專利名稱：：用于epothilone生物合成的基因的制作方法用于epothilone生物合成的基因發明領域本發明主要涉及聚酮化合物(polyketide)和用于合成它們的基因。特別的，本發明涉及從纖維堆嚢菌(5br朋g/咖ce7/i/7o幼邁)中分離和鑒定生物合成印othiloneA和B必需的新的聚酮化合物合酶和非核糖體肽合成酶基因。發明背景聚酮化合物是由二碳結構單元合成的化合物，其P-碳總是攜帶酮基，由此命名為聚酮化合物。這些化合物包括許多重要的抗生素、免疫抑制劑、癌癥化療劑、和其它具有廣泛生物學特性的化合物。巨大的結構多樣性源于聚嗣化合物鏈的不同長度、(作為二碳結構單元的一部分或在聚酮化合物主鏈形成之后)引入的不同側鏈、和這些基團的立體化學。酮基還可以被還原成羥基、烯跣基、或完全除去。每一輪二碳的加入是由叫做聚酮化合物合酶(polyketidesynthase,PKS)的酶復合物以與脂肪酸生物合成相似的方式進行的。已經分離得到并測序的聚酮化合物的生物合成基因與日俱增。例如，見美國專利號5,639,949、5,693,774、和5，716,849描述了用于soraphen生物合成的基因，所有這些此處引用作為參考。還可見Sch叩p等人，/^浙5"凝^參夢遞訊(/^^ift'croWo7o^r/:e"e2^)159:201-207(1998)和W098/07868(其中描述了用于利福霉素生物合成的基因)，和美國專利號5,876,991(其中描述了用于tylactone生物合成的基因，所有這些此處引用作為參考。編碼的蛋白質通常分為兩類第一類和第二類。第一類蛋白質是多功能的，有多個進行不同酶步驟的催化結構域共價連接在一起(如用于紅霉素、soraphen、利福霉素、和除蟲菌素的PKS(MacNeil等人，工A凝^參》子遽#夢(/Wtfsfai附cjrwTT《朋y湖s..^asic/4//7/zWffe/e〃cs),(編輯Baltz等人)，美國微生物學協會，華盛頓特區，pp.245-256(1993));而第二類蛋白質是單功能的(Hutchinson等人，工i凝4參差4斧^>^#子道傳夢，(編輯Baltz等人)，美國微生物學協會，華盛頓特區，pp.203-216(1993))。對于較簡單的聚酮化合物諸如放線菌紫素(由天藍色鏈霉菌(6Y,e—邁yce51飾7/co7or)產生)，幾輪二碳的加入在由一組PKS基因編碼的PKS酶上重復進行。相反的，更復雜的化合物諸如紅霉素和soraphen的合成涉及組織成模塊的PKS酶，由此每個模塊進行一輪二碳的加入(為了回顧，見Hopwood等人，工j^凝4:參^子遽##，(編輯Baltz等人)，美國微生物學協會，華盛頓特區，pp.267-275(1993))。復雜的聚酮化合物和次級代謝物通常可能包含氨基酸、而非筒單的羧酸衍生的亞結構。這些結構單元的摻入由非核糖體多肽合成酶(non-ribosonialpolypeptidesynthetase,NRPS)完成。NRPS是組織成模塊的多酶。每個模塊負責一個氨基酸結構單元的加入(和額外的處理，如果需要)。NRPS通過形成氨酰腺苷酸激活氨基酸，并將激活的氨基酸捕獲于肽基載體蛋白結構域的磷酸泛酰蔬基乙胺輔基的硫醇基上。然后，NRPS通過立體異構化、N-甲基化、或環化(如果需要)來修飾氨基酸，并催化被酵結合的氨基酸之間肽鍵的形成。NRPS負責肽次級代謝物如環孢菌素的生物合成，可以如在雷帕霉素中提供聚酮化合物鏈終止單位，或如在耶爾森菌素(yersiniabactin)生物合成中與PKS形成混合系統。EpothiloneA和B是16元大環聚酮化合物，具有由細菌纖維堆嚢菌菌抹Soce90(Gerth等人，y^ti^'otJ'cs)49:560-563(1996)，此處引用作為參考)產生的酰基半胱氨酸衍生的起始單位。EpothiloneA和B的結構是(其中R在印othiloneA中表示氬，在epothiloneB中表示甲基)epothilone具有窄的抗真菌譜，且在動物細胞培養物中尤其顯示高細胞毒性(見朋fle等人，德國專利4138042(1993),此處引用作為參考)。極其重要的是，印othilone在體內和在培養細胞中都模仿紫杉醇的生物學效應(Bollag等人，(C朋cerfesean^)55:2325-2333(1995)，此處引用作為參考)。穩定細胞徵管的紫杉醇和泰索帝(taxotere)是對各種人實體瘤具有顯箸活性的癌癥化療劑(Rowinsky等人，嵐家膚癥夢會f力/(〃a".Ca/7cer)83:1778-1781(1991))。竟爭研究已經揭示了印othilone作為紫杉醇與微管結合的竟爭抑制劑，與它們共有相同的微管結合位點和擁有與紫杉醇相似的微管親和力的解釋一致。然而，印othilone具有比紫杉醇顯著的優勢，因為對多藥抗性細胞系印othilone的效力降低比紫杉醇低許多(Bollag等人(1995))而且，與紫杉醇相比，較少的印othilone有效通過P-糖蛋白排出細胞(Gerth等人(1996))。此外，多種印othilone類似物已經被合成，如它們增強的誘導微管聚合和穩定的能力所示，具有比印othiloneA或epothiloneB更高的細胞毒性活性(WO98/25929,此處引用作為參考)。盡管印othilone有希望作為抗癌藥，目前這些化合物的產量限制了它們的商業潛力。這些化合物對于工業規模的化學合成過于復雜，所以必須通過發酵生產。用于粘細菌諸如纖維堆嚢菌基因搡作的技術描述于美國專利號5,686,295，此處引用作為參考。然而，纖維堆嚢菌難以發酵而且epothilone的產量因此低。在更適合發酵的異源宿主中的epothilone重組生產可以解決當前的產量問題。然而，編碼負責印othilone生物合成的多肽的基因至今還未分離得到。而且，產生epothilone的菌抹，即Soce90，還產生至少一種其它的聚酮化合物spirangien,可能使分離專門負責epothilone生物合成的基因更加復雜。因此，綜上所迷，本發明的一個目的是分離涉及epothilone生物合成的基因，特別是在堆嚢粘菌/-多嚢粘菌屬的粘細菌，即纖維堆囊菌菌抹Soce90中涉及印othiloneA和B合成的基因。本發明的另一個目的是提供應用于抗癌制劑的epothilone的重組生產方法。發明概述為了促進上述和其它目的，本發明出乎意料的克服了上面提出的困難，首次提供了包含編碼至少一種涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在優選的實施方案中，該核苷酸序列是從屬于祐細菌目的物種，最優選纖維堆嚢菌中分離的。在另一個優選的實施方案中，本發明提供了分離的核酸分子，其包含編碼至少一種涉及印othilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中多肽包含與選自下組的氨基酸序列基本上相似的氨基酸序列SEQIDNO:2，SEQIDNO:2的氨基酸11-437，SEQIDNO:2的氨基酸543-864，SEQIDNO:2的氨基酸974-1273，SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385，SEQIDNO:3，SEQIDNO:3的氨基酸72-81,SEQIDNO:3的氨基酸118-125,SEQIDNO:3的氨基酸199-212，SEQIDNO:3的氨基酸353-363，SEQIDNO:3的氨基酸549-565,SEQIDNO:3的氨基酸588-603，SEQIDNO:3的氨基酸669-684,SEQIDNO:3的氨基酸815-821，SEQIDNO:3的氨基酸868-892,SEQIDNO:3的氨基酸903-912,SEQIDNO:3的氨基酸918-940,SEQIDNO:3的氨基酸1268-1274，SEQIDNO:3的氨基酸1285-1297,SEQIDNO:3的氨基酸973-1256，SEQIDNO:3的氨基酸1344-1351,SEQIDNO:4，SEQIDNO:4的氨基酸7-432，SEQIDNO:4的氨基酸539-859，SEQIDNO:4的氨基酸-1037,SEQIDNO:4的氨基酸1439_1684，SEQIDNO:4的氨基酸1722-1792，SEQIDNO:5，SEQIDNO:5的氨基酸39-457，SEQIDNO:5的氨基酸563-884，SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399，SEQIDNO:5的氨基酸1434-1506，SEQIDNO:5的氨基酸1524-1950,SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377，SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895，SEQIDNO:5的氨基酸2932-3005，SEQIDNO:5的氨基酸3024—3449,SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876，SEQIDNO:5的氨基酸3886—4048，SEQIDNO:5的氨基酸4433—4719，SEQIDNO:5的氨基酸4729—4974，SEQIDNO:5的氨基酸5010-5082，SEQIDNO:5的氨基酸5103-5525,SEQIDNO:5的氨基酸5631-5951,SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132，SEQIDNO:5的氨基酸6542-6837，SEQIDNO:5的氨基酸6857-7101，SEQIDNO:5的氨基酸7140-7211，SEQIDNO:6，SEQIDNO:6的氨基酸35-454，SEQIDNO:6的氨基酸561-881,SEQIDNO:6的氨基酸1143-1393，SEQIDNO:6的氨基酸1430-1503，SEQIDNO:6的氨基酸1522-1946，SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373，SEQIDNO:6的氨基酸2383-2551，SEQIDNO:6的氨基酸2671-3045，SEQIDNO:6的氨基酸3392—3636,SEQIDNO:6的氨基酸3673-3745，SEQIDNO:7，SEQIDNO:7的氨基酸32-450,SEQIDNO:7的氨基酸556-877，SEQIDNO:7的氨基酸887-1051，SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790,SEQIDNO:7的氨基酸1810-2055,SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164，SEQIDNO:7的氨基酸2165-2439，SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:11,和SEQIDNO:22。在更優選的實施方案中，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼至少一種涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中該多肽包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2，SEQIDNO:2的氨基酸11-437,SEQIDNO:2的氨基酸543-864，SEQIDNO:2的氨基酸974-1273，SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385，SEQIDNO:3,SEQIDNO:3的氨基酸72-81，SEQIDNO:3的氨基酸118-125，SEQIDNO:3的氨基酸199-212，SEQIDNO:3的氨基酸353-363，SEQIDNO:3的氨基酸549-565，SEQIDNO:3的氨基酸588-603，SEQIDNO:3的氨基酸669-684，SEQIDNO:3的氨基酸815-821,SEQIDNO:3的氨基酸868-892，SEQIDNO:3的氨基酸903-912，SEQIDNO:3的氨基酸918-940，SEQIDNO:3的氨基酸1268-1274，SEQIDNO:3的氨基酸1285—1297，SEQIDNO:3的氨基酸973-1256，SEQIDNO:3的氨基酸1344-1351,SEQIDNO:4,SEQIDNO:4的氨基酸7-432，SEQIDNO:4的氨基酸539-859，SEQIDNO:4的氨基酸869-1037，SEQIDNO:4的氨基酸1439-1684，SEQIDNO:4的氨基酸1722-1792,SEQIDNO:5，SEQIDNO:5的氨基酸39—457，SEQIDNO:5的氨基酸563—884，SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399，SEQIDNO:5的氨基酸1434-1506，SEQIDNO:5的氨基酸1524-1950，SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377,SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895，SEQI謹5的氨基酸2932-3005，SEQIDNO:5的氨基酸3024-3449，SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876，SEQIDNO:5的氨基酸3886-4048,SEQIDNO:5的氨基酸4433-4719，SEQIDNO:5的氨基酸4729-4974，SEQIDNO:5的氨基酸5010-5082,SEQIDNO:5的氨基酸5103-5525,SEQIDNO:5的氨基酸5631-5951，SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132,SEQIDNO:5的氨基酸6542-6837,SEQIDNO:5的氨基酸6857_7101，SEQIDNO:5的氨基酸7140-7211，SEQIDNO:6,SEQIDNO:6的氨基酸35-454，SEQIDNO:6的氨基酸561-881，SEQIDNO:6的氨基酸1143-1393，SEQIDNO:6的氨基酸1430-1503，SEQIDNO:6的氨基酸1522-1946，SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373，SEQIDNO:6的氨基酸2383-2551,SEQIDNO:6的氨基酸2671-3045，SEQIDNO:6的氨基酸3392-3636，SEQIDNO:6的氨基酸3673-3745，SEQIDNO:7,SEQIDNO:7的氨基酸32-450,SEQIDNO:7的氨基酸556-877，SEQIDNO:7的氨基酸887—1051，SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790,SEQIDNO:7的氨基酸1810-2055，SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164，SEQIDNO:7的氨基酸2165-2439,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11，和SEQIDNO:22在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼至少一種涉及印othilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中所述核普酸序列與選自下組的核苷酸序列基本上相似SEQIDNO:1的核苷酸1900-3171的互補序列，SEQIDNO:1的核苷酸3415-5556，SEQIDNO:1的核苷酸7610-11875，SEQIDNO:1的核苷酸7643-8920，SEQIDNO:1的核苷酸9236-10201,SEQIDNO:1的核苷酸10529-11428，SEQIDNO:1的核苷酸11549-11764，SEQIDNO:1的核苷酸11872-16104,SEQIDNO:1的核苷酸12085-12114，SEQIDNO:1的核苷酸12223-12246，SEQIDNO:1的核苷酸12466-12507,SEQIDNO:1的核苷酸12928-12960，SEQIDNO:1的核苷酸13516-13566，SEQIDNO:1的核苷酸13633—13680,SEQIDNO:1的核苷酸13876-13923,SEQIDNO:1的核苷酸14313-14334，SEQIDNO:1的核苷酸14473—14547,SEQIDNO:1的核苷酸14578—14607，SEQIDNO:1的核苷酸14623-14692,SEQIDNO:1的核苷酸15673-15693,SEQIDNO:1的核苷酸15724-15762，SEQIDNO:1的核苷酸14788-15639，SEQ扁O.-1的核苷酸15901-15924，SEQIDNO:1的核苷酸16251-21749，SEQIDNO:1的核苷酸16269-17546,SEQIDNO:1的核苷酸17865-18827，SEQIDNO:1的核苷酸18855-19361，SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302,SEQIDNO:1的核苷酸21414-21626，SEQIDNO:1的核苷酸21746-43519，SEQIDNO:1的核苷酸21860-23116,SEQIDNO:1的核普酸23431-24397,SEQIDNO:1的核苷酸25184-25942，SEQIDNO:1的核苷酸26045-26263，SEQIDNO:1的核苷酸26318-27595,SEQIDNO:1的核苷酸27911-28876，SEQIDNO:1的核苷酸29678-30429,SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:1的核苷酸30815-32092，SEQIDNO:1的核苷酸32408-33373，SEQIDNO:1的核苷酸33401-33889,SEQIDNO:1的核苷酸35042-35902，SEQIDNO:1的核苷酸35930-36667，SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991，SEQIDNO:1的核苷酸37052-38320,SEQIDNO:1的核苷酸38636_39598，SEQIDNO:l的核苷酸39635-40141，SEQIDNO:1的核苷酸41369-42256,SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048,SEQIDNO:1的核苷酸43163-43378，SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920，SEQIDNO:1的核苷酸43626-44885，SEQIDNO:1的核苷酸45204-46166，SEQIDNO:1的核苷酸46950-47702，SEQIDNO:1的核苷酸47811-48032,SEQIDNO:l的核苷酸48087-49361，SEQIDNO:1的核苷酸49680-50642，SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176,SEQIDNO:1的核苷酸51534-52657,SEQIDNO:1的核苷酸53697-54431，SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758，SEQIDNO:1的核苷酸54935-62254，SEQIDNO:1的核苷酸55028-56284,SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565，SEQIDNO:1的核苷酸57593-58087，SEQIDNO:1的核苷酸59366-60304,SEQIDNO:1的核苷酸60362-61099,SEQIDNO:1的核苷酸61211-61426,SEQ訓O:1的核苷酸61427-62254，SEQIDNO:1的核苷酸62369-63628，SEQIDNO:1的核苷酸67334-68251，和SEQIDNO:1的核苷酸1-68750。