB-TOβ的制備 埃坡霉素B甲苯溶劑合物的制備 將Epo B在～40℃下溶解于～13mL的乙酸乙酯中。加入1體積的甲苯接著在浴溫＜40℃下濃縮至9mL。將其再加熱至～55℃，接著再加入1體積的甲苯。然后濃縮至～10mL并讓其冷卻至18℃。所得漿液用于X射線結構測定。
按照上述方法得到的epoB-Toβ單斜晶胞的分子結構和epoB-Toβ的PXRD圖分別如圖4和6所示。
實施例8BepoB-ANβ的制備 埃坡霉素B乙腈溶劑合物的制備 讓基本純的埃坡霉素B在乙腈水溶液中的溶液(由實施例5中反相色譜分離產生的柱餾份合并而成)在室溫下緩慢蒸發得到乙腈-水結晶漿液。直接通過X射線衍射檢測該結晶漿液。
按照上述方法得到的epoB-ANβ單斜晶胞的分子結構和epoB-ANβ的PXRD圖分別如圖2和7所示。
實施例8CepoB-EAβ的制備 埃坡霉素B EtOAc溶劑合物的制備 將埃坡霉素B在1∶1 EtOAc/庚烷中的溶液濃縮至目標濃度為～190195g/L。在～40℃下向該埃坡霉素B的稠漿液中邊攪拌邊加入10體積的EtOAc。將產生的漿液在40℃下攪拌2小時，在5小時內冷卻至約0℃并在0℃下再攪拌至少5小時。然后將結晶漿液過濾并用冷的1∶1EtOAc/庚烷洗滌濾餅。將濾餅在真空烘箱中干燥5-6小時得到最終的含～5-14％EtOAc的埃坡霉素B濾餅。
按照上述方法得到的epoB-EAβ單斜晶胞的分子結構和epoB-EAβ的PXRD圖分別如圖1和5所示。
實施例8DepoB-IPβ的制備 埃坡霉素B IPA溶劑合物的制備 通過溶液加熱將埃坡霉素B(70mg)溶解于4mL的IPA中直至形成透明的溶液。將該溶液冷卻至環境溫度。通過過濾除去剛形成的任何固體。將清濾液置于小型的小瓶中并用帶有若干針孔的鋁箔覆蓋。讓溶劑在環境溫度下若干天內慢慢地蒸發直至觀察到相當的晶體成長。晶體以濕漿液送去X射線分析。
按照上述方法得到的epoB-IPβ單斜晶胞的分子結構和epoB-IPβ的PXRD圖分別如圖3和8所示。
實施例9 由埃坡霉素B(內酯)形成衍生物2(內酰胺) 通過將四丁銨氯化物和疊氮化鈉在THF/DMF中混合制備四丁銨疊氮化物(TBA疊氮化物)溶液。通過過濾除去NaCI晶體回收所產生的TBA疊氮化物溶液。將催化量的試劑如三(二亞芐基丙酮)-二鈀或該催化劑的氯仿加合物(選擇這類試劑以穩定烯丙基陽離子、氯化銨、埃坡霉素B和THF/DMF溶液)在攪拌下加入燒瓶中。通過在0-5℃下通入氮氣約25分鐘除去漿液中的氧氣。在0-5℃下加入三甲基膦。將反應混合物加熱至32-38℃并持續攪拌4-16小時由于酯官能鍵的斷裂而生成氨基酸中間體。將反應混合物冷卻至18-24℃并過濾除去固體物。用THF洗滌固體物并將該濾液與富濾液合并。在30-37℃下將該溶液在9-10小時內滴加至1-羥基苯并三唑水合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和碳酸鉀的THF-DMF漿液中。將所得的混合物冷卻至0-12℃、用水熄滅同時將溫度保持＜10℃。將混合物用乙酸乙酯萃取三至四次，并將合并的乙酸乙酯層用環己烷(3∶1的乙酸乙酯-環己烷比例)稀釋，反過來用水萃取。將有機層再用環己烷進一步稀釋至2∶1的乙酸乙酯-環己烷比例并通過充滿活性炭的筒如Zeta PadR51 SP或R53SP中以降低殘留的Pd量。將三乙胺(1％)加入到有機濾液中并將該溶液用短硅膠以含1％三乙胺的2∶1乙酸乙酯-環己烷過濾純化。收集富洗脫液并在＜37℃下濃縮至最終濃度為11-14mL/g。加入另外的環己烷并將該漿液在67-78℃下加熱45-60分鐘。將漿液緩慢冷卻至約21℃、過濾并用1∶1乙酸乙酯-環己烷洗滌結晶固體。將濕濾餅在＜45℃下真空干燥得到埃坡霉素B的晶體內酰胺類似物，產率為約56M％。
實施例10 由埃坡霉素B形成氨基取代的埃坡霉素衍生物(衍生物1) 通過酶在埃坡霉素B噻唑環上2-甲基的羥基化作用將埃坡霉素B轉化為埃坡霉素F。通過放線菌菌株在埃坡霉素B上的作用實現該轉化。用于此步驟中的放線菌菌株公開于2002年12月17日申請的美國專利申請序號10/321,188和WO 00/39276，這兩篇文獻都在此引入作為參考。
將埃坡霉素B的乙醇溶液(5％v/w)加入微生物中，使其在適當的培養基中于16-18℃下生長，并用50％w/v氫氧化鈉或30w/v硫酸將pH維持在6.9和7.1之間。繼續進行生物轉化直至埃坡霉素B的濃度降低至其初始值的3-5％。將能吸附埃坡霉素F的樹脂如XAD-16或SP207加入到發酵罐中(5％v/w)并在10-18℃下攪拌16-72小時。傾出發酵肉湯并用水(2∶1水-樹脂的比例)洗滌該樹脂。重復洗滌兩次以上。通過在布氏漏斗上過濾除去大部分殘留的水。
