專利名稱：檢測(cè)胃組織細(xì)胞中人vldlr基因的失活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)胃組織細(xì)胞中人極低密度脂蛋白受體(Very LowDensity Lipoprotein Receptor)(人VLDLR))基因的失活的方法。
背景技術(shù)：
在日本，每年有100,000人以上會(huì)患上胃癌(Gastric Cancer，GC)，其中男性較多，男女比例為約2∶1，是男性中最多發(fā)的癌癥。在日本每年的胃癌死亡人數(shù)約為50,000人，占全部因癌死亡人數(shù)的16％。根據(jù)迄今為止的研究，認(rèn)為是胃組織細(xì)胞在細(xì)胞分化和增殖的過(guò)程中一連串地發(fā)生了基因的變化，其結(jié)果是最終導(dǎo)致了癌化?？墒牵€不明確到底是怎樣的基因變化誘導(dǎo)了胃組織細(xì)胞的癌化。因此，現(xiàn)有狀況是還不存在胃癌的檢測(cè)方法和胃癌惡性程度的檢測(cè)方法。
在胃癌的診斷中，使用的是例如胃X射線檢查、胃內(nèi)窺鏡、血中胃蛋白酶原值、腫瘤標(biāo)記，其中胃內(nèi)窺鏡(能夠得到確診的唯一檢測(cè)方法)被廣泛使用?？墒牵@些大多屬于影像診斷、早期診斷的工具，并不是癌的確診、分型、進(jìn)度判定、有否轉(zhuǎn)移的判定方法。
著眼于基因的胃癌的檢測(cè)方法已知有例如專利文獻(xiàn)1記載的方法?？墒牵摲椒ㄊ侵塾诨虮磉_(dá)譜(expression profile)變化的一種方法。基因表達(dá)譜的測(cè)定是多個(gè)mRNA量的測(cè)定，由于mRNA非常不穩(wěn)定，容易分解，而且表達(dá)的動(dòng)態(tài)范圍(dynamic range)也比較大，所以通過(guò)微陣列(microarray)等測(cè)定的再現(xiàn)性就比較差。因此，需要一種更加穩(wěn)定、再現(xiàn)性高的方法。
比較基因組雜交(Comparative Genomic Hybridization(CGH))是一種檢測(cè)基因組中基因擴(kuò)增的靈敏度高、效率優(yōu)異的方法，本發(fā)明人采用該CGH陣列法鑒定了在胃癌細(xì)胞中擴(kuò)增的基因群，即在染色體2p24.1擴(kuò)增的SDC1基因、在染色體2p23.3擴(kuò)增的DNMT3A基因、在染色體3p22.3擴(kuò)增的MLH1基因、在染色體3p22.1擴(kuò)增的CTNNB1基因等(非專利文獻(xiàn)1)。
一般來(lái)說(shuō)，基因水平上的癌化結(jié)構(gòu)已經(jīng)報(bào)道了如上所述的多個(gè)基因的擴(kuò)增和癌抑制基因的缺失。在采用定位克隆等通常的方法的情況下，特定基因缺失的鑒定是非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，很難發(fā)現(xiàn)目的基因。而且，即便是CGH法，采用通常的中期染色體的方法檢測(cè)小于5-10Mb大小的基因組DNA的缺失也是非常困難的(非專利文獻(xiàn)2和3)。通過(guò)染色體作圖法(chromosome mapping)逐步縮小同源接合體缺失區(qū)域，最終鑒定出了目的癌抑制基因例如DPC4/SMAD4、RB1、PTEN、p16-INK4A、RASSF1等。
非專利文獻(xiàn)1Takada H，Imoto I，Tsuda H，Sonoda I，Ichikura T，Mochizuki H，Okanoue T，Inazawa J.Screening of DNA copy-numberaberration in gastric cancer cell lines by array-based comparativegenomic hybridization.Cancer Sci.2005 Feb；96(2)100-10非專利文獻(xiàn)2Bentz，M.，Plesch，A.，Stilgenbauer，S.，Dohner，H.&Lichter，P.Minimal sizes of deletions detected by comparativegenomichybridization，Genes chromosomes Cancer，172-175，1998.