在特別優選的實施方案中，本發明提供了包含編碼至少一種涉及印othilone生物合成的多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸1900-3171的亙補序列，SEQIDNO:1的核苷酸3415-5556，SEQIDNO:1的核苷酸7610-11875,SEQIDNO:1的核苷酸7643-8920，SEQIDNO:1的核苷酸9236-10201，SEQIDNO:1的核苷酸10529-11428，SEQIDNO:1的核苷酸11549-11764，SEQIDNO:1的核苷酸11872-16104,SEQIDNO:1的核苷酸12085-12114，SEQIDN0:1的核苷酸12223-12246，SEQIDNO:1的核苷酸12466-12507,SEQIDNO:1的核苷酸12928-12960，SEQIDNO:1的核苷酸13516-13566,SEQIDNO:1的核苷酸13633—13680,SEQIDNO:1的核苷酸13876-13923，SEQIDNO:1的核苷酸14313-14334，SEQIDNO:1的核苷酸14473-14547,SEQIDNO:1的核苷酸14578—14607，SEQIDNO:1的核苷酸14623-14692，SEQIDNO:1的核苷酸15673-15693,SEQIDNO:1的核苷酸15724-15762，SEQIDNO:1的核苷酸14788-15639，SEQIDNO:1的核苷酸15901—15924,SEQIDNO:1的核苷酸16251-21749，SEQIDNO:1的核苷酸16269-17546，SEQIDNO:1的核苷酸17865-18827，SEQIDNO:1的核苷酸18855-19361，SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302，SEQIDNO:1的核普酸21414-21626,SEQIDNO:1的核苷酸21746-43519，SEQIDNO:1的核苷酸21860-23116，SEQIDNO:1的核苷酸23431-24397，SEQIDNO:1的核苷酸25184-25942，SEQIDNO:1的核苷酸26045-26263,SEQIDNO:1的核苷酸26318-27595，SEQIDNO:1的核普酸27911-28876,SEQIDNO:1的核苷酸29678-30429,SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:1的核苷酸30815-32092,SEQIDNO:1的核苷酸32408-33373，SEQIDNO:1的核普酸33401-33889,SEQIDNO:1的核苷酸35042-35902,SEQIDNO:1的核苷酸35930-36667,SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991,SEQIDNO:1的核苷酸37052-38320，SEQIDNO:1的核苷酸38636-39598，SEQIDNO:1的核普酸39635-40141,SEQIDNO:l的核苷酸41369-42256，SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048,SEQIDNO:1的核普酸43163-43378，SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920，SEQIDNO:1的核苷酸43626-44885，SEQIDNO:1的核苷酸45204-46166,SEQIDNO:1的核苷酸46950-47702，SEQIDNO:1的核苷酸47811—48032，SEQIDNO:1的核苷酸48087-49361，SEQIDNO:1的核苷酸49680-50642,SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176，SEQIDNO:1的核苷酸51534-52657，SEQIDNO:1的核苷酸53697—54431,SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758，SEQIDNO:1的核苷酸54935-62254，SEQIDNO:1的核苷酸55028—56284，SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565，SEQIDNO:1的核苷酸57593-58087，SEQIDNO:l的核苷酸59366-60304,SEQIDNO:1的核苷酸60362-61099，SEQIDNO:1的核苷酸61211-61426,SEQIDNO:1的核苷酸61427-62254，SEQIDNO:1的核苷酸62369-63628，SEQIDNO:1的核苷酸67334-68251,和SEQIDNO:1的核苷酸1-68750。在另一個優選的實施方案中，本發明提供了分離的核酸分子，其包含編碼至少一種涉及印othilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中所迷核普酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核普酸1900-3171的互補序列，SEQIDNO:1的核苷酸3415-5556，SEQIDNO:1的核苷酸7610-11875，SEQIDNO:1的核苷酸7643-8920，SEQIDNO:1的核苷酸9236-10201，SEQIDNO:1的核苷酸10529-11428，SEQIDNO:1的核苷酸11549-U764,SEQIDNO:1的核苷酸11872-16104,SEQIDNO:1的核苷酸12085-12114，SEQIDNO:1的核苷酸12223-12246，SEQIDNO:1的核苷酸12466-12507，SEQIDNO:1的核苷酸12928-12960，SEQIDNO:1的核苷酸13516—13566，SEQIDNO:1的核苷酸13633-13680，SEQIDNO:1的核苷酸13876-13923,SEQIDNO:1的核苷酸14313-14334,SEQIDNO:1的核苷酸14473-14547，SEQIDNO:1的核苷酸14578-14607,SEQIDNO:1的核苷酸14623-14692，SEQIDNO:1的核苷酸15673-15693，SEQIDNO:1的核苷酸15724-15762，SEQIDNO:1的核苷酸14788-15639,SEQIDNO:1的核苷酸15901-15924，SEQIDNO:1的核苷酸16251-21749，SEQIDNO:1的核苷酸16269-17546，SEQIDNO:1的核普酸17865-18827，SEQIDNO:1的核苷酸18855-19361，SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302,SEQIDNO:l的核苷酸21414-21626,SEQIDNO:1的核苷酸21746-43519，SEQIDNO:1的核苷酸21860-23116，SEQI,:1的核苷酸23431_24397，SEQIDNO:1的核苷酸25184-25942,SEQIDNO:1的核苷酸26045-26263，SEQIDNO:1的核苷酸26318-27595，SEQIDNO:1的核苷酸27911-28876,SEQIDNO:1的核苷酸29678-30429，SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:1的核苷酸30815-32092，SEQIDNO:1的核苷酸32408-33373,SEQIDNO:1的核苷酸33401-33889,SEQIDNO:1的核苷酸35042-35902,SEQIDNO:1的核苷酸35930_36667，SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991，SEQIDNO:1的核普酸37052-38320，SEQIDNO:1的核苷酸38636-39598，SEQIDNO:l的核苷酸39635-40141，SEQIDNO:1的核苷酸41369-42256，SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048，SEQIDNO:1的核苷酸43163-43378，SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920，SEQIDNO:1的核苷酸43626-44885，SEQIDNO:1的核苷酸45204-46166，SEQIDNO:1的核苷酸46950—47702,SEQIDNO:1的核苷酸47811-48032，SEQIDNO:l的核苷酸48087-49361，SEQIDNO:1的核苷酸49680-50642,SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176,SEQIDNO:1的核苷酸51534-52657，SEQIDNO:1的核苷酸53697-54431,SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758，SEQIDNO:1的核普酸54935-62254，SEQIDNO:1的核苷酸55028-56284，SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565,SEQIDNO:1的核苷酸57593-58087，SEQIDNO:1的核苷酸59366-60304，SEQIDNO:1的核苷酸60362-61099,SEQIDNO:1的核苷酸61211-61426，SEQIDNO:1的核苷酸61427-62254,SEQIDNO:1的核苷酸62369-63628，SEQIDNO:1的核苷酸67334-68251，和SEQIDNO:1的核苷酸1-68750。本發明還提供包含與本發明的核酸分子可操作連接的異源啟動子序列s的嵌合基因。其次，本發明提供了包含這種嵌合基因的重組載體，其中所述載體能夠被穩定的轉化到宿主細胞中。再次，本發明提供了包含這種嵌合基因的重組宿主細胞，其中宿主細胞能夠表達編碼至少一種epothilone生物合成必需的多肽的核苷酸序列。在優選的實施方案中，重組宿主細胞是屬于放線菌目的細菌，而且在更優選的實施方案中重組宿主細胞是鏈霉菌菌抹。在其它實施方案中，重組宿主細胞是任何其它適合發酵的細菌，諸如假單胞菌或大腸桿菌。再其次，本發明提供了包含本發明的核酸分子的Bac克隆，優選Bac克隆pEP015。在另一方面，本發明提供了分離的核酸分子，其包含編碼epothilone合酶結構域的核苷酸序列。根據一個實施方案，印othilone合酶結構域是P-酮脂酰合斷KS)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸11-437，SEQIDNO:4的氨基酸7-432，SEQIDNO:5的氨基酸39-457，SEQIDNO:5的氨基酸1524-1950，SEQIDNO:5的氨基酸3024-3449，SEQIDNO:5的氨基酸5103-5525,SEQIDNO:6的氨基酸35-454，SEQIDNO:6的氨基酸1522-1946,和SEQIDNO:7的氨基酸32-450。根據這個實施方案，優選所述KS結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸11-437，SEQIDNO:4的氨基酸7-432,SEQIDNO:5的氨基酸39-457，SEQIDNO:5的氨基酸1524_1950，SEQIDNO:5的氨基酸3024-3449，SEQIDNO:5的氨基酸5103-5525,SEQIDNO:6的氨基酸35-454，SEQIDNO:6的氨基酸1522-1946,和SEQIDNO:7的氨基酸32-450。而且，根據這個實施方案，優選所迷核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸7643-8920，SEQIDNO:1的核苷酸16269-17546,SEQIDNO:1的核苷酸21860-23116,SEQIDNO:1的核苷酸26318-27595，SEQIDNO:1的核苷酸30815-32092,SEQIDNO:1的核苷酸37052-38320,SEQIDNO:1的核苷酸43626-44885，SEQIDNO:1的核苷酸48087-49361,和SEQIDNO:1的核苷酸55028-56284。根據這個實施方案，更優選該核苷酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對部分序列相同的連續20、25、30、35、40V45、或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核苷酸7643-8920，SEQIDNO:1的核苷酸16269-17546,SEQIDNO:1的核普酸21860-23116，SEQIDNO:1的核苷酸26318-27595，SEQIDNO:1的核香酸30815—32092,SEQIDNO:1的核苷酸37052-38320,SEQIDNO:1的核苷酸43626-44885，SEQIDNO:l的核苷酸48087-49361,和SEQIDNO:1的核苷酸55028-56284。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸7643-8920,SEQIDNO:1的核普酸16269-17546,SEQIDNO:1的核苷酸21860-23116,SEQIDNO:1的核苷酸26318-27595,SEQIDNO:1的核苷酸30815-32092,SEQIDNO:1的核苷酸37052-38320，SEQIDNO:1的核苷酸43626-44885,SEQIDNO:1的核苷酸48087-49361,和SEQIDNO:1的核苷酸55028-56284。根據另一個實施方案，印othilone合酶結構域是酰基轉移酶(AT)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸543-864，SEQIDNO:4的氨基酸539-859，SEQIDNO:5的氨基酸563-884,SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377，SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876，SEQIDNO:5的氨基酸5631-5951，SEQIDNO:6的氨基酸561-881，SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373,和SEQIDNO:7的氨基酸556-877。根據這個實施方案，優選所述AT結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸543-864，SEQIDNO:4的氨基酸539-859,SEQIDNO:5的氨基酸563_884，SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377，SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876，SEQIDNO:5的氨基酸5631-5951，SEQIDNO:6的氨基酸561-881，SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373，和SEQIDNO:7的氨基酸556-877。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸9236-10201，SEQIDNO:1的核苷酸17865-18827,SEQIDNO:1的核苷酸23431-24397，SEQIDNO:1的核苷酸27911-28876,SEQIDNO:1的核苷酸32408-33373，SEQIDNO:1的核苷酸38636-39598,SEQIDNO:1的核香酸45204-46166,SEQIDNO:l的核苷酸49680-50642,和SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565。根據這個實施方案，更優選所述核苷酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核苷酸9236-10201,SEQIDNO:l的核苷酸17865-18827,SEQIDNO:1的核苷酸23431-24397，SEQIDNO:1的核苷酸27911—28876，SEQIDNO:1的核苷酸32408-33373，SEQIDNO:1的核苷酸38636-39598，SEQIDNO:l的核苷酸45204-46166,SEQIDNO:1的核苷酸49680-50642，和SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸9236-10201，SEQIDNO:1的核普酸17865-18827,SEQIDNO:1的核苷酸23431—24397，SEQIDNO:1的核苷酸27911-28876，SEQIDNO:1的核苷酸32408-33373，SEQIDNO:1的核苷酸38636-39598,SEQIDNO:1的核普酸45204-46166,SEQIDNO:1的核苷酸49680-50642，和SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565。根據另一個實施方案，該印othilone合酶結構域是烯酰基還原酶(ER)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸974-1273,SEQIDNO:5的氨基酸4433-4719,SEQIDNO:5的氨基酸6542-6837，和SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790。根據這個實施方案，優選所述ER結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸974-1273，SEQIDNO:5的氨基酸4433-4719，SEQIDNO:5的氨基酸6542-6837，和SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790。而且，根據這個實施方案，優選所述核普酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸10529-11428，SEQIDNO:1的核苷酸35042-35902，SEQIDNO:1的核苷酸41369-42256，和SEQIDNO:1的核苷酸59366-60304。根據這個實施方案，更優選該核苷酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核普酸10529-11428，SEQIDNO:1的核苷酸35042-35902,SEQIDNO:1的核普酸41369-42256,和SEQIDNO:1的核苷酸59366-60304。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸10529-11428，SEQIDNO:1的核苷酸35042-35902,SEQIDNO:1的核苷酸41369-42256，和SEQIDNO:1的核苷酸59366-60304。