將預先吸附了埃坡霉素F的XAD-16樹脂用水漿液并上柱。用乙酸乙酯萃取樹脂柱并收集富洗脫液。放出水層然后用5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌富乙酸乙酯部份以脫色。在減壓下濃縮富有機部份，然后通過硅土預涂的濾膜，接著進行10μM研磨過濾。然后將產物真空蒸餾并通過在攪拌下加入作為反溶劑的甲苯使最初的埃坡霉素F結晶。將富甲苯混合物進一步濃縮以減少乙酸乙酯含量并加入更多的甲苯。過濾所得的結晶漿液并用甲苯洗滌。
將埃坡霉素F溶解于二氯甲烷或二氯甲烷/乙酸乙酯的混合物中，然后裝在填充有高效液相色譜級硅土的色譜柱上，色譜柱已經用60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷混合物(v/v)平衡。
將產物用等濃度的或逐步梯度的60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷混合物(v/v)、繼之以60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷(v/v)從柱上洗脫。通過在290nm處的UV檢測對樣品和過程監測。把埃坡霉素F產物峰分成幾部分以使洗脫出的雜質減至最少。將合并的富部份真空蒸餾至目標濃度為約100g/L。向埃坡霉素F的漿液中邊攪拌邊加入等體積的正庚烷。將該批再真空蒸餾至目標濃度為大約100g/L，加入乙酸乙酯，并將該漿液維持在40℃。將該批冷卻至2至-10℃并在該溫度下維持至少5小時以使產物從溶液中結晶。將產生的漿液過濾并用冷的1∶1乙酸乙酯/正庚烷溶液洗滌。將最終的埃坡霉素F濾餅在35-40℃下真空干燥。
將1，8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，1.8當量)緩慢加入到埃坡霉素F和二苯基磷酰疊氮(1.5當量)在四氫呋喃(預先在3A MS上干燥)的混懸液中，并將該反應物在15-25℃下攪拌12-24小時。將三甲基膦/四氫呋喃溶液(1.0M，1.1當量)緩慢加入到反應混合物中。加入水和氫氧化銨并將混合物再攪拌30分鐘。將反應混合物用水稀釋并將水相用三份二氯甲烷萃取。然后將有機相用稀氨水和半飽和的氯化鈉溶液洗滌、并蒸干得到粗制的在噻唑的甲基上功能化的氨基衍生物(衍生物1)。
將粗制品用以2.5％甲醇-0.2％三乙胺-二氯甲烷預處理的硅膠通過柱色譜法純化。將適宜質量的部份合并、微米濾網過濾并蒸干得到色譜分離的衍生物1。將所得物加入到乙酸乙酯中并將產生的混懸液在72-75℃下加熱得到溶液。緩慢加入反溶劑正庚烷，并讓混合物在晶種存在的情況下緩慢冷卻同時于15-25℃下攪拌。冷卻并保持在～5℃后，通過過濾分離出產生的固體，接著真空干燥得到純化的晶體氨基衍生物(衍生物1)，埃坡霉素F的平均產率為約70M％。
實施例11 由埃坡霉素B制備埃坡霉素D(衍生物3)
[[4S-[4R*，7S*，8R*，9R*，15R*(E)]]-4，8-二羥基-5，5，7，9，13-五甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-1-氧雜-l3(Z)-環十六碳二烯-2，6-二酮[埃坡霉素D，衍生物3] 在-78℃氬氣氛圍下向無水THF(5ml)中加入WCl6(198mg，0.5mmol)接著加入nBuLi(0.625ml的1.6M在己烷中的溶液，1.0mmol)。將反應物在20分鐘內溫熱至室溫。取出一部分的(0.50ml，0.05mmol)鎢試劑并在氬氣的氛圍下加入到埃坡霉素B(9.0mg，0.018mmol)中，將該反應混合物攪拌15分鐘，然后通過加入飽和NaHCO3(1ml)熄滅反應。用EtOAc(3×1ml)萃取該反應混合物，將合并的萃取液干燥(Na2SO4)、過濾，并在真空下除去揮發物。將殘留物用35％EtOAc/己烷色譜分離得到發明名稱的化合物(7.0mg，0.014mmol)。MS m/z 492.3(M++H)。
權利要求
1.以ATCC號PTA 3880保藏的纖維堆囊菌菌株。
2.以ATCC號PTA 3881保藏的纖維堆囊菌菌株。
全文摘要
本發明涉及產埃坡霉素的微生物，以ATCC號PTA 3880保藏的纖維堆囊菌菌株和以ATCC號PTA 3881保藏的纖維堆囊菌菌株。
文檔編號C12P17/14GK101050445SQ20071008904
公開日2007年10月10日 申請日期2003年9月22日 優先權日2002年9月23日
發明者D·貝尼尼, R·斯坦卡瓦格, 蔣樹仁, 侯信雄, B·伊甘, D·古, D·侯, L·明茨邁爾, T·P·圖利, B·L·達維斯, I·哈格羅, M·馬斯卡里, G·加爾文, G·施泰因, C·W·麥康羅格, F·T·卡姆佐格盧 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司