非專利文獻(xiàn)3Kirchhoff，M.，Gerdes，T.，Maahr，J.，Rose，H.，Bentz，M.，Dohner，H.&Lundsteen，C.Deletions below 10 megabasepairs are detected in comparative genomic hybridization by standardreference intervas，Genes chromosomes Cancer，410-413，1999.
專利文獻(xiàn)1特表2005-514051號(hào)公報(bào)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明要解決的課題是提供一種新的胃癌相關(guān)基因、并檢測(cè)該癌相關(guān)基因的失活的方法。另一方面，本發(fā)明將發(fā)現(xiàn)新的胃癌相關(guān)基因、并通過(guò)檢測(cè)該癌相關(guān)基因的失活提供一種更加穩(wěn)定、再現(xiàn)性更高的胃癌檢測(cè)方法作為本發(fā)明要解決的課題。本發(fā)明還將提供基因水平上胃組織細(xì)胞的癌化的早期發(fā)現(xiàn)的方法、診斷胃癌惡性程度的方法、以及基于該機(jī)理篩選抗癌物質(zhì)的方法也作為本發(fā)明要解決的課題。
解決問題的手段本發(fā)明人提高了CGH法的靈敏度和精度，開發(fā)出了高通量(high-throughput)的方法。通過(guò)篩選CGH陣列上裝載的800種BAC/PAC DNA，成功鑒定了抑制胃組織細(xì)胞癌化的癌抑制基因，即人極低密度脂蛋白受體(Very Low Density Lipoprotein Receptor(VLDLR))基因(下面稱為人VLDLR基因)。而且判明了引發(fā)胃組織細(xì)胞癌化的原因在于人VLDLR基因的失活，并發(fā)現(xiàn)該基因的失活是由(1)該基因的缺失、和(2)該基因的CpG島的甲基化所引發(fā)。基于這些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
即，根據(jù)本發(fā)明，提供一種檢測(cè)胃組織細(xì)胞中的人VLDLR基因的失活的方法，其采用DNA芯片法、Southern印記法、Northern印記法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、FISH法或者CGH法。
優(yōu)選的是，使用人VLDLR基因的基因組DNA、cDNA、或者mRNA檢測(cè)人VLDLR基因的失活。
優(yōu)選的是，人VLDLR基因的失活是由該基因缺失所導(dǎo)致的失活。更優(yōu)選的是，人VLDLR基因的缺失是該基因的同源接合體缺失。
優(yōu)選的是，人VLDLR基因的失活是該基因CpG島的甲基化所導(dǎo)致的失活。
此外，本發(fā)明還提供了一種胃癌的檢測(cè)方法，其包括通過(guò)檢測(cè)胃組織細(xì)胞中的人VLDLR基因的失活而檢測(cè)出該胃組織細(xì)胞的癌化。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以準(zhǔn)確地把握胃組織細(xì)胞樣本中的癌化征兆、癌的發(fā)展進(jìn)度、惡性程度。


圖1圖1A表示HSC58細(xì)胞株的典型的二重陣列CGH圖像。RP11-48M17的9p24.2-24.3的拷貝數(shù)比(log2比值)的顯著減少以明確的紅色信號(hào)被檢測(cè)出。圖1B表示HSC58細(xì)胞的第9號(hào)染色體的典型的拷貝數(shù)譜圖(profile)。紅色和綠色線分別是表示9p24.2-24.3和9p21.2-21.3的同源接合體缺失的模式的候補(bǔ)點(diǎn)。圖1C表示使用包含HSC58的幾個(gè)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行的、GAPDH、陽(yáng)性對(duì)照、以及在9p24.2-24.3的同源接合體缺失的附近存在的典型基因的基因組PCR試驗(yàn)的圖像。PLC通常的末梢淋巴球。圖1D表示HSC58細(xì)胞株中覆蓋同源接合體缺失區(qū)域的9p24.2-24.3的譜圖。點(diǎn)接于陣列上的BAC用水平的白線表示，通過(guò)基因組PCR確定的HSC58細(xì)胞中同源接合體缺失區(qū)域用水平的白色箭頭表示。分別用黑色或灰色的線表示該區(qū)域周邊存在的13個(gè)基因在HSC58細(xì)胞株中是同源接合體缺失還是未缺失，表示出了位置和轉(zhuǎn)錄方向。