根據另一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是酰基載體蛋白(ACP)結構域，其中所述多肽包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385，SEQIDNO:4的氨基酸1722-1792，SEQIDNO:5的氨基酸1434-1506,SEQIDNO:5的氨基酸2932-3005,SEQIDNO:5的氨基酸5010-5082，SEQIDNO:5的氨基酸7140-72U,SEQIDNO:6的氨基酸1430-1503，SEQIDNO:6的氨基酸3673-3745,和SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164。根據這個實施方案，優選所述ACP結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385，SEQIDNO:4的氨基酸1722-1792,SEQIDNO:5的氨基酸1434-1506，SEQIDNO:5的氨基酸2932-3005，SEQIDNO:5的氨基酸5010-5082，SEQIDNO:5的氨基酸7140-7211，SEQIDNO:6的氨基酸1430-1503，SEQIDNO:6的氨基酸3673-3745,和SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸11549-11764,SEQIDNO:1的核苷酸21414-21626，SEQIDNO:1的核苷酸26045-26263，SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991，SEQIDNO:1的核苷酸43163-43378，SEQIDNO:1的核苷酸47811-48032,SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758，和SEQIDNO:1的核苷酸61211-61426。根據這個實施方案，更優選所述核苷酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核苷酸11549-11764，SEQIDNO:1的核苷酸21414-21626，SEQIDNO:1的核苷酸26045-26263,SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991,SEQIDNO:l的核苷酸43163-43378，SEQIDNO:1的核苷酸47811-48032,SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758，和SEQIDNO:1的核苷酸61211-61426。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸11549-11764,SEQIDNO:1的核苷酸21414-21626,SEQIDNO:1的核苷酸26045-26263，SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991，SEQIDNO:1的核苷酸43163-43378，SEQIDNO:1的核苷酸47811-48032,SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758,和SEQIDNO:1的核苷酸61211-61426。根據另一個實施方案，所述epothilone合酶結構域是脫水酶(DH)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸869-1037，SEQIDNO:5的氨基酸3886-4048,SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132,SEQIDNO:6的氨基酸2383-2551，和SEQIDNO:7的氨基酸887-1051。根據這個實施方案，優選所述DH結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸869-1037,SEQIDNO:5的氨基酸3886-4048，SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132，SEQIDNO:6的氨基酸2383-2551，和SEQIDNO:7的氨基酸887-1051。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸18855-19361，SEQIDNO:1的核苷酸33401-33889,SEQIDNO:1的核苦酸39635-40141，SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176，和SEQIDNO:1的核苷酸57593-58087。根據這個實施方案，更優選所述核普酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核苷酸18855-19361，SEQIDNO:1的核苷酸33401-33889，SEQIDNO:1的核苷酸39635-40141，SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176，和SEQIDNO:1的核苷酸57593-58087.此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸18855-19361，SEQIDNO:1的核苷酸33401-33889，SEQIDNO:1的核苷酸39635-40141，SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176，和SEQID歐1的核普酸57593-58087。根據另一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是P-酮還原酶(KR)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸1439-1684，SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399，SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895，SEQIDNO:5的氨基酸4729_4974，SEQIDNO:5的氨基酸6857-7101，SEQIDNO:6的氨基酸1143-1393，SEQIDNO:6的氨基酸3392-3636，和SEQIDNO:7的氨基酸1810-2055。根據這個實施方案，優選所述KR結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸1439-1684,SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399，SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895，SEQIDNO:5的氨基酸4729-4974,SEQIDNO:5的氨基酸6857-7101,SEQIDNO:6的氨基酸1143-1393，SEQIDNO:6的氨基酸3392-3636，和SEQIDNO:7的氨基酸1810-2055。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302，SEQIDNO:1的核苷酸25184-25942，SEQIDNO:1的核苷酸29678-30429,SEQIDNO:1的核苷酸35930-36667，SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048,SEQIDNO:1的核苷酸46950-47702，SEQIDNO:1的核苷酸53697-54431，和SEQIDNO:1的核苷酸60362-61099。根據這個實施方案，更優選該核苷酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302,SEQIDNO:l的核苷酸25184-25942,SEQIDNO:1的核苷酸29678-30429，SEQIDNO:1的核苷酸35930-36667，SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048，SEQIDNO:1的核苷酸46950-47702，SEQIDNO:1的核苷酸53697-54431,和SEQIDNO:1的核普酸60362-61099。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302，SEQIDNO:1的核苷酸25184-25942,SEQIDNO:l的核苷酸29678-30429，SEQIDNO:1的核苷酸35930-36667，SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048，SEQIDNO:1的核苷酸46950-47702，SEQIDNO:1的核苷酸53697—54431，和SEQIDNO:1的核苷酸60362-61099。根據另一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是甲基轉移酶21(MT)結構域，其包含與SEQIDNO:6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。根據這個實施方案，優選所述MT結構域包含SEQIDNO:6的氨基酸2671-3045。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的核苷酸51534-52657基本相似。根據這個實施方案，更優選該核苷酸序列包含與SEQIDNO:1的核苷酸51534-52657中相應的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列是SEQIDNO:1的核苷酸51534-52657。根據另一個實施方案，所述鄰othilone合酶結構域是硫酯酶(TE)結構域，其包含與SEQIDNO:7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。根據這個實施方案，優選所述TE結構域包含SEQIDNO:7的氨基酸2165-2439。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的核苷酸61427-62254基本相似。根據這個實施方案，更優選該核苷酸序列包含與SEQIDNO:1的核苷酸61427-62254中相應的連續20、25、30、35、40、45或50(優逸20)個堿基對部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列是SEQIDNO:1的核苷酸61427-62254。在另一方面，本發明提供了分離的核酸分子，其包含編碼非核糖體肽合成酶的核苷酸序列，其中所述非核糖體肽合成酶包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:3,SEQIDNO:3的氨基酸72-81，SEQIDNO:3的氨基酸118-125,SEQIDNO:3的氨基酸199-212,SEQIDNO:3的氨基酸353-363,SEQIDNO:3的氨基酸549-565，SEQIDNO:3的氨基酸588-603,SEQIDNO:3的氨基酸669-684,SEQIDNO:3的氨基酸815-821,SEQIDNO:3的氨基酸868-892，SEQIDNO:3的氨基酸903-912,SEQIDNO:3的氨基酸918-940,SEQIDNO:3的氨基酸1268-1274，SEQIDNO:3的氨基酸1285-1297,SEQIDNO:3的氨基酸973-1256,和SEQIDNO:3的氨基酸1344-1351。根據這個實施方案，優選所述非核糖體肽合成酶包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:3，SEQIDNO:3的氨基酸72-81，SEQIDNO:3的氨基酸118-125，SEQIDNO:3的氨基酸199-212，SEQIDNO:3的氨基酸353-363，SEQIDNO:3的氨基酸549-565,SEQIDNO:3的氨基酸588-603，SEQIDNO:3的氨基酸669-684,SEQIDNO:3的氨基酸815-821，SEQIDNO:3的氨基酸868-892，SEQIDNO:3的氨基酸903-912，SEQIDNO:3的氨基酸918-940，SEQIDNO:3的氨基酸1268_1274，SEQIDNO:3的氨基酸1285-1297，SEQIDNO:3的氨基酸973-1256，和SEQIDNO:3的氨基酸1344-1351。而且，根據這個實施方案，優選所述核苷酸序列與選自下組的核苷酸序列基本相似SEQIDNO:1的核苷酸11872-16104,SEQIDNO:1的核苷酸12085-12114,SEQIDNO:1的核苷酸12223-12246，SEQIDNO:1的核苷酸12466-12507，SEQIDNO:1的核苷酸12928-12960，SEQIDNO:1的核苷酸13516-13566,SEQIDNO:1的核普酸13633-13680,SEQIDNO:1的核普酸13876-13923，SEQIDNO:1的核苷酸14313-14334，SEQIDNO:1的核苷酸14473-14547,SEQIDNO:1的核苷酸14578-14607，SEQIDNO:1的核苷酸14623-14692,SEQIDNO:1的核苷酸15673-15693,SEQIDNO:1的核苷酸15724-15762,SEQIDNO:1的核苷酸14788-15639，和SEQIDNO:1的核苷酸15901-15924。根據這個實施方案，更優選該核苷酸序列包含與選自下組的核苷酸序列中相應的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的部分序列相同的連續20、25、30、35、40、45或50(優選20)個堿基對的核苷酸部分SEQIDNO:1的核苷酸11872-16104，SEQIDNO:1的核苷酸12085-12114，SEQIDNO:1的核苷酸12223-12246，SEQIDNO:1的核苷酸12466-12507，SEQIDNO:1的核苷酸12928_12960，SEQIDNO:1的核苷酸13516_13566，SEQIDNO:1的核苷酸13633-13680,SEQIDNO:1的核苷酸13876-13923，SEQIDNO:1的核苷酸14313-14334，SEQIDNO:1的核苷酸14473-14547，SEQIDNO:1的核苷酸14578-14607，SEQIDNO:1的核苷酸14623-14692，SEQIDNO:1的核苷酸15673-15693，SEQIDNO:1的核苷酸15724-15762，SEQIDNO:1的核苷酸14788-15639，和SEQIDNO:1的核苷酸15901-15924。此外，根據這個實施方案，最優選該核苷酸序列選自下組SEQIDNO:l的核香酸11872-16104，SEQIDNO:1的核苷酸12085-12114,SEQIDNO:1的核苷酸12223-12246，SEQIDNO:1的核苷酸12466-12507,SEQIDNO:1的核苷酸12928-12960,SEQIDNO:1的核普酸13516-13566，SEQIDNO:1的核普酸13633-13680，SEQIDNO:1的核苷酸13876-13923，SEQIDNO:1的核苷酸14313—14334，SEQIDNO:1的核苷酸14473-14547，SEQIDNO:1的核苷酸14578-14607，SEQIDNO:1的核苷酸14623-14692,SEQIDNO:1的核苷酸15673-15693,SEQIDNO:1的核苷酸15724-15762,SEQIDNO:1的核苷酸14788-15639,和SEQIDNO:1的核苷酸15901-15924。本發明還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼包括選自SEQIDNO:2-23的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。根據另一方面，本發明還提供了用于重組生產聚酮化合物諸如epothilone的方法，其生產產量足夠用于它們的純化和藥用制劑諸如用于治療癌癥。這些生產方法的特殊優勢是產生的分子有手性；在轉基因有機體中進行生產，避免了產生大量的外消旋混合物，其中一些對映體可能具有降低的活性。特別的，本發明提供了在重組宿主中異源表達印othilone的方法，包括(a)將包含與本發明的核酸分子(其包括編碼至少一種涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列)可搡作連接的異源啟動子序列的嵌合基因導入宿主；和(b)在適合宿主中生物合成epothilone的條件下培養宿主。本發明還提供了生產epothilone的方法，包括(a)用上述方法在重組宿主中表達epothilone;和(b)從重組宿主中提取epothilone。根據另一方面，本發明提供了一種分離的多肽，其包括由epothilone合酶結構域組成的氨基酸序列。根椐一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是P-酮脂酰合酶(KS)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸11-437,SEQIDNO:4的氨基酸7-432，SEQIDNO:5的氨基酸39-457，SEQIDNO:5的氨基酸1524-1950，SEQIDNO:5的氨基酸3024-3449，SEQIDNO:5的氨基酸5103-5525，SEQIDNO:6的氨基酸35-454，SEQIDNO:6的氨基酸1522-1946,和SEQIDNO:7的氨基酸32-450。根據這個實施方案，優選所述KS結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸11-437，SEQIDNO:4的氨基酸7-432，SEQIDNO:5的氨基酸39-457，SEQIDNO:5的氨基酸1524-1950，SEQIDNO:5的氨基酸3024-3449，SEQIDNO:5的氨基酸5103-5525,SEQIDNO:6的氨基酸35-454，SEQIDNO:6的氨基酸1522-1946,和SEQIDNO:7的氨基酸32-450。根據另一個實施方案，所述epothilone合酶結構域是酰基轉移酶(AT)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸543-864，SEQIDNO:4的氨基酸539-859,SEQIDNO:5的氨基酸563-884，SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377,SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876，SEQIDNO:5的氨基酸5631-5951，SEQIDNO:6的氨基酸561-881,SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373，和SEQIDNO:7的氨基酸556-877。根據這個實施方案，優選所述AT結構域包i選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸543-864，SEQIDNO:4的氨基酸539-859,SEQIDNO:5的氨基酸563-884，SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377，SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876，SEQIDNO:5的氨基酸5631-5951，SEQIDNO:6的氨基酸561-881，SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373，和SEQIDNO:7的氨基酸556-877。根據另一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是烯酰基還原酶(ER)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸974-1273，SEQIDNO:5的氨基酸4433-4719,SEQIDNO:5的氨基酸6542-6837，和SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790。根據這個實施方案，優選該ER結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸974-1273，SEQIDNO:5的氨基酸4433-4719，SEQIDNO:5的氨基酸6542-6837，和SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790。根據另一個實施方案，所述印othilotie合酶結構域是酰基載體蛋白(ACP)結構域，其中所述多肽包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385，SEQIDNO:4的氨基酸1722-1792，SEQIDNO:5的氨基酸1434-1506，SEQIDNO:5的氨基酸2932-3005，SEQIDNO:5的氨基酸5010-5082，SEQIDNO:5的氨基酸7140-7211，SEQIDNO:6的氨基酸1430-1503,SEQIDNO:6的氨基酸3673—3745，和SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164。根據這個實施方案，優選所述ACP結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385，SEQIDNO:4的氨基酸1722-1792，SEQIDNO:5的氨基酸1434-1506，SEQIDNO:5的氨基酸2932-3005,SEQIDNO:5的氨基酸5010-5082,SEQIDNO:5的氨基酸7140-7211,SEQIDNO:6的氨基酸l楊-1503，SEQIDNO:6的氨基酸窗3-3745，和SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164。根據另一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是脫水酶(DH)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸869-1037，SEQIDNO:5的氨基酸3886-4048，SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132,SEQIDNO:6的氨基酸2383-2551，和SEQIDNO:7的氨基酸887-1051。根據這個實施方案，優選所述DH結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸869-1037，SEQIDNO:5的氨基酸3886-4048，SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132，SEQIDNO:6的氨基酸2383-2551，和SEQIDNO:7的氨基酸887-1051。根據另一個實施方案，所迷epothilone合酶結構域是P-飼還原酶(KR)結構域，其包含與選自下組的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸1439-1684,SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399，SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895,SEQIDNO:5的氨基酸4729-4974，SEQIDNO:5的氨基酸6857-7101，SEQIDNO:6的氨基酸1143-1393，SEQIDNO:6的氨基酸3392-3636，和SEQIDNO:7的氨基酸1810-2055。根據這個實施方案，優選所述KR結構域包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸1439-1684,SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399,SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895，SEQIDNO:5的氨基酸4729-4974，SEQIDNO:5的氨基酸6857-7101,SEQIDNO:6的氨基酸1143-1393，SEQIDNO:6的氨基酸3392-3636，和SEQIDNO:7的氨基酸1810-2055。根據另一個實施方案，所述印othilone合酶結構域是甲基轉移酶(MT)結構域，其包含與SEQIDNO:6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。根據這個實施方案，優選所述MT結構域包含SEQIDNO:6的氨基酸2671-3045。根據另一個實施方案，所述epothilone合成酶結構域是>^醋酶(TE)結構域，其包含與SEQIDNO:7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。根據這個實施方案，優選所述TE結構域包含SEQIDNO.-7的氨基酸2165-2439。本發明的其它方面和優點對于那些本領域的技術人員，在研究了本發明的下列描述和非限制性實施例后將是顯而易見的。定義在本發明的描述中，將使用下列術語，并做如下定義。相關聯/可操作連接指物理或功能相關的兩種DNA序列。例如，如果將啟動子或調控DNA序列與編碼RNA或蛋白質的DNA可操作連接或放置，以至于調控DNA序列將影響編碼或結構DNA序列的表達水平，則該啟動子或調控序列被認為是與該DNA序列"相關聯"。嵌合基因重組DNA序列，其中啟動子或調控DNA序列與編碼mRM或表達為蛋白質的DNA序列可搡作連接，或與之相關聯，以至于調控DNA序列能夠調控該相關聯的DNA序列的轉錄或表達。正如在自然界中發現的，嵌合基因的調控DNA序列通常不與該相關聯的DNA序列可操作連接的。編碼DNA序列在有機體中翻譯成蛋白質的DNA序列。結構域聚酮化合物合酶中對于特定的獨特活性必需的那部分。例子包括酰基栽體蛋白(acylcarrierprotein,ACP)、P-酮合酶(P-ketosynthase，KS)、酰基轉移酶(acyltransferae，AT)、0-酮還原酶(p-ketoreductase,KR)、脫水酶(dehydratase,DH)、烯敞基還原酶(e呵lreductase，ER)、和硫酯酶(thioesterase,TE)結構域。Epothilone:由細菌纖維堆嚢菌菌抹Soce90天然產生的16元大環聚酮化合物，模仿紫杉醇的生物學效應。在本申請中，"epothilone"指聚酮化合物類，包括epothiloneA和epothiloneB，以及它們的類似物T者如WO98/25929中描迷的那些。Epothilone合酶負責印othilone生物合成的聚酮化合物合酶。基因位于基因組內，除了上述編碼DNA序列，還包括主要是調控DNA序列(負責調控編碼DNA序列的表達即轉錄和翻譯的DNA序列)的確定區域。異源DNA序列與導入的宿主細胞天然不相關聯的DNA序列，包括天然DNA序列的非自然產生的多拷貝。同源DNA序列與導入的宿主細胞天然相關聯的DNA序列。同源重組同源DM分子之間互相交換DNA片段。分離的在本發明的內容中，分離的核酸分子或分離的酶是由人工實現，脫離其自然環境存在并因而不是天然產物的核酸分子或酶。分離的核酸分子或酶可以以純化形式存在，或者可以在非天然環境諸如重組宿主細胞中存在。模塊編碼單輪聚酮化合物生物合成(即一個縮合步驟和所有與此有關的P-羰基處理步驟)需要的所有獨特活性的基因元件。每個模塊編碼ACP、KS、和AT活性以實現生物合成的縮合部分，編碼選定的縮合后活性以進行P-羰基處理。NRPS:非核糖體多肽合成酶，是負責將氨基酸加入到次級代謝物中的酶活性，包括，例如，氨基酸腺苷酸化、異構化、N-甲基化、環化、肽酰基載體蛋白、和縮合結構域的復合物。有功能的NRPS催化將氨基酸加入到次級代謝物中。NRPS基因編碼在一個或多個相容的控制元件的指導下產生有功能的次級代謝物(例如印othiloneA和B)的NRPS的一個或多個基因。核酸分子可以從任何來源分離的單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性片段。在本發明的內容中，核酸分子優選是DNA片段。ORF:開放閱讀框架。PKS:聚酮化合物合酶，是負責聚酮化合物生物合成的酶活性(結構域)，包括，例如酮還原酶、脫水酶、跣基載體蛋白、烯酰基還原酶、酮脂酰ACP合酶、和酰基轉移酶的復合物。有功能的PKS催化聚酮化合物的合成。PKS基因當在一個或多個相容的控制元件的指導下，編碼產生有功能的聚酮化合物(如印othiloneA和B)需要的各種多肽的一個或多個基因。基本相似對于核酸，是指具有與參考核酸分子至少60%序列相同的核酸分子。在優逸的實施方案中，基本相似的DNA序列與參考DNA序列至少80%相同；在更優選的實施方案中，基本相似的DNA序列與參考DNA序列至少90%相同；而在最優選的實施方案中，基本相似的DNA序列與參考DNA序列至少95%相同。基本相似的DNA序列優選編碼具有與參考DNA序列編碼的蛋白質或肽基本相同活性的蛋白質或肽。基本相似的核苷酸序列通常可與參考核酸分子或它們的片段在下列條件下雜交在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04pH7.0、lmMEDTA中于50"C雜交；用2xSSC、1%SDS于50X3漂洗。對于蛋白質或肽，基本相似的氨基酸序列是與參考蛋白質或肽的氨基酸序列至少90%相同而且具有與參考蛋白質或肽基本相同活性的氨基酸序列。轉化將異源核酸導入宿主細胞或有機體的過程。經轉化的/轉基因的/重組的指已經導入了異源核酸分子的宿主有機體諸如細菌。核酸分子可以穩定的整合到宿主的基因組中，或者核酸分子也可以作為染色體外分子存在。這樣的染色體外分子可以自主復制。經轉化的細胞、組織、或植抹應理解為不僅包含轉化過程的終產物，而且還有它的轉基因后代。"非轉化的"、"非轉基因的"、或"非重組的"宿主指野生型有機體，即細菌，其中不含有異源核酸分子。核苷酸由它們的堿基依照下列標準縮寫表示腺噤呤(adenine,A)，胞嘧咬(cytosine,C)，胸腺嘧咬(thymine,T)，和鳥噤呤(guanine,G)。氨基酸類似的依照下列標準縮寫表示丙氨酸(alanine;Ala;A)，精氛酸(arginine;Arg;R),天冬耽胺(asparagine;Asn;N)，天冬氨酸(asparticacid;Asp;D)，半胱氨酸(cysteinesCysiC),谷氨酰胺(glutamine;Gin;Q)，谷氨酸(glutamicacid;Glu;E)，甘氨酸(glycine;Gly;G)，組氨酸(histidine;His;H)，異亮氨酸(isoleucine;lie;I)，亮氨酸(leucine;Leu;L)，賴氨酸(lysine;Lys;K)，甲疏氨酸(methionine;Met;M),笨丙氨酸(phenylalanine;Phe;F)，脯氨酸(proline;Pro;P)，絲氨酸(serine;Ser;S)，蘇氨酸(threonine;Thr;T)，色氨酸(trytophan;Trp;W)，酪氨酸(tyrosine;Tyr;Y)，和纈氨酸(valine;Val;V)。此外，(Xaa;X)代表任何氨基酸。序列表中序列的描述SEQIDNO:1是含有22個開放閱讀框架(ORF)的68750bp毗連序列群的核苷酸序列，包括epothilone生物合成基因。SEQIDNO:2是由e/wA(SEQIDNO:1的核普酸7610-11875)編碼的第一類聚酮化合物合酶(EPOSA)的蛋白質序列。SEQIDNO:3是由epoP(SEQIDNO:1的核苷酸11872_16104)編碼的非核糖體肽合成酶(EPOSP)的蛋白質序列。SEQIDNO:4是由印oB(SEQIDNO:1的核苷酸16251-21749)編碼的第一類聚酮化合物合酶(EPOSB)的蛋白質序列。SEQIDNO:5是由印oC(SEQIDNO:1的核苷酸21746-43519)編碼的第一類聚酮化合物合酶(EPOSC)的蛋白質序列。SEQIDNO:6是由e/wD(SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920)編碼的第一類聚酮化合物合酶(EPOSD)的蛋白質序列。SEQIDNO:7是由e/wE(SEQIDNO:1的核苷酸54935-62254)編碼的第一類聚酮化合物合酶(EPOSE)的蛋白質序列。SEQIDNO:8是由印oF(SEQIDNO:1的核苷酸62369-63628)編碼的細胞色素P450加氧酶同源物(EPOSF)的蛋白質序列。SEQIDNO:9是由aril(SEQIDNO:1的核苷酸1-1826)編碼的部分蛋白質序列(部分Orfl)。SEQIDNO:10是由ar/2(SEQIDNO:1反向互補鏈的核苷酸3171-1900)編碼的蛋白質序列(Orf2)。SEQIDNO:11是由(SEQIDNO:1的核苷酸3415-5556)編碼的蛋白質序列(Orf3)。SEQIDNO:12是由or/4(SEQIDNO:1反向互補鏈的核苷酸5992-5612)編碼的蛋白質序列(0rf4)。SEQIDNO:13是由or巧(SEQIDNO:1的核苷酸6226-6675)編碼的蛋白質序列(Orf5)。SEQIDNO:14是由ar/6(SEQIDNO:1的核苷酸63779-64333)編碼的蛋白質序列(Orf6)。SEQIDNO:15是由(SEQIDNO:1反向互補鏈的核苷酸64290-63853)編碼的蛋白質序列(Orf7)。SEQIDNO:16是由(SEQIDNO:1的核苷酸64363-64920)編碼的蛋白質序列(Orf8)。SEQIDNO:17是由ar/9(SEQIDNO:1反向互補鏈的核苷酸64727-64287)編碼的蛋白質序列(Orf9)。SEQIDNO:18是由(SEQIDNO:1的核苷酸65063-65767)編碼的蛋白質序列(OrflO)。SEQIDNO:19是由(SEQIDNO:l反向互補鏈的核普酸65874-65008)編碼的蛋白質序列(Orfll)。SEQIDNO:20是由(SEQIDNO:1反向互補鏈的核苷酸66338-65871)編碼的蛋白質序列(Orfl2)。SEQIDNO:21是由(SEQIDNO:1的核苷酸66667-67137)編碼的蛋白質序列(Orfl3)。SEQIDNO:22是由(SEQIDNO:1的核苷酸67334-68251)編碼的蛋白質序列(Orfl4)。SEQIDNO:23是由(SEQIDNO:1的核苷酸68346-68750)編碼的部分蛋白質序列(部分Orfl5)。SEQIDNO:24是通用的反向PCR引物序列。SEQIDNO:25是通用的正向PCR引物序列。SEQIDNO:26是NH24末端"B"PCR引物序列。SEQIDNO:27是NH2末端"A"PCR引物序列。SEQIDNO:28是NH2末端"B"PCR引物序列。SEQIDNO:29是pEP015-NH6"B"PCR引物序列。SEQIDNO:30是pEP015-H2.7"A"PCR引物序列。保藏信息下列物質已依照國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，已經儲存于農業研究才;i^J保藏中心(NRRL),1815N.UniversityStreet,Peoria,伊利諾斯州61604。所有對獲取保藏物的限制在取得專利的授;(5U^將消除。保藏物保藏號EscherichiacoliDH10B|pEPO15|NRRLB-30033EscherichiacoliDH10BpEPO32|NRRLB-30119儲存日期1998年6月11日1999年4月16日圖1是實施例14中所述的100升發酵的接種鏈示意圖發明的詳細描述可以使用本發明的技術分離得到涉及印othilone生物合成的基因。分離印othilone生物合成基因的優逸步驟，需要從經筌定產生epothiloneA和B的有機體中分離基因組DNA，并將分離的合適質粒或載體上的DNA轉移到通常不產生聚酮化合物的宿主有機體中，隨后鑒定具有epothilone生產能力的經轉化的宿主菌落。使用諸如入Tn5轉座子誘變(deBruijn和L叩ski，(C朋e)27:131-149(1984))技術，轉化的賦予epothilone的DNA的精確區域可以更準確確定。可替代地或額外地，可以將轉化的賦予印othilone的DNA切割成較小的片段，而且可以進一步鑒定維持授予印othilcme能力的最小片段。然而，缺乏epothilone生產能力的宿主有機體可能是與產生聚酮化合物的物種不同的物種，這種技術的變更涉及將宿主DNA轉化到epothilone生產能力已經被誘變破壞的相同宿主中。在這種方法中，產生epothilone的有機體被突變了，并分離得到不產生epothilone的突變體。然后將這些突變體用從產生epothilone的親本菌抹中分離的基因組DM彌補。可以用來分離印othilone生物合成需要的基因的進一步的實例，是使用轉座子誘變來產生產生印othilone的有機體的突變體，其被誘變后不能產生聚酮化合物。這樣，宿主基因組負責產生印othilone的區域被轉座子標以標簽，而且可以回收并作為探針使用來從親代菌抹中分離天然基因。由于它們與序列已知的生物合成基因諸如利福霉素或soraphen生物合成的PKS基因的序列同源性，可以分離得到合成聚酮化合物需要的、且與已知的PKS基因相似的PKS基因。利用同源性的合適分離技術，包括由DNA雜交進行常規文庫篩選。可以從在已知聚酮化合物合成中起作用的基因或其它DNA序列中得到的DNA片段，作為優選的探針分子使用。一種優選的探針分子包括編碼soraphenPKS第四個模塊的嗣合酶結構域的1.2kbSmaIDNA片段(美國專利號5,716,849)，更優選的探針分子包括利福霉素PKS第一和第二模塊的P-酮脂酰合酶結構域(Sch叩p等人，/^￥5"凝^參遞該159:201-207(1998))。這些探針可以用來探測產生印othilone的徵生物的基因庫，以分離負責epothilone生物合成的PKS基因。盡管眾所周知分離PKS基因通常很困難，盡管預期分離印othilone生物合成基因將特別困難，通過使用此說明書中描述的方法，可以令人驚訝的從產生epothiloneA和B的微生物中克隆得到該聚酮化合物的生物合成基因。使用此說明書中描述的基因操作的方法和重組產物，可以修飾和在轉基因宿主有機體中表達被克隆的PKS基因。可以在異源宿主中表達分離的epothilone生物合成基因，以比天然宿主更高效的生產聚嗣化合物。用于這些基因操作的技術，對于不同的可獲得的宿主是特異的，而且本領域的技術人員是知道的。例如，使用諸如那些描述于McDaniel等人，存夢(5"cie/ce)262:1546-1550(1993)和Kao等人，存夢265:509-512(1994)(此處引用作為參考)的技術，可以在鏈霉菌和其它放線菌中表達異源基因。還可見，Rowe等人，差欲("e)216:215-226(1998);Holmes等人，欽浙為、fi參夢染'悉(E,Journal)12(8):3183-3191(1993)和Bibb等人，差^38:215-226(1985)，此處引用作為參考。或者，還可以在其它宿主有機體諸如假單胞菌和大腸桿菌中表達負責聚酮化合物生物合成的基因，即印othilone生物合成基因。用于這些基因操作的技術對于不同的可獲得的宿主是特異的，而且本領域的技術人員是知道的。例如，使用pT7-7載體(使用T7啟動子)，已經在大腸桿菌中成功的表達了PKS基因。見，Tabor等人，美萄歸家f/夢潔jfv^(尸roc.yVat丄5b厶〃S/4)82:1074—1078(1985)，此處引用作為參考。此外，可以用表達載體pKK223-3和pKK223-2在大腸桿菌中表達異源基因，或以轉錄或以翻譯融合方式，在^c或trc啟動子之后。