圖2A表示用基因組PCR分析檢測(cè)出的胃癌細(xì)胞株中的VLDLR的同源接合體缺失(楔形箭頭)。1MKN2，2MKN7，3MKN28，4MKN45，5MKN74，6KATO-III，7OKAJIMA，8OCUM-1，9HSC39，10HSC40A，11HSC41，12HSC42，13HSC43，14HSC44PE，15HSC45，16HSC57，17HSC58，18HSC60，19HSC64，20NUGC-2，21NUGC-3，22NUGC-4，23RERF-GC-1B，24AZ-521，25SNU216，26SNU484，27SNU601，28SNU638，29SNU668，30SNU719，31SH101P4，32Takigawa。圖2B表示通過(guò)RT-PCR檢測(cè)出的在胃癌細(xì)胞株和正常胃組織中VLDLR的表達(dá)。楔形記號(hào)表示在圖2A中具有同源接合體缺失的細(xì)胞株。不具有VLDLR的同源接合體缺失的31個(gè)細(xì)胞株中的9株(29.0％)顯示幾乎完全抑制該基因，7株(22.6％)與通常的胃組織比較顯示表達(dá)降低。圖2C表示通過(guò)基因組PCR分析在所研究的39個(gè)LCM處理的原發(fā)性胃癌中檢測(cè)出1個(gè)VLDLR的同源接合體缺失(楔形記號(hào))。圖2D表示使用CPGPLOT(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)鑒定的共計(jì)4個(gè)CpG島的概略圖。4對(duì)水平方向的箭頭分別表示551-bp、994-bp、297-bp、274bp的CpG島(從-471至+80為CpG-1；從+269至IVS+793為CpG-2；從IVS+826至IVS+1122為CpG-3；從IVS+1172至IVS+1445為CpG-4)。外顯子1以開放讀碼框(BOX)表示，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)標(biāo)記為+1，啟動(dòng)子分析中研究的片段(片段1-3)用粗黑線表示。亞硫酸氫鹽PCR(Bisulfite-PCR)分析以及用亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfitesequencing)研究的區(qū)域(BS-1和BS-2)用水平的灰線表示。最下部的箭頭表示MSP的引物位置。CpG位點(diǎn)用延伸軸上的垂直刻度表示。
圖3圖3A表示用5-aza-dCyd(10μM)處理5天或不進(jìn)行處理、以及/或用TSA(10ng/ml)處理24小時(shí)、在SNU601和MKN74細(xì)胞內(nèi)的VLDLR的表達(dá)，顯示的是典型的RT-PCR分析結(jié)果。圖3B表示有或無(wú)VLDLR CpG-1區(qū)域的啟動(dòng)子活性。將pGL3 basic的空載體(Mock)和包含VLDLR的外顯子1的上游或周邊的3個(gè)不同序列(片段1-3)中之一的構(gòu)建體導(dǎo)入SNU601細(xì)胞和MKN74細(xì)胞內(nèi)。熒光素酶活性相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照被標(biāo)準(zhǔn)化。圖中顯示的數(shù)據(jù)是分別三次重復(fù)進(jìn)行的3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±SEM。圖3C表示胃癌細(xì)胞株內(nèi)的經(jīng)HhaI消化后的VLDLR BS-2的亞硫酸氫鹽-PCR的典型結(jié)果。箭頭表示在被識(shí)別為甲基化CpG的位點(diǎn)用特異的限制酶消化的片段。圖3D表示VLDLR CpG-1的亞硫酸氫鹽測(cè)序的結(jié)果。用VLDLR表達(dá)細(xì)胞株(+)和VLDLR非表達(dá)細(xì)胞株(-)表示研究的結(jié)果。采用兩個(gè)片段(BS-1和BS-2)，確定了71個(gè)CpG位點(diǎn)的全序列。各個(gè)正方形表示CpG位點(diǎn)白色正方形為非甲基化，黑色正方形為甲基化。