對于編碼多0RF的操縱子的表達，最筒單的步驟是以轉錄融合方式將搡縱子插入到載體諸如pKK223-3中，使得能夠使用異源基因的同類核糖體結合位點。用于在革蘭氏陽性物種諸如芽孢桿菌中過量表達的技術，本領域的技術人員也是知道的，而且可以用于本發明中(Quax等人，工A凝^參夢差磁;^應^為、f編輯Baltz等人，美國微生物學學會，華盛頓(1993))。其它可以與本發明的印othilone生物合成基因使用的表達系統，包括酵母和桿狀病毒表達系統。見，例如，"重組蛋白質在酵母中的表達"，P.E.Sudbery，^參炎^^^/f魔,《(O/rr.6Jpj7z.iWotec力/7o入)7(5):517-524(1996);"在酵母中表達重組蛋白質的方法"，Mackay等人，編輯PaulR.Carey，f冷#工程^論(/^"ei"Zes.)IO5-153,出版商Academic,圣地亞哥，加利福尼亞(1996);"異源基因產物在酵母中的表達"，Pichuantes等人，編輯J.L.Cleland,C.S.Craik，f(尸jr"ei/7&2《，)129-161,出版商Wiley-Liss,紐約，紐約(1996);W098/27203;Kealey等人，美腐存夢潔遽>度95:505-509(1998);"昆蟲細胞培養蛋白質生產的最新進展，生物工程挑戰和意義"，Palomares等人，編輯EnriqueGalindo;OctavioT.Ramirez,毐斂4:參工程(Jc/r.^z'o/urocess)第2巻，InvitedPap.Int.Symp.，第二版(1998)25—52，出版商Kluwer，Dordrecht,Neth;"桿狀病毒表達載體"，DonaldLJarvis,編輯LoisK.Miller,桿狀病毒(Baculovir騰s)389-431,出版商Plenum,紐約，紐約(1997);"使用桿狀病毒/昆蟲表達系統生產異源蛋白質"，Grittiths等人，為、f^:參夢才法(j〖fetAoofeifo丄A/o/,)(N.J.Totowa)75(基礎細胞培養方案(第二版))427-440(1997);和"昆蟲細胞表達技術"，VerneA.Luckow，f冷產工資183-218，出版商Wiley-Liss，紐約，紐約(1996);所有文獻均此處引用作為參考。在異源宿主中表達PKS基因的另一個要考慮的問題，是PKS酶的翻譯后修飾(在它們能夠合成聚酮化合物之前要磷酸泛酰巰基乙胺基化)需要酶。然而，負責第一類PKS酶的這種修飾的酶，磷酸泛酰巰基乙胺基(P-pant)轉移酶在許多宿主諸如大腸桿菌中通常不存在。這個問題可以通過P-pant轉移酶與PKS基因在異源宿主中的共表達解決，如Kealey等人，美塚萄家存夢應迷雇95:505-509(1998)描述的，此處引用作為參考。因此，為了生產聚酮化合物，選擇宿主有機體的重要標準是它的搡作容易，生長(即發酵)迅速，擁有適當的加工諸如翻譯后修飾的分子機制，和對過量表達聚嗣化合物不敏感。最優選的宿主有機體是放線菌諸如鏈霉菌菌抹。其它優選的宿主有機體是假單胞菌和大腸桿菌。生產聚酮化合物的上述方法比制備該類化合物使用的現行技術具有明顯優勢。這些優勢包括生產成本更低，生產更大量的化合物的能力，和生產優選生物學對映體的化合物的能力，這與有機合成生產不可避免的外消旋混合物相反。由異源宿主產生的化合物可以用于醫療(例如用epothilone治療癌癥)以及農業應用。本發明將由下列詳細實施例作為參考進一步描述。提供這些實施例只是為了例證，而并不是為了限制(除非特殊說明)。此處使用的常規重組DNA和分子克隆技術是本領域的技術人員熟知的，而且由A謹bel(編輯)，》、fi參夢應/ff,(6to"朋f尸r"歸i5r//ifo/ecf/7ar歷Wo^x)，JohnWileyandSonsInc.(1994);T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，》子^發關發皇手if(#o7ecu7ar67朋i/《.']Za6ojrator,ife/7肪"，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989);和T.J.Silhavy，M丄Ber隨，和L.W.Enquist,差掛嚴合實發(fx/er/范e"tsr/WCe/e尸";i0/2)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1994)描述。實施例1:生產epothilone的纖維堆嚢菌菌抹的培養將纖維堆嚢菌菌抹90(DSM6773，DeutscheS鵬lungvonMikroorganismenundZellkulturen，Braunschweig)在SolE培養基(0.35%葡萄糖，0.05%胰蛋白胨，0.15%MgS04'7H20，0.05%硫酸銨，0.l%CaCl2，0.006%K2HP04，0.01%連二亞硫酸鈉，0.0008%Fe-EDTA,1.2%ffi)PES，3.5%[vol/vo/]經滅菌的穩定期纖維堆嚢菌培實驗養物的上清液)pH調到7.4的瓊脂平板上劃線，并于30t:培養。挑取來自lcm2的細胞，接種到5mlG51t液體培養基(0.2%葡萄糖，0.5%淀粉，0.2%胰蛋白胨，0.l%probionS，0.05%CaCl2-2H20，0.05%MgS04.7H20，1.2°/。HEPES，pH調到7.4)中，并于30X:振搖225rpm培養。4天后，將培養物轉移到50mlG51t中，并如上所述培養5天。用此培養物接種500mlG51t，并如上所述培養6天。將此培養物以4000rpm離心10分鐘，并將細胞沉淀重懸于50mlG51t中。實施例2:細菌人工染色體文庫的構建為了構建Bac文庫，將如實施例1所述培養的纖維堆嚢菌細胞包埋于瓊脂糖塊中，裂解，并將釋放出來的基因組DNA用限制酶i^7K/m部分消化。在瓊脂糖凝膠上用脈沖電泳分離經消化的DNA。從瓊脂糖凝膠中分離大片段DNA(大約90-150kb),并連接到載體pBelobacH中。pBelobacII包含編碼氯霉素抗性的基因、位于7acZ基因中在適當培養基上提供藍白斑選擇的多克隆位點、以及復制和在每個細胞中維持一個或兩個質粒拷貝需要的基因。使用常規電穿孔技術，將連接混合物轉化大腸桿菌DH10B電感受態細胞。將氯霉素抗性重組體(白斑、7acZ突變)菌落轉移到帶正電的3843x3柵格的尼龍濾膜上。裂解克隆并將DNA交聯到濾膜上。將同一克隆以液體培養物的形式保存于-80x:。實施例3:在纖維堆嚢菌90的Bac文庫中篩選第一類聚酮化合物合酶的相關序列使用常規Southern雜交步驟探測Bac文庫濾膜。使用的探針編碼利福霉素聚酮化合物合酶第一和第二模塊的P-酮脂酰合酶結構域(Sch叩p等人，/^KS"微^:務夢遞訊159:210-207(1998))。以質粒pNE95(pNE95即Schupp等人(1998)中描述的粘粒2)作為模板，使用每個酮合酶結構域兩側的引物通過PCR產生探針DNA。從0.5%瓊脂糖凝膠分離得到25ngPCR擴增的DNA，并使用隨機引物標記試劑盒(Gibco-BRL，Methesda，MD，美國)按照供應商的指示用32P-dCTP標記。雜交于65t:進行36小時，并在高度嚴謹條件下洗膜(0.lxSSC和0.5%SDS于65X320分鐘3次)。將經標記的斑點暴露于磷光屏上，并在Phospholoiager445SI上檢測信號(屏和445SI購自MolecularDynamics)。結果某些Bac克隆與探針強雜交。選擇這些克隆，并在5mlLuria肉湯(LB)培養基中于37C培養過夜。使用典型的微量制備步驟，從感興趣的Bac克隆中分離BacDNA。將細胞重懸于200/il溶菌酶溶液(50mM葡萄糖，10mMEDTA,25mMTris-HCl，5mg/ml溶菌酶)，在400nl裂解液(0.2NNaOH和2。/oSDS)中裂解，沉淀蛋白質(3,0M醋酸鉀，用乙酸調到pH5.2),并用異丙醇沉淀BacDNA。將DNA重懸于20n1無核酸酶的蒸餾水中，用i9a/8HI(NewEnglandBiolabs,Inc.)限制酶消化，并在0.7%瓊脂糖凝膠上分離。如上所述通過Southern雜交將凝膠轉膜，并在如上所迷的條件下用編碼sor鄰hen聚酮化合物合酶第四模塊的酮合酶結構域的1.2kb5"邁alDNA片段作為探針(見，美國專利號5,716，849)探測。觀察到五個不同的雜交樣式。每種選擇一個克隆作為代表，并分別命名為pEP015、pEP020、pEP030、pEP031、和pEP033。實施例4:pEP015、pEP020、pEP030、pEP031、和pEP033的片段的亞克隆用&威I消化五個選擇的Bac克隆的DNA，并將隨機片段亞克隆到pBluescriptIISK+(Stragagene)的I位點。選擇插入片段大小在2-10kb之間的亞克隆，以測定插入片段兩側末端的序列，并且還用如上所述的1.25"邁al探針探測。將與已知聚酮化合物合酶具有高度序列同源性和/或與soraphen酮合酶結構域強雜交的亞克隆用于基因破壞實驗。實施例5:制備纖維堆嚢菌菌抹Soce90的鏈霉素抗性自發突變體取0,lml纖維堆嚢菌菌抹Soce90在液體培養基G52-H(0.2%酵母提取物，0.2%脫脂大豆粉，0.8%土豆淀粉，0.2%葡萄糖，0.1%MgS04-7H20,0.l%CaCl2.2H20,0.008%Fe-EDTA,用KOH調到pH7.4)中培養3天的培養物，鋪在添加lOOng/ml鏈霉素的SolE培養基瓊脂平板上。平板于30i:培養2星期。生長在這種培養基上的菌落是鏈霉素抗性的突變體，將其在含鏈霉素的相同瓊脂培養基上劃線并再一次培養以純化。選擇這些鏈霉素抗性突變體中的一個，并命名為BCE28/2。實施例6:纖維堆嚢菌BCE28/2中的基因破壞(使用亞克隆的&/hHI片段)分離如上所述由五個選擇的Bac克隆產生的亞克隆的5a/HI插入片段，并連接到質粒pCIB132(見美國專利號5,716，849)的單一5afflHI位點。將攜帶插入片段的pCIB132衍生物轉化含輔助質粒pUZ8的大腸桿菌ED8767(Hedges和Matthew,|在(尸7雄jtV)2:269-278(1979))。使用轉化體作為接合實驗中的供體，而纖維堆嚢菌BCE28/2作為受體。為了接合，將5-10xl(f個在液體培養基G51b(G51b相當于G51t，其中用蛋白胨替代胰蛋白胨)中于30K培養的纖維堆嚢菌BCE28/2穩定期早期培養物(達到大約5xl()8細胞/inl)，以1:1的細胞比率，與含pCIB132衍生物(攜帶亞克隆的"aMU片段)和輔助質粒pUZ8的大腸桿菌ED8767的指數晚期培養物(在LB液體培養基中)混合。然后將混合的細胞以4000rpm離心IO分鐘，并重懸于0.5mlG51b培養基中。然后將此細胞懸浮液滴一滴在含50mg/l卡那霉素的SolE瓊脂平板的中央鋪板。于30TC培養24小時后收獲細胞，并重懸于0.8mlG51b培養基，并將O.1-0.3ml此懸浮液在含腐草霉素(30mg/l)、鏈霉素(300mg/1)、和卡那霉素(50mg/1)的選擇性SolE固體培養基上鋪板。使用鏈霉素進行供體大腸桿菌菌抹的負選擇。于30C培養8-12天后，用塑料環分離生長在這種選擇培養基上的菌落，并在相同瓊脂培養基上劃線和培養以進行第二輪選擇和純化。于30"培養7天后生長在此選擇瓊脂培養基上的菌落衍生的培養物，是通過攜帶亞克隆5a/nHI片段的pCIB132衍生物的接合轉移獲得了腐草霉素抗性的纖維堆嚢菌BCE28/2的轉接合體。通過Southern雜交檢驗證實pCIB132衍生的質粒通過同源重組整合到了纖維堆嚢菌BCE28/2的染色體中。為了這個實驗，應用Pospiech和Neumann,r_re"A^e/",11:217(1995)描述的方法，每種轉移I片段的轉接合體取5-10個分離完整DNA(于培養基G52-H中生長了3天的10ml培養物)。為了Southern雜交轉膜，將如上所述分離的DNA用限制酶石^H、67al、或AbtI切割，并使用相應的5a/aHI插入片段或pCIB132作為32P標記的探針。實施例7:分析整合的AaMU片段對纖維堆嚢菌在基因破壞后對印othilone生產的影響用無菌塑料環將生長在第二輪選擇的選擇性SolE平板表面上大約lci^的轉接合細胞(見實施例6)轉移到10mlG52-H培養基中(裝在50ralErlenmeyer燒瓶中)。于30"C和180rpm培養3天后，將培養物轉移到50mlG52-H培養基中(裝在200mlErlenmeyer燒瓶中)于30"C和180rpm培養4-5天后，將10ml此培養物轉移到50膽12犯3培養基(0.2%葡萄糖，2%土豆淀粉，1.6%脫脂大豆粉，0.0008%Fe-EDTA鈉鹽，0.5%服PES(4-(2-羥乙基)-派溱-1-乙烷磺酸)，2%vol/vol聚苯乙烯樹脂XAD16(Rohm和Haas),用NaOH調pH到7.8)中(裝在200mlErlenmeyer燒瓶中)。培養物于30t:和180rpm培養7天后，進行產生的印othilone的定量實驗。將全部培養液通過150nm尼龍濾膜抽濾過濾。然后將留在濾膜上的樹脂重懸于10ml異丙醇，并通過將懸浮液以180rpm振搖1小時進行抽提。從此懸浮液中取出lml,并在Eppendorff微量離心機中以12，000rpm離心。通過HPLC和用UV_DAD檢測儀(用Waters-SymetryC18層析柱進行HPLC并用0.02%磷酸60%-0%和乙腈40%-100。/。的梯度)于250nra檢測的方法測定其中的印othiloneA和B的量。以上述方法測試含有從pEP015亞克隆的三種不同的Aa』aHI整合片段的轉接合體，即含有質粒pEP015-21的"azaHI片段的轉接合體、含有質粒pEP015-4-5的Aa/aHI片段的轉接合體、和含有質粒pEP015-4-1的Aa/HI片段的轉接合體。HPLC分析揭示所有轉接合體不再產生印othiloneA和B。相反的，在整合有pEP020、pEP030、pEP031、pEP033的Sa/sHI片段的轉接合體和親本菌抹BCE28/2中檢測到epothiloneA和B濃度為2—4mg/l。實施例8:測定克隆的片段的核苷酸序列并構建毗連序列群A.質粒pEP015-21的^MU插入片段從大腸桿菌DH10B[pEP015-21]菌抹中分離質粒DNA,并測定插入pEP015-21的2.3kb"aiaHI片段的核苷酸序列。自動DNA測序是在雙鏈DNA模板上通過雙脫氧核苷酸鏈終止方法進行的，使用應用AppliedBiosystems377型測序儀。使用的引物是通用反向引物(5，GGAMCAGCTATGACCATG3，(SEQIDNO:24))和通用正向引物(5，GTAAAACGACGGCCAGT3，(SEQIDNO:25))。在隨后幾輪測序反應中，使用為先前測定的序列的3'末端設計而定制合成的寡核香酸來延伸并連接毗連序列群。兩條鏈都完全測序，而且每個核苷酸至少測序兩次。使用3.O版Sequencher程序(GeneCodesCorporation)編輯核苷酸序列，并使用威斯康星遺傳學計算機組程序(WisconsinGeneticsComputerGroupprograms)分析。2213-bp插入片段的核苷酸序列相應于SEQIDNO:1的核苷酸20779-22991。B.質粒pEP015-4-l的5aMlI插入片段從大腸桿菌DH10B[pEP015-4-1]菌抹中分離質粒DNA，并如上(A)所述測定插入pEP015-4-1的3.9kbAa/aHI片段的核苷酸序列。3909-bp插入片段的核苷酸序列相應于SEQIDNO:1的核苷酸16876-20784。C.質粒pEP015-4-5的ife邁HI插入片段從大腸桿菌DH10B[pEP015-4-5]菌抹中分離質粒DNA，并如上(A)所述測定插入pEP015-4-5的2.3kbSa/aHI片段的核苷酸序列。2233-bp插入片段的核苷酸序列相應于SEQIDNO:1的核苷酸42528-44760。實施例9:含有印othilone生物合成基因的pEP015中的DNA片段的亞克隆和排序將pEP015用限制酶^'/7dm完全消化，并將產生的片段亞克隆到已經用^'/Kim切割且用小牛腸堿性磷酸酶去磷酸化的pBluescriptnSK-或pNEB193(NewEnglandBiolabs)中。產生了六個不同的克隆，并命名為pEP015—NH1、pEP015-NH2、pEP015—NH6、pEP015-NH24(都由pNEB193衍生)、和pEP015-H2.7和pEP015-H3.0(都由pBluescriptnSK-衍生)。分離并DIG標記(非放射性DNA標記和檢測系統，BoehringerMannheim)pEP015-21的5級aHI插入片段，并在DNA雜交實驗中在高度嚴謹條件下作為針對pEP015-NH1、pEP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015_NH24、pEP015-H2.7和pEP015-H3.0的探針使用。對pEP015-NH24檢測到強雜交信號，說明pEP015-NH24包含pEP015-21。如上所述分離并DIG標記pEP015-4-1的5afflHI插入片段，并在DNA雜交實驗中在高度嚴謹條件下作為針對pEPOl5-NH1、pEP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015-NH24、pEP015-H2.7和pEP015—H3.0的探針使用。對pEP015-NH24和pEP015-H2.7檢測到強雜交信號。由pEP015-NH24和pEP015-H2.7的一個末端得到的核普酸序列信息還與先前測定的pEP015-4-1的插入片段的序列完全一致。這些實驗證明pEP015-4-1(含有一個內部的^z7dffl位點)與pEP015-H2.7和pEP015-NH24重疊，而且pEP015-H2.7和pEP015-NH24是以這個順序相鄰的。如上所述分離并DIG標記pEP015-4-5的S迅bHI插入片段，并在DNA雜交實驗中在高度嚴謹條件下作為針對pEP015-NH1、pEP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015-NH24、pEP015-H2.7和pEP015-H3.0的探針使用。對pEP015-NH2檢測到強雜交信號，說明pEP015-NH2包含pEP015-4-5。由pEP015-NH2的兩個末端和pEP015-H24不與pEP015-4-1重疊的那個末端得到核苷酸序列信息。朝向氾/7dffl位點的PCR引物NH24末端"B":GTGACTGGCGCCTGGMTCTGCATGAGC(SEQIDNO:26)、NH2末端"A":AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC(SEQIDN0:27)、和NH2末端"B":GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA(SEQIDNO:28)是根據這些序列設計的，并用于以pEP015和在個別實驗中以纖維堆嚢菌Soce90基因組DNA作為模板的擴增反應。以NH24末端"B"和NH2末端"A"作為引物對，在兩種模板中都發現特異擴增。將擴增物克隆到pBluescriptnSK-中并完全測序。擴增物的序列相同，而且還與PEP015-NH24和pEP015-NH2的末端序列完全一致，并在^//Klffl位點融合，確定了pEP015-NH2和pEP015-NH24的i7ivdffl片段是以此順序相鄰的。如上所述分離并DIG標記pEP02.7的治'/zdin插入片段，并在DNA雜交實驗中在高度嚴謹條件下作為針對經Abd消化的pEP015的探針使用。大小大約為9kb的一個片段顯示強雜交信號，將其進一步亞克隆到已經用Abtl消化且用小牛腸堿性磷酸酶去磷酸化的pBluescriptnSK-中，從而產生pEP015-N9-16。如上所述分離并DIG標記pEP015-N9-16的Abtl插入片段，并在DNA雜交實驗中在高度嚴謹條件下作為針對pEP015-NHl、pEP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015-NH24、pEP015-H2.7和pEP015-H3.0的探針使用。對pEP015-麗6、以及預期的克隆pEP015-H2.7和pEP015-NH24檢測到強雜交信號。由pEP015-NH6的兩個末端和pEP015-H2.7不與pEP015-4-1重疊的那個末端得到核苷酸序列信息。設計朝向^^dm位點的PCR引物并用于以pEP015和在個別實驗中以纖維堆嚢菌Soce90基因組DNA作為模板的擴增反應。以pEP015-NH6末端"B":CACCGMGCGTCGATCTGGTCCATC(SEQIDN0:29)和pEP015-H2.7末端"A":CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC(SEQIDNO:30)作為引物對，在兩種模板中都發現特異擴增。將擴增物克隆到pBluescriptnSK-中并完全測序。擴增物的序列是相同的，而且還與pEP015-NH6和pEP015-NH2.7的末端序列完全一致，在仏'/dffl位點融合，確定了pEP015-NH6和pEP015-NH2.7的治'/7dm片段是以此順序相鄰的。所有這些實驗，綜合起來，確定了覆蓋大約55kb區域并由pEP015-NH6、pEP015-H2.7、pEP015-NH24、和pEP015-NH2的^z'/zdffl插入片段以此順序組成的〃j'/zdffl片段毗連序列群。剩余的兩個#//dm亞克隆的插入片段(命名為pEP015-NHl和pEP015-H3.0)未發現是這個毗連序列群的部分。實施例10:覆蓋印othilone生物合成基因的亞克隆毗連序列群的進一步延伸將pEP015-NH2插入片段下游末端產生、并因此代表實施例9中描述的亞克隆毗連序列群的下游末端的大約2.2kb5出bHI-^27dffl片段分離出來、DIG標記、并用于針對經多種酶消化的pEP015和pEP015-NH2DNA的Southern雜交實驗。總是發現在兩種目的DNA之間強雜交條帶大小相同，說明克隆到pEP015中的纖維堆嚢菌Soce90基因組DNA片段結束于位于pEP015-NH2下游末端的HindIII位點。使用已確定的步驟，在pScosTriplex-n(Ji等人，基因組學(Genomics)31:185-192(1996))中構建纖維堆嚢菌Soce90的祐粒DNA文庫。簡單的說，將纖維堆嚢菌Soce90的高分子量基因組DNA用限制酶5"朋3AI部分消^以提供平均大小為大約40kb的片段，并連接到經AaMU和JAaI消化的pScosTriplex-n中。連接混合物用GigapackmXL(Stratagene)包裝，并用于轉染大腸桿菌XL1BlueMR細胞。用所述大約2.2kb的AaflHI-衍/dffi片段(pEP015-NH2插入片段的下游末端產生、作為菌落雜交中的探針使用)篩選粘粒文庫，選擇到一個強雜交克隆，命名為pEP04E7。將pEP04E7DNA分離、用多種限制性內切酶消化、并用2.2kb5afflHI-治7zdHI片段在Southern雜交中探測。選擇到一個大小大約為9kb的強雜交的/V"I片段，并亞克隆到pBluescriptHSK-以產生pEP04E7-N9-8。進一步的Southern雜交實驗揭示了pEP04E7-N9-8大約9kb的，Ml插入片段與pEP015-NH2的^"I-〃^dm片段超過6kb重疊，而剩余的大約3kb/^z'/Kiin-yVotl將延伸實施例9中描述的亞克隆毗連序列群。然而，末端測序揭示pEP04E7-N9-8插入片段的下游末端包含pScosTriplex-H的5a威I-〃otl多克隆位點，由此說明pEP04E7的基因組DNA插入片段終止于^'"dffl-yV"I延伸片段中的Sa"3AI位點，而艦I位點來自pScosTriplex-n。將pEP04E7-N9-8的大約3kb#/i2din-AfetI延伸亞片段衍生的大約1.6kb尸"I-5"a71片段(不含載體，只包含纖維堆嚢菌Soce90衍生的序列)，作為針對實施例2中描述的細菌人工染色體文庫的探針使用。除了先前分離的EP015,還發現命名為EP032的Bac克隆與該探針強雜交。將pEP032分離、用多種限制性內切酶消化、并與大約1.6kb的-Xa71探針雜交。發現大小大約為13kb的iW"dm-fcoRV片段與該探針強雜交，將其亞克隆到經^//7dffl和"7/cII消化的pBluescriptnSK-中以產生pEP032-,15。根據pEP015-NH2的下游末端序列和pEP032-HEV15的上游(#//zdm)末端序列設計寡核苷酸引物，并用于以pEP04E7-N9-8為模板的測序反應。序列揭示了在常規限制性分析中檢測不到的一個24bp小^/"dffl片段(EP04E7-H0.02)的存在，分隔pEP015-NH2下游末端的氾/dm位點和pEP032-HEV15上游末端的#//(1111位點。由此，描述于實施例9中的亞克隆毗連序列群延伸到了包括EP04E7-H0.02的^'fldin片段和pEP032-HEV15的插入片段，而且由pEP015—NH6、pEP015-H2.7、pEP015-NH24、pEP015-NH2、EP04E7—H0.02和pEP032-匿15的插入片段以此順序組成。實施例11:測定覆蓋epothilone生物合成基因的亞克隆毗連序列群的核苷酸序列如下測定實施例10中描述的亞克隆毗連序列群的核苷酸序列。pEP015-H2.7。從大腸桿菌DH10B[pEP015-H2.7]菌林中分離質粒DNA，并測定pEP015_H2.7的2.7kbAa/aHI插入片段的核苷酸序列。自動DNA測序在雙鏈DNA模板上通過雙脫氧核苷酸鏈終止方法進行，使用AppliedBiosystems377型測序儀。使用的引物是通用反向引物(5，GGAMCAGCTATGACCATG3，(SEQIDN0:24))和通用正向引物(5，GTAAMCGACGGCCAGT3，(SEQIDN0:25))。在隨后幾輪測序反應中，使用為先前測定的序列的3，末端設計而定制合成的寡核苷酸來延伸并連接毗連序列群。pEP015-NH6、pEP015-NH24和pEP015-NH2。分離這些質粒的〃/77dffl插入片段并用于隨機片段化，使用Hydroshearapparatus(GenomicInstrumentationServices,Inc.)以產生平均大小為l-2kb的片段。使用T4DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶在三磷酸脫氧核普酸存在時對片段進行末端修復，并用T4DNA激酶在ribo-ATP存在時磷酸化。從瓊脂糖凝膠中分離在1.5-2.2kb大小范圍內的片段，并連接到經fcoRV切割和去磷酸化的pBluescriptnSK-中。使用通用反向引物和通用正向引物對隨機亞克隆測序。pEP032-HEV15。將pEP032-HEV15用^z'/7dffl和5^/71消化，分離得到包含纖維堆嚢菌Soce90的大約13kb#//dffl-fcoRV插入片段和pBluescriptHSK—的0.3kbi7z'/2cH-5*5^1片段的大約13.3kb片段，并用〃aeffl部分消化以產生平均大小為1-2kb的片段。從瓊脂糖凝膠中分離在1.5-2.2kb大小范閨內的片段，并連接到經5boRV切割和去磷酸化的pBluescriptnSK-中。使用通用反向引物和通用正向引物對隨機亞克隆測序。分析了色譜圖并用Phred、Phr鄧和Consed程序(Ewing等人，差茵遂^T("e細e紋)8(3):175-185(1998);Ewing等人，差西逾^^:8(3):186-194(1998);Gordon等人，差^愈^^T8(3):195-202(1998))裝配成毗連序列群。填充毗連序列群缺口，分析序列差異，并對低準確度區域使用定制設計的用于原始亞克隆或從隨機亞克隆文庫中選定克隆測序的寡核普酸引物重新測序。兩條鏈都完全測序，而且每個堿基對的累計Phred得分至少40(置信度99.99%)。該68750bp毗連序列群的核苷酸序列顯示如SEQIDNO:l。實施例12:分析epothilone生物合成基因的核苷酸序列發現SEQIDN0:1包含22個0RF，詳見下表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*在反向互補鏈上。編號根據SEQIDNO:l。印oA(SEQIDNO:1的核苷酸7610-11875)編碼EPOSA(SEQIDNO:2)，一種第一類聚酮化合物合酵，由單個模塊組成，并包含下列結構域P-酮脂酰合酶(KS)(SEQIDN0:1的核苷酸7643-8920，SEQIDNO:2的氨基酸11-437)、酰基轉移酶(acyltransferase,AT)(SEQIDN0:1的核苷酸9236-10201，SEQIDNO:2的氨基酸543-864)、烯酰基還原酶(e,lreductase,ER)(SEQIDN0:1的核苷酸10529-11428，SEQIDNO:2的氨基酸974-1273)、和酰基載體蛋白同源結構域(ACP)(SEQIDNO:l的核苷酸11549-11764，SEQIDNO:2的氨基酸1314-1385)。序列比較和基元分析(Haydock等人，/^^S*遞訊(卿"e".)374:246-248(1995);Tang等人，差^216:255-265(1998))揭示了EPOSA編碼的AT對丙二酸單酰CoA是特異的.EPOSA應當是通過將乙酸根單元上載到多酶復合物上最終形成2-甲基噢唑環的部分(C26和C20),而涉及印othilone生物合成的起始。印oP(SEQIDN0:1的核苷酸11872-16104)編碼EPOSP(SEQIDN0:3)，一種非核糖體肽合成酶，含有單個模塊。EPOSP包含下列結構域參肽鍵形成結構域，由基元K(SEQIDN0:3的氨基酸72-81[FPLTDIQESY]，相應于SEQIDN0:1的核苷酸位置12085-12114)、基元L(SEQIDNO:3的氨基酸118-125[WARHDML],相應于SEQIDNO:1的核普酸位置12223-12246)、基元M(SEQIDN0:3的氨基酸199-212[SIDLINVDLGSLSI]，相應于SEQIDNO:l的核苷酸位置12466-12507)、和基元O(SEQIDN0:3的氨基酸353-363[GDFTSMVLLDI],相應于SEQIDNO:1的核苷酸位置12928-12960)描繪；氨酰基腺苷酸形成結構域，由基元A(SEQIDN0:3的氨基酸549-565[LTYEELSRRSRRLGARL]，相應于SEQIDNO:l的核苷酸位置13516-13566)、基元B(SEQIDNO:3的氨基酸588-603[VAVLAVLESGAAYVPI],相應于SEQIDN0:1的核苷酸位置13633-13680)、基元C(SEQIDNO:3的氨基酸669—684[AYVIYTSGSTGLPKGV],相應于SEQIDNO:1的核苷酸位置13876-13923)、基元D(SEQIDNO:3的氨基酸815-821[SLGGATE]，相應于SEQIDNO:1的核苷酸位置14313-14334)、基元E(SEQIDNO:3的氨基酸868-892[GQLYIGGVGLALGYWRDEEKTRKSF]，相應于SEQIDNO:l的核苷酸位置14473-14547)、基元F(SEQIDN0:3的氨基酸903-912[YKTGDLGRYL]，相應于SEQIDNO:l的核苷酸位置14578-14607)、基元G(SEQIDNO:3的氨基酸918-940[EFMGREDNQIKLRGYRVELGEIE]，相應于SEQIDN0:1的核苷酸位置14623-14692)、基元H(SEQIDN0:3的氨基酸1268-1274[LPEYMVP]，相應于SEQIDN0:1的核苷酸位置15673-15693)、和基元I(SEQIDN0:3的氨基酸1285-1297[LTSNGKVDRKALR]，相應于SEQIDN0:1的核苷酸位置15724-15762)描繪；*一個未知結構域，插入在氨酰基腺苷酸形成結構域的基元G和H之間(SEQIDNO:3的氨基酸973-1256,相應于SEQIDNO:1的核苷酸位置14788-15639);和參肽基載體蛋白同源結構域(PCP)，由基元J(SEQIDN0:3的氨基酸1344-1351[GATSIHIV]，相應于SEQIDN0:1的核普酸位置15901-15924)描繪《有人提出EPOSP涉及半胱氨酸的腺普酸化活化(結合經活化的半胱氨酸成為氨酰基-S-PCP，在酶結合的半胱氨酸和EPOSA提供的乙酰基-S-ACP之間形成肽鍵)和通過分子內雜環化形成最初的塞唑啉環。EPOSP的未知結構域顯示與來自芽孢桿菌物種的NAD(P)H氧化酶和還原酶有非常弱的同源性。由此，這個未知結構域和/或EPOSA的ER結構域可能涉及最初的2-甲基噻唑啉環氧化成2-甲基塞唑。印oB(SEQIDN0:1的核苷酸16251-21749)編碼EPOSB(SEQIDN0:4),—種第一類聚酮化合物合酶，由單個模塊組成，并包含下列結構域KS(SEQIDN0:1的核苷酸16269-17546，SEQIDN0:4的氨基酸7-432)、AT(SEQIDNO:1的核苷酸17865-18827,SEQ訓0:4的氨基酸539-859)、脫水酶(DH)(SEQIDN0:1的核苷酸18855-19361，SEQIDN0:4的氨基酸869-1037)、P-酮還原酶(KR)(SEQIDNO:1的核苷酸20565-21302，SEQIDNO:4的氨基酸1439-1684)和ACP(SEQIDNO:1的核苷酸21414-21626，SEQIDN0:4的氨基酸1722-1792)。序列比較和基元分析揭示了EPOSB編碼的AT對甲基丙二酸單酰CoA是特異的。EPOSA可能通過催化2-甲基-4-噻唑羧基-S-PCP起始基團與甲基丙二酸單酰-S-ACP的Claisen樣縮合和伴隨的C17的P-酮基還原成烯酰基，而參與第一種聚酮化合物鏈的延伸。e/>oC(SEQIDNO:l的核苷酸21746-43519)編碼EPOSC(SEQIDN0:5),—種第一類聚酮化合物合酶，由4個模塊組成。第一個模塊包含KS結構域(SEQIDNO:l的核苷酸21860-23116，SEQIDNO:5的氨基酸39-457)、丙二酸單酰CoA特異的AT(SEQIDNO:l的核苷酸23431-24397,SEQIDNO:5的氨基酸563-884)、KR(SEQIDNO:l的核苷酸25184-25942,SEQIDNO:5的氨基酸1147-1399)、和ACP(SEQIDNO:l的核苷酸26045-26263,SEQIDN0:5的氨基酸1434-1506)。這個模塊引入乙酸基延伸單元(C14-C13),并將位于C15的P-酮基還原成參與epothilone大內酯環最終內酯化的幾基基團。EPOSC的第二個模塊包含KS(SEQIDNO:l的核苷酸26318-27595，SEQIDNO:5的氨基酸1524-1950)、丙二酸單酰CoA特異的AT(SEQIDNO:1的核苷酸27911-28876,SEQIDNO:5的氨基酸2056-2377)、KR(SEQIDNO:1的核苷酸29678-30429，SEQIDNO:5的氨基酸2645-2895)、和ACP(SEQIDNO:1的核苷酸30539-30759，SEQIDNO:5的氨基酸2932-3005)。這個模塊引入乙酸基延伸單元(C12-Cll),并將位于C13的酮基還原成羥基基團。由此，印othilone的初生聚嗣化合物鏈相當于epothiloneA，而在epothiloneB中的C12引入甲基側鏈將需要PKS后續C-甲基轉移酶活性。位于C13-C12的環氧環的形成也將需要PKS后續氧化步驟。EPOSC的第三個模塊包含KS(SEQIDNO:l的核苷酸30815_32092,SEQIDN0:5的氨基酸3024-3449)、丙二酸單酰CoA特異的AT(SEQIDN0:1的核苷酸32408-33373，SEQIDNO:5的氨基酸3555-3876)、DH(SEQIDN0:1的核苷酸33401-33889，SEQIDN0:5的氨基酸3886-4048)、ER(SEQIDN0:1的核苷酸35042-35902，SEQIDN0:5的氨基酸4433-4719)、KR(SEQIDNO:l的核苷酸35930-36667，SEQIDNO:5的氨基酸4729-4974)、和ACP(SEQIDNO:1的核苷酸36773-36991，SEQIDN0:5的氨基酸5010-5082)。這個模塊引入乙酸基延伸單元(CIO-C9)，并完全還原位于Cll的P-酮基。EPOSC的第四個模塊包含KS(SEQIDN0:1的核苷酸37052-38320,SEQIDN0:5的氨基酸5103-5525);甲基丙二酸單酰CoA特異的AT(SEQIDNO:1的核苷酸38636-39598,SEQIDN0:5的氨基酸5631-5951)、DH(SEQIDNO:1的核苷酸39635-40141，SEQIDNO:5的氨基酸5964-6132)、ER(SEQIDN0:1的核苷酸41369-42256,SEQIDN0:5的氨基酸6542-6837)、KR(SEQIDNO:1的核苷酸42314-43048，SEQIDNO:5的氨基酸6857-7101)、和ACP(SEQIDN0:1的核苷酸43163-43378，SEQIDN0:5的氨基酸7140-7211)。這個模塊引入丙酸基延伸單元(C24和C8-C7),并完全還原位于C9的P-酮基。印d)(SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920)編碼EPOSD(SEQIDN0:6),—種第一類聚酮化合物合酶，由2個模塊組成。第一個模塊包含KS結構域(SEQIDN0:1的核苷酸43626-44885，SEQIDN0:6的氨基酸35-454)、甲基丙二酸單跣CoA特異的AT(SEQIDNO:l的核苷酸45204-46166,SEQIDN0:6的氨基酸561一881)、KR(SEQIDNO:1的核香酸46950-47702,SEQIDN0:6的氨基酸1143-1393)、和ACP(SEQIDN0:1的核苷酸47811-48032，SEQIDN0:6的氨基酸1430-1503)。這個模塊引入丙酸基延伸單元(C23和C6-C5)，并將位于C7的P-酮基還原成羥基基團。第二個模塊包含KS(SEQIDN0:1的核苷酸48087-49361,SEQIDN0:6的氨基酸1522-1946)、甲基丙二酸單酰CoA特異的AT(SEQIDNO:1的核苷酸49680-50642,SEQIDNO:6的氨基酸2053-2373)、DH(SEQIDNO:1的核苷酸50670-51176，SEQIDN0:6的氨基酸2383-2551)、甲基轉移酶(MT,SEQIDNO:l的核苷酸51534-52657，SEQIDN0:6的氨基酸2671-3045)、KR(SEQIDN0:1的核苷酸53697-54431,SEQI,:6的氨基酸3392-3636)、和ACP(SEQIDNO:1的核苷酸54540-54758，SEQIDNO:6的氨基酸3673-3745)。這個模塊引入丙酸基延伸單元(C21或C22和C4-C3),并將位于C5的P-嗣基還原成羥基基團。這個還原有些出乎意料，因為epothilone在C5含有酮基。然而，PKS模塊推斷的還原活性和最終聚酮化合物產物相應位置的氧化還原狀態之間的這種不一致，已經在文獻(見，例如，Schweche等人，美腐塚家存夢魔遽雀92:7839-7843(1995)和Schupp等人，凝4:參#遞試159:201-207(1998))中有報導。epothilone的一個重要特征是位于C4的偕甲基側鏈基團(C21和C22)的存在。預測EPOSD的第二個模塊將丙酸基單元引入到增長的聚酮化合物鏈，在C4提供一個甲基側鏈。這個模塊還包含整合到PKS中DH和KR結構域之間的甲基轉移酶結構域，與在畫P1耶爾森菌素合酶(A,M.Gehring，E.DeMoll，J.D.Fefherston，I.Mori，G.F.Mayhew，F.R.Blattner，C.T.Walsh，和R.D.Perry,鼠疫中的鐵獲取鼠疫耶爾森菌(re2^i/7/apes"、)產生的耶爾森菌素的酶生源論中的模塊原理(Ironacquisitioninplague:modularlogicinenzymaticbiogenesisofyersiniabactinbyJTersjf'fli^/es"'s)必夢^參夢(ae邁.)5，573-586，1998)中看到的排列相似。