圖4圖4A表示胃癌細(xì)胞株的VLDLR CpG-1的MSP分析的典型結(jié)果。與圖2A所示同樣地，數(shù)字表示各個(gè)GC細(xì)胞株。使用對(duì)非甲基化(U)和甲基化(M)的DNA特異的引物，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。圖4B表示原發(fā)性胃癌(T)和對(duì)應(yīng)的非癌胃組織(N)的VLDLR CpG-1的MSP分析的典型結(jié)果。圖4C表示7位原發(fā)性胃癌患者的、HhaI消化后的VLDLR BS-2的亞硫酸氫鹽-PCR分析的典型結(jié)果。表示通過(guò)MSP分析的腫瘤組織內(nèi)的甲基化。箭頭表示在被識(shí)別為甲基化的CpG的位點(diǎn)用特異的限制酶消化的片段。圖4D表示VLDLR BS-2的甲基化狀態(tài)由2種典型胃癌樣本對(duì)的亞硫酸氫鹽測(cè)序確定。N為正常組織，T為腫瘤組織。
具體實(shí)施例方式
下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。
本發(fā)明的胃癌檢測(cè)方法的特征是通過(guò)檢測(cè)胃組織細(xì)胞中的人VLDLR基因的失活而檢測(cè)出該胃組織細(xì)胞的癌化。
作為檢測(cè)人VLDLR基因失活的對(duì)象的胃組織細(xì)胞，合適的是試樣(樣本)提供者的活檢組織細(xì)胞。該試樣組織細(xì)胞可以不拘于是正常健康人的胃組織細(xì)胞還是胃癌患者的癌組織，但是從現(xiàn)實(shí)的角度考慮，主要對(duì)象是(1)根據(jù)內(nèi)窺鏡等檢查結(jié)果，胃組織中存在疑似癌化病變部的情況下的該病變組織，或者(2)已經(jīng)確定為胃癌，但需要判定其惡性程度或發(fā)展進(jìn)度的胃癌組織等。
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，當(dāng)確認(rèn)在“根據(jù)內(nèi)窺鏡等檢查結(jié)果，胃組織中存在疑似癌化病變部的情況下的該病變組織”中的人VLDLR基因失活的情況下，其表示該病變組織或者在向癌化發(fā)展或者已經(jīng)屬于癌化狀態(tài)，而且，判明惡性程度持續(xù)升高，需要及早進(jìn)行正式治療(由手術(shù)等切除病變部位、正式的化學(xué)療法等)。當(dāng)確認(rèn)“已經(jīng)確定為胃癌，但需要判定其惡性程度或發(fā)展進(jìn)度的胃癌組織”中的人VLDLR基因失活的情況下，也表示判明該癌組織的惡性程度持續(xù)升高，需要及早進(jìn)行正式治療(由手術(shù)等切除病變部位、正式的化學(xué)療法等)。作為試樣采取的胃組織可以進(jìn)行必要的處理，例如，由采取的組織制備DNA或RNA，作為進(jìn)行本發(fā)明檢測(cè)方法的對(duì)象。
如上所述，本發(fā)明的檢測(cè)方法是通過(guò)檢測(cè)胃組織細(xì)胞中的人VLDLR基因的失活從而能夠確定該細(xì)胞的癌化(特別是，癌化的起始)。該人VLDLR基因的失活的形式可以列舉(1)人VLDLR基因的缺失或(2)人VLDLR基因沒有缺失的情況下基因表達(dá)量的降低。
(1)人VLDLR基因的缺失可以直接進(jìn)行該人VLDLR基因缺失的檢測(cè)的代表性的方法可以列舉CGH(Comparative Genomic Hybridization)法、FISH(FluorescenceIn Situ Hybridization，熒光原位雜交)法。這些形式的檢測(cè)方法可以標(biāo)記具有人VLDLR基因的BAC(Bacterial Artificial Chromosome，細(xì)菌人工染色體)DNA、YAC(Yeast Artificial Chromosome，酵母人工染色體)DNA或PAC(Phage Artificial Chromosome，噬菌體人工染色體)DNA(下面也稱為BAC DNA等)，然后進(jìn)行FISH，cong而檢測(cè)人VLDLR基因的缺失部分。具體地，具有人VLDLR基因的BAC DNA可以列舉RP-11-671F16、RP11-320E16、RP11-578M2、RP11-719M6、RP11-941D23。