有人提出EP0SD中的這個MT結構域負責在C4引入該第二個甲基側鏈基團(C21或C22)。e/dE(SEQIDNO:1的核苷酸54935-62254)編碼EPOSE(SEQIDN0:7)，一種第一類聚酮化合物合酶，由一個模塊組成，包含KS(SEQIDN0:1的核苷酸55028-56284，SEQIDN0:7的氨基酸32-450)、丙二酸單酰CoA特異的AT(SEQIDNO:1的核苷酸56600-57565,SEQIDN0:7的氨基酸556-877)、DH(SEQIDN0:1的核苷酸57593-58087，SEQIDN0:7的氨基酸887-1051)、很可能無功能的ER(SEQIDNO:l的核苷酸59366-60304，SEQIDNO:7的氨基酸1478-1790)、KR(SEQIDNO:1的核苷酸60362-61099,SEQIDN0:7的氨基酸1810-2055)、ACP(SEQIDNO:1的核苷酸61211_61426，SEQIDNO:7的氨基酸2093-2164)、和硫酯酶(TE)(SEQIDNO:1的核苷酸61427-62254，SEQIDNO:7的氨基酸2165-2439)。這個模塊中的ER結構域包含活性位點基元，其中具有一些高度不平常的氨基酸取代，可能使得這個結構域無活性。該模塊引入乙酸基延伸單元(C2-Cl)，并將位于C3的P-酮基還原成烯酰基基團。印othilone在C3含有羥基基團，所以這個還原也顯得多余，如在EP0SD的第二個模塊中討論的。EPOSE的TE結構域參與已增長的聚酮化合物鏈經由C1羧基基團和C15幾基基團之間的內酯化的釋放和環化。在被測序區域中，印oA上游檢測到五個ORF。部分測序的oril在序列數據庫中沒有同源序列。or/2(SEQIDN0:1反向互補鏈上的核苷酸3171-1900)推導的蛋白質產物(0rf2，SEQIDN0:10)顯示與分枝桿菌(Mycobacterium)和天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的假設ORF有強相似性，以及與不同細菌的羧肽酶和DD-肽酶有更遠的相似性。or/3(SEQIDNO:1的核苷酸3415-5556)推導出來的蛋白質產物，0rf3(SEQIDNO:11)顯示與不同細菌的Na/H反向轉運蛋白有同源性。Orf3可能參與從生產菌抹中運出epothilone。和在序列數據庫中沒有同源序列。在被測序區域中，印oE下游檢測到十一個ORF,epoF(SEQIDNO:l的核苷酸62369-63628)編碼EPOSF(SEQIDNO:8),—種推導出來的與細胞色素P450加氧酶有強序列相似性的蛋白質。EPOSF可能參與調整碳C12、C5、和/或C3的氧化還原狀態。or/14(SEQIDNO:l的核苷酸67334-68251)推導出來的蛋白質，0rfl4(SEQIDNO:22)顯示與GI:3293544(沒有推測出功能的來自天藍色鏈霉菌的假設蛋白質)及GI:2654559(人胚肺蛋白質)有強相似性。它還更遠的與來自熱自養甲烷桿菌(ifet力朋o6a"er/咖tAezwoaf/totro/^'cw邁)陽離子流出系統蛋白質類GI:2623026相關，所以它可能還參與從生產細胞中運出印othilone。剩余的ORF(orf6_orf13和orf15)與序列數據庫中的條目不顯示同源性。實施例13:印othilone生物合成基因的重組表達為了達到比纖維堆嚢菌發酵更高的產量，在異源有機體中表達本發明的印othilone合酶基因。用于異源表達的一種優選的宿主是鏈霉菌，例如天然產生聚酮化合物放線菌紫素的天藍色鏈霉菌。用于在此宿主中表達重組PKS基因的技術描述于McDaniel等人，存夢262:1546-1550(1993)和Kao等人，存夢265:509-512(1994)。還可見，Holmes等人，欽^^、子^:參夢殺412(8):3183-3191(1993)和Bibb等人，基因38:215-226(1985),以及美國專利號5,521，077,5,672,491，和5,712,146,此處引用作為參考。根據某種方法，處理異源宿主菌抹以包含放線菌紫素(基因簇的染色體刪除。通過將DNA從溫度敏感的供體質粒轉移到大腸桿菌中的受體穿梭載體(McDaniel等人(1993)和Kao等人(1994))，以至于合酶基因通過載體中的同源重組實現轉移，由此構建了含有本發明的印othilone合酶基因的表達質粒。或者，將印othilone合酶基因簇通過限制性片段連接導入載體。按照例如Kao等人(1994)描述的選擇后，根據Hop冊od等人，遂,霧好差嫁凝斧,發jr手冊(JohnlimesFoundation,Norwich,UnitedKingdom,1985)提出的方案，將來自載體的DNA導入a"-的天藍色鏈霉菌菌抹(此處引用作為參考)。在R2YE培養基(Hopwood等人(1985))上培養重組鏈霉菌菌抹并生產印othilone。或者，在其它宿主有機體諸如假單胞菌、芽孢桿菌、酵母、昆蟲細胞和/或大腸桿菌中表達本發明的epothilone合酶基因。PKS和NRPS基因優選在大腸桿菌中使用PT7-7載體(使用T7啟動子)表達。見Tabor等人，美馬腐家存夢潔迷^82:1074-1078(1985)。在另一個實施方案中，使用表達栽體pKK223-3和pKK223-2在大腸桿菌中，以轉錄或翻譯融合形式在^c或"c啟動子后表達PKS和NRPS基因在天然不含有PKS酶翻譯后修飾需要的磷酸泛欲巰基乙胺基(phosphopantetheinyl,P-pant)轉移酶的異源宿主中表達PKS和NRPS基因，需要在宿主中共表達P-pant轉移酶，如Kealey等人，美塚馬家存夢虎遽襲95:505-509(1998)描述的。實施例14:從生產菌抹中分離印othiloneW093/10121(此處引用作為參考)，在美國專利號5，639，949的實施例57中，在Gerth等人，在4:,殺^49:560-563(1996)，和在瑞士專利申請號396/98(申請日期1998年2月19日)，和美國專利申請號09/248，910(還公開了優選的纖維堆嚢菌突變菌抹)中(此處引用作為參考)給出了培養、發酵、和用來分離聚飼化合物的提取步驟的實施例，對從天然和本發明的重組宿主中提取epothilone有用。下列步錄可以用來從人工培養的纖維堆嚢菌菌抹諸如Soce90中分離epothilone,而且還可以用來從重組宿主中分離epothilone。A'-epothilone生產菌抹的培養菌株纖維堆嚢菌Soce-卯或本發明的重組宿主菌抹菌抹保存液氮培養基預培養和中間培養:G52主要培養1B12G52培養基:酵母提取物，低鹽(BioSpringer,MaisonAlfort，法國)2g/lMgS04(7H20)lg/1CaCl2(2H20)lg/1脫脂大豆粉Soyamine50T(LucasMeyer,漢堡，德國)2g/l土豆淀粉NoreduxA-150(Blattma線Waedenswil,瑞士)8g/1葡萄糖，無水2g/lEDTA-Fe(ffl)-Na鹽(8g/l)lml/1用K0H調到pH7.4滅菌20mins，1B12培養基土豆淀粉NoreduxA-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士)20g/l脫脂大豆粉Soyainine50T(UcasMeyer,漢堡，德國)llg/1EDTA-Fe(m)-Na鹽8mg/l用KOH調到pH7.8滅菌20mins，120t:添加環糊精和環糊精衍生物不同濃度的環糊精(Fluka，Buchs，瑞士，或WackerChemie，Munich,德國)單獨滅菌并在接種前加到1B12培養基中。培養從液氮安瓿瓶中取l見l纖維堆嚢菌Soce-90懸浮液，轉移到10mlG52培養基中(裝在50mlErlemneyer燒瓶中)并在搖床中于180rpm和30"C，25mm振幅培養3天。取5ml此培養物，加到45mlG52培養基中(裝在200mlErlenmeyer燒瓶中)并在搖床中于180rpm和30X:，25,振幅培養3天。然后取50ml此培養物，加到450mlG52培養基中(裝在2升的Erlenmeyer燒瓶中)并在搖床中于180rpm和30"，50min振幅培養3天。維持培養每3-4天通過將50ffll培養物加入到450mlG52培養基中(裝在2升的Erlenmeyer燒瓶中)將培養物過量接種。所有實驗和發酵都是用這種維持培養物開始進行的。燒瓶中的測試(i)在搖瓶中的預培養由500ml維持培養物開始，用50ml維持培養物接種1x450mlG52培養基并在搖床中以180rpm和30"，50咖振幅培養4天。(ti)在搖瓶中的主要培養將添加了5g/14-嗎啉代-丙烷磺酸(-MOPS)粉的40ml1B12培養基(裝在200mlErlenmeyer燒瓶中)與5ml10x濃縮環糊精溶液混和，接種10ml預培養物并在搖床中以180rpm和30t:，50,振幅培養5天。發酵以10升、100升和500升的量進行發酵。20升和100升發酵作為中間培養步驟。預培養和中間培養接種10%(v/v)維持培養物，而主要培養接種20%(v/v)中間培養物。重要與振搖培養相反，發酵培養基的成分是根據最終培養液體積(包括接種液)計算的。如果，例如，18升培養基+2升接種液混和，那么稱量用于20升的物質但是只配制成18升。搖瓶中的預培養物由500ml維持培養物開始，4x450mlG52培養基(裝在2升Erlenmeyer燒瓶中)每個用50ml維持培養物接種并在搖床中以180rpm和30。C，50,振幅培養4天。中間培養物，20升或100升20升裝在總容量30升的發酵罐中的18升G52培養基接種2升預培養物。培養持續3-4天，條件是30TC,250rpin,0.5升空氣每升液體每分鐘，0.5巴超壓，無pH控制。100升裝在總容量150升的發酵罐中的90升G52培養基接種20升中間培養物中的10升。培養持續3-4天，條件是30X:，150rpm,0.5升空氣每升液體每分鐘，0.5巴超壓，無pH控制。主要培養物，10升、100升或500升10升用于10升1B12的培養基物質在7升水中滅菌，然后加入l升無菌的10%2-(羥丙基)-P-環糊精溶液，并接種2升的20升中間培養物。主要培養的持續時間是6-7天，條件是30t:，250rpm,0.5升空氣每升液體每分鐘，0.5巴超壓，pH用H2S04/KOH控制到pH7.6+/-0.5(即pH7.1和8.1之間不用控制)。100升用于100升1B12的培養基物質在70升水中滅菌，然后加入10升無菌的10%2-(羥丙基)-P-環糊精溶液，并接種20升的20升中間培養物。主要培養的持續時間是6-7天，條件是30°C,200rpm，0.5升空氣每升液體每分鐘，0.5巴超壓，pH用H2S04/KOH控制到pH7.6+/-0.5。100升發酵的接種鏈示意圖見圖1。500升用于500升1B12的培養基物質在350升水中滅菌，然后加入50升無菌的10%2-(羥丙基)-P-環糊精溶液，并接種100升的IOO升中間培養物。主要培養的持續時間是6-7天，條件是30°C，120rpm,0.5升空氣每升液體每分鐘，0.5巴超壓，pH用H2S04/KOH控制到pH7.6+/-0.5。產物分析樣品的制備將50ml樣品與2ml聚苯乙烯樹脂AmberliteXAD16(Rohm+Haas，Frankfurt,德國)混和，并于30。C以180rpm振搖一'J、時。然后使用150Hm尼龍篩過濾樹脂，用少量水清洗然后與濾器一起加到15mlNunc試管中。將產物從樹脂上洗脫向盛有濾器和樹脂的試管中加入10ml異丙醇(〉99。/。)。然后，將密封的試管于室溫在Rota-Mixer(LabincoBV，荷蘭)上振搖30分鐘。然后，離心出2ml液體，并使用移液器將上清液加到HPLC管中。HPLC分析層析柱Waters-SyinetryC18，100x4邁m，3.5pmWAT066220+預備柱3.9x20m姐WAT054225溶劑A:0.02%磷酸B:乙腈(HPLC級)梯度41%B0-7min100%B7.2-7.8扭in41%B8-12min烤箱溫度檢測250線UV-DAD檢效'J加樣體積lOfil保持時間EpoA:4.30minEpoB:5.38minB:加入環糊精和環糊精衍生物對得到的epothilone濃度的影響環糊精是環形(a-l,4)連接的a-D-吡喃型葡萄糖的寡糖，具有相對疏水的中央腔和親水的外部表面區域。具體區分下述物質(括號中的數字給出了每個分子的葡萄糖單元的數目)a-環糊精(6)、環糊精(7)、Y-環糊精(8)、5-環糊精(9)、環糊精(10)、環糊精(ll)、ri-環糊精(12)、和6-環糊精(13)。尤其優選5-環糊精，特別是a-環糊精、環糊精或Y-環糊精，或者它們的混合物。環糊精衍生物主要是上述環糊精的衍生物，尤其是a-環糊精、P-環糊精或Y-環精的衍生物，主要是那些有一個或幾個甚至多達所有羥基(每個葡萄糖自由基有3個)被酸化或酯化的衍生物。醚主要是烷基酸，尤其是低級烷基，諸如甲基或乙基酸，還有丙基或丁基醚；芳香基羥烷基醚，諸如笨基輕基低級烷基醚，尤其笨基鞋乙基醚；羥烷基醚，特別是羥基低級烷基酸，尤其是2-羥乙基酸，羥丙基醚諸如2-羥丙基醚或羥丁基醚諸如2-羥丁基醚；羧基烷基酸，特別是羧基低級烷基醚，尤其是羧甲基或羧乙基醚；衍生化羧基烷基醚，特別是衍生化羧基低級烷基醚，其中衍生化羧基是醚化或酰胺化的羧基(主要是氨基羰基、單-或二-低級烷基氨基羰基、嗎啉代-、哌啶子基-、吡咯烷子基(pyrrolidine))-或艱秦子基(piperazino)-羰基、或烷氧基羰基)，特別是低級烷氧羰基-低級烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺基烷基酸，特別是磺基低級烷基醚，尤其是磺基丁基醚；其中一個或幾個OH基團被具有下式的基團醚化的環糊精-O-[alk-O-]n-H其中alk是烷基，尤其是低級烷基，而且n是2-12的整數，尤其是2-5，特別是2或3;其中一個或幾個OH基團被下式的基團酸化的環糊精IO,|k-0)I;^~Alk~^其中R，是氫、羥基、-0-(alk-O)z-H、-0-(alk(-R)-0-)p-H或-0-(alk(-R)-0-)q-alk-CO-Y;alk在所有情況中是烷基，尤其是低級烷基；m、n、p、q和z是1-12的整數，優選1-5,特別是1-3;Y是0I^或NR2R3,其中Rh&和R3互相獨立地是氫或低級烷基，或&和R3與連接氮一起表示嗎啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌溱子基；或者分支環糊精，其中存在與其它糖分子的醚化或乙縮醛，尤其是葡糖基-、二葡糖基-、(G2-P-環糊精)、麥芽糖基-或二麥芽糖基環糊精，或N-乙酰氨基葡糖基、氨基葡糖基-、N-乙酰氨基半乳糖基-或氨基半乳糖基-環糊精。酯主要是烷酰酯，特別是低級烷欲酯，諸如環糊精的乙酰酯。還有可能環糊精中同時存在兩種或更多種不同的所述醚和酯基團。兩種或更多種所述環糊精和/或環糊精衍生物的混合物也可以存在。特別優選的是a-、P-或y-環糊精或它們的低級烷基酸，諸如甲環糊精或特別是2,6-二-O-甲基-p-環糊精，或特別是它們的羥基低級烷基醚，諸如2-羥丙基-a-、2-羥丙基-p-或2-羥丙基-Y-環糊精。向培養基中加入環糊精或環糊精衍生物，其濃度優選0.02-10，更優選O.05-5，尤其O.1-4，例如O.1-2重量百分比(w/v)。環糊精或環糊精衍生物是已知的或可以通過已知的方法生產(參閱例如US3,459,731;US4,383,992;US4,535，152;US4，659,696;EP0094157;EP0149197;EP0197571;EP0300526;EP0320032;EP0499322;EP0503710;EP0818469;WO90/12035;WO91/11200;WO93/19061;WO95/08993;WO96/14090;GB2,189,245;DE3,118,218;DE3，317,064及其中提到的有關環糊精或環糊精衍生物合成的參考文獻或還有T.Loftsson和M.E.Brewster(1996),環糊精的藥物應用藥物溶解性和穩定性(PharmaceuticalApplicationsofCyclodextrins:DrugSolubilizationandStabilisation)，毐參存夢殺'悉(/ottr朋jof尸Aar邁acee/"'ca25V^e/2ce)^(10):1017-1025;R.A.Rajewski和V.J.Stella(1996)，環糊精的藥物應用體內藥物投遞(PharmaceuticalApplicationsofCyclodextrins:InVivoDrugDelivery),秀參存夢殺/^^(11):1142-1169)。這里測試的所有環糊精衍生物可以從Fluka公司，Buchs，CH購得。測試在具有50ml培養容量的200ml搖瓶中進行。作為對照，使用裝有吸附劑樹脂AmberliteXAD-16(Rohm和Haas,Frankfurt,德國)和無任何吸附劑添加的搖瓶。培養5天后，通過HPLC測定下列epothilone的濃度:表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>0.50.51)除Amberlite(%v/v)之外,所有百分比均為重量百分比(%w/v)。少數測試的環糊精(2，6-二-0-甲基-P-環糊精、甲基-P-環糊精)顯示在使用的濃度對epothilone產量沒有影響或有負面影響。l-2%2-羥基-丙基-P-環糊精和P-環糊精在實施例中與不使用環糊精生產相比將epothilone產量提高6-8倍。C:有1%2-(羥丙基)-P-環糊精的IO升發酵發酵在15升玻璃發酵罐中進行。培養基含有10g/l的2-(羥丙基)-P-環糊精(購自WackerChemie，Munich,德國)。發酵過程列于表3。發酵在6天后停止并開始提取。表3:IO升發酵的過程培養時間epothiloneAepothiloneB[天][mg/1]Dng/l]00010020.50.331.82.543.05.153.75.963.65.7D:有1°/。2-(鞋丙基)-P-環糊精的100升發酵發酵在150升發酵罐中進行。培養基含有10g/l的2-(羥丙基)-P-環糊精。發酵過程列于表4。發酵液在7天后收獲并提取。表4:100升發酵的過程培養時間epothiloneAepothiloneB[天][mg/1][mg/1]00010020.3030.91.141.52.351,63.361.83.771.83.5E:有1%2-(羥丙基)-環糊精的500升發酵發酵在750升發酵罐中進行。培養基含有10g/l的2-(羥丙基)-P-環糊精。發酵過程列于表5。發酵液在7天后收獲并提取。表5:500升發酵的過程培養時間epothiloneAepothiloneB[天][mg/1][mg/1]00010020030.60.641.72.253.14.563.15.1F:不加吸附劑的10升發酵比較實施例發酵在15升玻璃發酵罐中進行。培養基不含有任何環糊精或其它吸附劑。發酵過程列于表6。沒有收獲并提取發酵液。表6:不含吸附劑的IO升發酵的過程<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>G:逐步得到epothilone:從500升主要培養物中分離從實施例2D的500升主要培養收獲的體積是450升，并使用Westfalia澄清分離器(clarifyingseparator)SA-20-06型(rpm=6500)分離成液相(離心液+沖洗水-650升)和固相(細胞=大約15kg)。發現epothilone的主要部分在離心液中。離心所得的細胞漿含有<15%的測定的印othilone部分，不再進一步處理.然后將650升離心液置于4000升攪拌器中，與10升AmberliteXAD-16(離心液:樹脂=65:1)混合并攪拌。接觸大約2小時后，在Heine溢流式離心機(overflowcentrifuge)(桶容量40升；rpm=2,)中離心下樹脂。從離心機上卸下樹脂，并用10-15升去離子水清洗解吸附作用通過兩次攪拌樹脂進行，每次均將一部分與30升異丙醇在30升玻璃攪拌器中攪拌30分鐘。使用抽濾器從樹脂中分離出異丙醇相。然后在真空搡作的循環蒸發器(Schmid-Verdampfer)中加入15-20升水將異丙醇從混合異丙醇相中除去，并將得到的大約10升水相提取3次，每次用IO升乙酸乙酯抽提。