采用基因組DNA固定基質(zhì)進(jìn)行上述方法是合適的，而且是現(xiàn)實(shí)的。
由于通常得到的BAC DNA等的量很少，難以用于制造多個(gè)基因組DNA的固定化基質(zhì)，所以就需要將該DNA作為基因擴(kuò)增產(chǎn)物而獲得(該基因擴(kuò)增過(guò)程也稱為“無(wú)窮化”)。在無(wú)窮化過(guò)程中，首先將BAC DNA等用識(shí)別4堿基的酶例如RsaI、DpnI、HaeIII等消化以后，加入連接體(adaptor)進(jìn)行連接(ligation)。
連接體(adaptor)為由10-30個(gè)堿基、特別合適的是15-25個(gè)堿基組成的寡核苷酸，具有2條互補(bǔ)的序列，退火以后，形成平末端一側(cè)的3′端的寡核苷酸需要磷酸化。接下來(lái)，采用與連接體的一端的寡核苷酸具有相同序列的引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChain Reaction)法進(jìn)行擴(kuò)增，可以進(jìn)行無(wú)窮化。另一方面，可以將各BAC DNA等的特征性的50-70個(gè)堿基的氨基化寡核苷酸作為檢測(cè)用探針。
通過(guò)將以上述方式進(jìn)行無(wú)窮化的BAC DNA等固定于基質(zhì)上、優(yōu)選固定于固體基質(zhì)上，即可以制備出所希望的DNA固定基質(zhì)。固體基質(zhì)可以列舉玻璃、塑料、膜、三維陣列等，優(yōu)選載玻片等玻璃基板。玻璃等固體基質(zhì)更優(yōu)選通過(guò)多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、氨基硅烷、金·鋁等的粘附包被基質(zhì)。
將上述無(wú)窮化的DNA點(diǎn)接于基質(zhì)上的濃度優(yōu)選為10pg/μl至5μg/μl，更優(yōu)選為1ng/μl至200ng/μl。點(diǎn)接量?jī)?yōu)選為1nl至1μl，更優(yōu)選為10nl至100nl。對(duì)固定于基質(zhì)上的各個(gè)點(diǎn)的大小和形狀不作特別限定，例如，大小可以為直徑0.01-1mm，俯視形狀可以為圓形至橢圓形。對(duì)干燥點(diǎn)的厚度也不作特別限定，可以為1-100μm。進(jìn)一步，對(duì)點(diǎn)的個(gè)數(shù)不作特別限定，在每個(gè)使用的基質(zhì)上的個(gè)數(shù)可以為10-50,000個(gè)，更優(yōu)選為100-5,000個(gè)。雖然各個(gè)DNA可在單一至四次重復(fù)的范圍內(nèi)點(diǎn)接，但優(yōu)選是兩次重復(fù)或三次重復(fù)點(diǎn)接。
干燥點(diǎn)的制備可以通過(guò)采用點(diǎn)樣儀將無(wú)窮化的BAC DNA等滴于基質(zhì)上，形成多個(gè)點(diǎn)以后，將點(diǎn)干燥而制得。點(diǎn)樣儀可以使用噴墨式打印機(jī)、針形陣列式打印機(jī)、氣泡噴墨式(注冊(cè)商標(biāo)Bubble Jet)打印機(jī)，優(yōu)選使用噴墨式打印機(jī)。例如，可以使用GENESHOT(NGKINSULATORS株式會(huì)社，名古屋)等。
這樣，通過(guò)將無(wú)窮化的BAC DNA等固定于基質(zhì)上，特別合適的是固定于固體基質(zhì)上，可以制備出所希望的DNA固定化基質(zhì)。
而且，作為直接檢測(cè)該人VLDLR基因缺失的方法還可以列舉Sorthern印記法。Sorthern印記法是將從試樣得到的基因組DNA分離固定，通過(guò)檢測(cè)其與人VLDLR基因的雜交來(lái)檢測(cè)試樣中是否存在該基因的方法。另外，人VLDLR基因的堿基序列和氨基酸序列都已經(jīng)公知，分別表示于序列表的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
(2)人VLDLR基因沒有缺失的情況下基因表達(dá)量的降低檢測(cè)這種情況的方法，可以以人VLDLR基因(基因組DNA)為基礎(chǔ)，定量多核苷酸的量或人VLDLR蛋白質(zhì)的量，以該定量值為指標(biāo)，檢測(cè)人VLDLR基因表達(dá)的降低。上述的多核苷酸可以列舉由人VLDLR基因轉(zhuǎn)錄的mRNA、或以此為模板得到的cDNA。
另外，根據(jù)常規(guī)方法，可以制備出針對(duì)人VLDLR蛋白質(zhì)的抗體，采用該抗體對(duì)試樣中的人VLDLR蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，由此求得上述定量值，但是，本發(fā)明的檢測(cè)方法的檢測(cè)對(duì)象是基因表達(dá)量的“降低”，將蛋白質(zhì)量作為這種陰性檢測(cè)中的指標(biāo)，必須解決背景的存在等問題，還不能說(shuō)是高效的方法。因此，這種情況的檢測(cè)方法中，合適的是以人VLDLR基因(基因組DNA)為基礎(chǔ)、檢測(cè)多核苷酸的量的方法。該多核酸的量的檢測(cè)方法例如可以舉出以下方法最典型的形式就是通過(guò)檢測(cè)試樣中的以人VLDLR蛋白質(zhì)的mRNA為模板的cDNA，間接檢測(cè)出試樣中存在的mRNA，由此確定人VLDLR基因表達(dá)程度的檢測(cè)方法(下面將該種檢測(cè)方法也稱為VLDLR mRNA檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法包括下述的實(shí)時(shí)RT-PCR方法)。
在VLDLR mRNA檢測(cè)方法中，典型的是遵照公知的方法(例如采用寡聚dT的方法)，從試樣的總RNA中分離mRNA。然后，通過(guò)以與公知的人VLDLR基因的堿基序列對(duì)應(yīng)的核苷酸鏈作為擴(kuò)增用引物，并使用耐熱DNA聚合酶，由得到的mRNA中的mRNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增的基因擴(kuò)增法，例如，通過(guò)RT-PCR法，擴(kuò)增編碼人VLDLR蛋白質(zhì)的cDNA，再通過(guò)檢測(cè)由這些基因擴(kuò)增操作產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)、多少，即可以檢測(cè)出試樣中人VLDLR蛋白質(zhì)的mRNA的存在，此時(shí)優(yōu)選采用實(shí)時(shí)檢測(cè)。
實(shí)時(shí)RT-PCR法是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而實(shí)時(shí)測(cè)定目的基因的擴(kuò)增的方法，根據(jù)擴(kuò)增效率可以進(jìn)行作為模板的mRNA的定量。該定量可以采用熒光色素進(jìn)行，有兩種方法。即采用向雙鏈DNA特異性插入(intercalate)發(fā)出熒光的色素(例如，SYBR Green)的方法和采用對(duì)擴(kuò)增的DNA序列特異性的寡核苷酸上結(jié)合熒光色素的探針的方法。
如上所述，以擴(kuò)增的、編碼人VLDLR蛋白質(zhì)的cDNA為模板，進(jìn)一步再采用PCR法等，利用耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行基因擴(kuò)增操作，通過(guò)檢測(cè)由這些基因擴(kuò)增操作產(chǎn)生的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)、多少，即可以更加準(zhǔn)確地檢測(cè)出試樣中人VLDLR蛋白質(zhì)的mRNA的存在(該第二次基因擴(kuò)增操作中，需要以下述的方式選擇引物，即，與第1次基因擴(kuò)增操作使用的基因擴(kuò)增用引物相比，其互補(bǔ)核苷酸鏈位于人VLDLR基因的更內(nèi)側(cè))。