提取在30升玻璃攪拌器中進行。在真空操作的循環蒸發器(Schmid-Verdampfer)中將乙酸乙酯提取液濃縮至3-5升，之后在真空下在旋轉蒸發器(Bifchi型)中濃縮至干燥。得到50.2g乙酸乙酯提取物。將乙酸乙酯提取物溶解于500ml甲醇中，使用折疊濾器將不溶部分濾掉，并將溶液加到10kgS印hadexLH20層析柱(Pharmacia,Uppsala,瑞典)(層析柱直徑20cm，填充高度大約1.2旭)上。用甲醇作為洗脫液進行洗脫。epothiloneA和B主要存在于級分21-23中(每份級分1升)。在真空中在旋轉蒸發器中將這些級分濃縮至干燥(總重量9.0g)。然后將這些S印hadex洗脫峰級分(9.0g)溶解于92ml乙腈水二氯甲烷=50:40:2中，將溶液用折疊濾器過濾并加到RP層析柱(配備Pr印bar200,Merck;2.0kgLiChrospherRP-18，Merch，顆粒大小12pm,柱直徑10cm，填充高度42cm;Merch,Darmstadt,德國)上。用乙腈水=3:7進行洗脫(流速=500ml/min;epothiloneA的保持時間=大約51-59min;印othiloneB的保持時間=大約60-69min)。級分用UV檢測儀于250nm監測。在真空下在Bifchi-Rotavapor旋轉蒸發器上將級分濃縮至干燥。印othiloneA洗脫峰級分的重量是700mg，而且根據HPLC(外部標準)含量是75.1%。印othiloneB洗脫峰級分的重量是1980沮g,而且含量根據HPLC(外部標準)是86.6%。最后，印othiloneA收集部分(700mg)由5ml乙酸乙酯甲笨-2:3結晶，并產生170mg印othiloneA的純晶體[含量根據HPLC(面積％)=94.3%]。印othiloneB收集部分(1980mg)由18ml甲醇進行結晶并產生1440mg印othiloneB的純晶體[含量根據HPLC(面積。/。)=99.2%]。m.p.(印othiloneB):例如124-125t:;印othiloneB的力-臓數振500MHz-NMR，溶劑DMS0-d6。化學取代5以相對于TMS的ppm表示。s=單峰；d=雙峰；m-多重峰integral(H的數目)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>1.13(m)21.06(d)30.89(d+s,重疊)6￡-41實施例15:重組生產的epothilone的醫療用途包含印othilone的藥物制劑或組合物可被用于例如癌癥(諸如各種人實體瘤)的治療。這些抗癌制劑包f例如)活性劑量的epothilone和一種或幾種有機或無機液體或固體的適合藥用的載體物質。這些制劑以例如腸道、鼻腔、直腸，口腔、或非腸道方式，尤其是肌肉內或靜脈內方式給藥。活性成分的劑量取決于病人的體重、年齡和體格和藥物動力學狀況并進一步取決于給藥方式。因為印othilone模仿紫杉醇的生物學效應，故印othilone有可能在使用紫杉醇治療癌癥的組合物和方法中取代紫杉醇。見，例如，美國專利號5,496,804，5，565，478,和5,641,803，引用這些作為參考。例如，用于治療時，提供的epothiloneB是2ml玻璃瓶單獨包裝，配制成lmg/ml清亮的、無色靜脈注射液濃縮物。該物質用聚乙二醇300(PEG300)配制并用50或100ml0.9%氯化鈉注射液USP稀釋以達到藥物輸液需要的最終濃度。以每21天一次30分鐘靜脈輸液(三周治療一次)六個循環或者每7天一次30分鐘靜脈輸液(一周治療一次)進行優選的，對于每周一次的治療，劑量在大約0.1-大約6mg/ni2，優選大約0.1-大約5mg/m2，更優選大約0.1-大約3mg/m2，甚至更優選O.1-1.7mg/見2，最優選大約0.3-大約1mg/ms之間；對于三周一次的治療(每三周一次或每個第三周治療)，劑量在大約0.3-18mg/m2，優選大約0.3-大約15mg/m2,更優選大約0.3-12mg/m2，甚至更優選大約0.3-大約7.5姐g/in2,還要更優選大約0.3-大約5mg/m2，最優選大約1.0-3.0叫/姐2之間。優選這個劑量通過對人進行2-180min,優選2-120min，更優選大約5-大約30min,最優選大約10-大約30fflin(如大約30min)完成靜脈內(i.v.)給藥雖然本發明已經由它們的特定實施方案作為參考描述過，明顯的，眾多的變化、修飾和實施方案是可能的，相應的，所有這些變化、修飾和實施方案將被看作是在本發明的精神和范圍序列表NovartisAG用于epothilone生物合成的基因4一30582A<110><120><130><140><141><160>30<170>PatentlnVer.2,0<210><211><212><213>68750纖維堆嚢菌<400>1aagcttcgctacggccgggcccctccgagagcgacctgacatgcccgceigcgctcgtccgsgcgcgagcgcc仁gcttcgccgatgtcgccsgctcgcctgatcccgcctatcgccgcggctcgcctcctgtgtgggagcgtcgagcgcgctcgcggcgggtcgtgaccgaccggccggatcgcccctcsgtgacgga的gtccacgctcggcgcgccc仁tgtctccacgaggtgcgagctccccgagccgtcaccctcsatcgac站gcgacgtcgtgtcggcacgtcgatatgggaccggcatcctgacccggaccgaggtagacgctggtcccacccsCCC3t33CCCggccggcgtggccctcgtgccg3c3cg的ccccgtcgcgscgcg站ccgacgcgeiggatgcsccccctgccggcagcgtccgacgccctccacggagcgggcacctccgcgg仁ggagctccctgaggcacgtggctcgcc3gcccg33ccgcccgatctgtgaagtcgcctgccgcgctgcgagatgctgctccgcgcccggaggtcgtagctccggacgcgaggcgatccgccggcctgcggagacgcactcgccggtcccagatgctccsgccccctccgggttcatgcgtcgt:ccaggcccgccggcttcggctggccttcgcgtsctgcgsccc3Ccsccggcgtacgaggaccgggcacatccgcccctgacstggctcgcccgcctggcgaccccgccaga幼cccgstcagcttagcgcccggcagccgtgcg的gtgatcggscaccgccgtccggcggcgctccatgcgcggcgsgcttgtcgctcgcgca3cc3ggctccccgagccgccttcgcccgcgcatgtgctcgatcc3gg站gctcgcgcacgcccgactggagcgcgcggcggcgc柳aggccccgcttcggsggccgagcctcgcctggcggcacatcggtcg3gc33g3atcgtccgcggcggcg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isProGluAla40GlyArgAlaProArg45SerArgLieuArgAla50TrpArgArgLeuProGin55HislieSerSer60ProTrpArgHisLeuPro65ProGlyAlaArg70ValGlyThrSerCys75ProAlaAspArgArg80lieLeuProSerHis85ArgThrAlaAspIeuGlyThr90SerGlyGly95ThrLeuValAlaArg100MetSerGlyHisVal105AlaArgAsnProHis110AlaAlaValLeuVal115GlyAspGlySerAla120ArgGlyArgArgArg125LeuSerAsnArgArg130AlaGluArgArgValSer135AspValThrCys140ArgGluGlyGlyGluAla145MetGinLyslie150AlaGlyLysLeuVal155ValGlyLeulieSer160ValSerGlyMetSer165LeuLeuAlaAlaCysGly170GlyGluLysArg175SerGlyGlyGluAlaGinThrProGlyGlyAlaGinGlyGluAlaProVal180185ProValGlySerAlaValAspSerlie195200GluAlaArgCysAsnAsnlieGlyGin210215AspAlaCysSerAsnLyslieArgSer225230PheGlyGluCysProGlyGlylieAsp245L>euGluGlylieArgAsnGluGlyCys260265GlyArgValValAlaCysArgSerSer275280190ValAlaAlaArgCysAspArg205AspArgGluTyrSerSerLys220GluTrpArgAspGluLeuThr235AlaLysGin250GlyAsnProAspLeuCys240LeuAsnGluCys255PheAspThrUeu270ArgAspAlaArg285<210><211><212><213>20155PRT纖維堆嚢菌<400>20MetAspProArgAlaArgArgGluLysArgGlyProlieArgSer50ArgGly35AsnLeu65LeuAsnPheSerArglieArgProAspThrArg115Gin20ArgGlyAlaArgProThrProSerAsp85LysArgSerGin25ArgTrpAlalie40GluProGinMet55AspArgAspAla70ProAlaGlyProArgProSerLeuLeuAspSer1015GinGlyGlyHisMetGluLys30AlaGluGlyTyrlieProGly45ThrSerHisGluThrAlaCys60GinValAlalieThrValiyr7580TyrArgValThrValProAla9095Arg100lieValVal130HisAspThrGinHisValArgPheAsnAspLeuThrGluProGluPro105AspTyrAlaSerVallieGlu120ThrArgLeuAspSerArgGin135140110SerAspValPro125AlaGluAsnAlaLeulieSerThrlieAlaTyrThrAspArgGlu145150155<210>21<211>156<212>PRT<2">纖維堆囊菌<秦>21ValArgArgSerArg5TrpGinMetLysHis10ValAspThrGlyArg15ArgValGlyArgArglie20GlyLeuThrLeu25GlyLeuLeuAlaSerMet30AlaL>euAlaGlyCysGly35GlyProSer40GluLyslieValGin45GlyThrArgLeuAla50ProGlyAlaAspAla55HisValAlaAlaAsp60ValAspProAspAlaAla65ThrThrArgLeu70AlaValAspValVal75HisLeuSerProPro80GluArg工leGluAla85GlySerGluArgPhe90ValValTrpGinArg95ProSerSerGluSerPro100TrpGinArgVal105GlyValLeuAspTyrAsn110AlaAlaSerArgArgGly115LysLeuAla120GluThrThrValPro125HisAlaAsnPheGlu130LeuLeulieThrVal135GluLysGinSerSer140ProGinSerProSerSer145AlaAlaVallie150GlyProThrSerVal155Gly<210>22<211〉305<212〉PRT"ih纖維堆嚢菌<400>22MetGluLysGluSerArglieAlalieTyr10GlyAlalieAlaAla15AsnValAlalieAlaAla20ValLysPhe工le25AlaAlaAlaValThrGly30SerSerAlaiMetLeuSer35GluGlyVal40HisSerLeuValAsp45ThrAlaAspGlyJLeu50LeuLeuLeuLeuGly55LysHisArgSerAla60ArgProProAspAlaGlu65HisProPheGlyHis70GlyLysGluLeu75TyrPheTrpThrLeu80lieVslAlalieMet85liePheAlaAlaGlyGlyGlyVal90Serlie95TyrGluGlylieLeuHis100LeuLeuHisPro105ArgGinlieGluAspPro110ThrTrpAsnTyrValVal115LeuGlyAlaAla120AlaValPheGluGlyThr12SSerLeulie130lieSerlieHisGlu135PheLysLysLysAspGlyGinGlyTyr140<image>imageseeoriginaldocumentpage154</image>LysValThrSerSerAsplie130135<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述通用反向引物<400>24ggaaacsgctatgac仁3tg19<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述通用正向引物<400>25gtaaaacgacggccagt17<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物NH24末端"B"<400>26gtgactggcgcctggaatctgcatgagc:<210>27<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物NH2末端"A"<400>27agcgggagcttgctagacattctgtttc28<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物NH2末端，，B"<400>28gacgcgcctcgggcagcgccccaa24<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物pEP015-NH6末端"B"<400>29caccgaagcgtcgatc仁ggtccatc25<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物pEP015H2.7末端，，A，，<400>30cggtcagatcgacgacgggctttcc2權利要求1.一種分離的核酸分子，其中包含編碼至少一種參與epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列的互補體能夠與選自下組的核苷酸序列在下面定義的雜交條件下雜交SEQIDNO1的核苷酸43524-54920；所述雜交條件是在7％十二烷基硫酸鈉、0.5MNaPO4pH7.0、1mMEDTA中于50℃雜交，在2×SSC、1％SDS中于50℃洗滌。2.權利要求1的分離的核酸分子，其中包含其互補序列能與選自下組的核苷酸序列在下面定義的雜交條件下雜交的核苷酸序列SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920;所述雜交條件是在65T雜交36小時，并用0.1xSSC和0.5%SDS于651C洗滌20分鐘3次。3.權利要求1或2的分離的核酸分子，其中包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:6。4.權利要求1或2的分離的核酸分子，其中包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920。5.—種分離的核酸分子，其中包含參與epothilone生物合成的核苷酸序列，所述核苷酸序列的互補體能夠與選自下組的核苷酸序列在下面定義的雜交條件下雜交SEQIDNO:1的核苷酸42528-44760;所述雜交條件是在7%十二烷基硫酸鈉、0.5MNaP04pH7.0、lmMEDTA中于50t:雜交，在2xSSC、1%SDS中于50C洗滌。6.權利要求5的分離的核酸分子，其中包含其互補序列能與選自下組的核苷酸序列在下面定義的雜交條件下雜交的核苷酸序列SEQIDNO:1的核苷酸42528-44760;所述雜交條件是在65'C雜交36小時，并用0.1xSSC和0.5%SDS于651C洗滌20分鐘3次。7.權利要求5或6的分離的核酸分子，其中包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:6。8.權利要求5或6的分離的核酸分子，其中包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO:1的核苷酸42528-44760。9.權利要求1-8中任何一項的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列分離自粘細菌。10.權利要求9的分離的核酸分子，其中所述粘細菌是纖維堆嚢菌(Sorangiumcellulosum)。11.一種嵌合基因，其中包含權利要求1-10中任一項的核酸分子以及與之可操作連接的異源啟動子序列。12.—種重組載體，其中包含權利要求11的嵌合基因。13.—種重組宿主細胞，其中包含權利要求11的嵌合基因。14.權利要求13的重組宿主細胞，它是細菌。15.權利要求14的重組宿主細胞，它是放線菌(Actinomycete)。16.權利要求15的重組宿主細胞，它是鏈霉菌(Streptomyces)。17.—種Bac克隆，其中包含權利要求1-10中任一項的核酸分子。18.權利要求17的Bac克隆，它是pEP015。19.在重組宿主中異源表達epothilone的方法，包括a)將權利要求11的嵌合基因導入宿主；和b)在適合宿主生物合成epothilone的條件下培養宿主。20.生產epothilone的方法，包括a)用權利要求19的方法在重組宿主中表達epothilone;和b)從重組宿主中提取epothilone。21.—種分離的多肽，其參與epothilone生物合成，并且其由這樣的核苦酸序列編碼，所述核苷酸序列的互補體能夠與選自下組的核苷酸序列在下面定義的雜交條件下雜交SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920;所述雜交條件是在7%十二烷基硫酸鈉、0.5MNaP04pH7.0、ImMEDTA中于50匸雜交，在2xSSC、1%SDS中于50。C洗滌。22.權利要求21的分離的多肽，其中所述核苷酸序列的互補序列能與選自下組的核苷酸序列在下面定義的雜交條件下雜交SEQIDNO:1的核苷酸43524-54920;所述雜交條件是在65'C雜交36小時，并用0.1xSSC和0.5%SDS于65。C洗滌20分鐘3次。23.權利要求21或22的分離的多肽，其中包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:6。24.—種重組宿主細胞，其中包含重組表達的權利要求21、22或23的多肽。25.權利要求24的重組宿主細胞，它是細菌。26.權利要求25的重組宿主細胞，它是放線菌。27.權利要求26的重組宿主細胞，它是鏈霉菌。全文摘要由纖維堆囊菌分離得到編碼epothilone生物合成必需的多肽的核酸分子。還公開了用經本發明的基因轉化的重組宿主生產epothilone的方法。用這種方法生產的epothilone，足夠用于它們的純化和在藥用制劑(諸如治療癌癥)中的使用。文檔編號C12N15/52GK101161817SQ200710089099公開日2008年4月16日申請日期1999年6月16日優先權日1998年6月18日發明者D·西爾,I·莫爾納,J·M·利根,J·戈拉徹,R·澤克爾,T·斯徹普申請人:諾瓦提斯公司