DNA芯片法是對(duì)試樣細(xì)胞中表達(dá)的mRNA進(jìn)行定量的方法之一。例如，在基質(zhì)(與上述CGH法中使用的基質(zhì)實(shí)質(zhì)上相同)上，將具有人VLDLR基因特征序列的寡核苷酸進(jìn)行固定(也可以固定cDNA)，將從試樣制備的RNA在通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。將該標(biāo)記的cDNA與基質(zhì)上的合成寡核苷酸進(jìn)行雜交，通過(guò)掃描結(jié)合的標(biāo)記的數(shù)量即可以測(cè)定mRNA的表達(dá)量。
Northern印記法是將試樣中獲得的mRNA分離、固定，通過(guò)檢測(cè)其與具有人VLDLR基因特征序列的合成寡核苷酸(也可以采用cDNA)的雜交來(lái)檢測(cè)試樣中人VLDLR基因的表達(dá)的方法。
除了人VLDLR基因缺失以外，該基因表達(dá)量減少的主要原因是人VLDLR基因的CpG島的甲基化而導(dǎo)致的失活。下面，針對(duì)該原因進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明。
已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)富含CpG的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域出現(xiàn)密集的甲基化時(shí)就會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄失活(Bird，A.P.&Wolffe A.P.Methylation-induced repression-belts，braces，and chromatin，Cell，451-454，1999)。在癌細(xì)胞中，CpG島與其它區(qū)域比較，存在高頻率的密集的甲基化，啟動(dòng)子區(qū)域的超甲基化(Hypermethylation)與人癌中的癌抑制基因的失活緊密相關(guān)(Ehrlich，M.，Jiang，G.，F(xiàn)iala，E.，Dome，J.S.，Yu，M.C.，Long，T.I.，Youn，B.，Sohn，O.S.，Widschwendter，M.，Tomlinson，G.E.，Chintagumpala，M.，Champagne，M.，Parham，D.，Liang，G.，Malik，K.，&Laird，P.W.Hypomethylationand hypermethylation of DNA in Wilms tumors，Oncogene，6694-6702，2002)。
如后所述，實(shí)際上，已經(jīng)證明人VLDLR基因的外顯子1的一部分和其上游區(qū)域中存在的CpG島具有啟動(dòng)子活性，而且，該CpG島的甲基化的程度與一部分胃癌細(xì)胞中的人VLDLR基因表達(dá)的抑制強(qiáng)烈相關(guān)。而且，通過(guò)將胃癌細(xì)胞在脫甲基化試劑5-氮雜-脫氧胞嘧啶(5-aza-dC)的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，可以使CpG島脫甲基化，其結(jié)果是，人VLDLR基因的表達(dá)可以恢復(fù)。根據(jù)這些結(jié)果可以證明CpG島的高度甲基化(Hypermethylation)是高頻引發(fā)胃癌細(xì)胞中癌抑制基因表達(dá)抑制的原因之一。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因這些實(shí)施例而受到限制。
實(shí)施例實(shí)施例1由National Cancer for Biotechnology和University of CaliforniaSanta Crus Biotechnology的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站和所選擇的DNA的BLAST檢索結(jié)果選擇了具有對(duì)癌化以及癌細(xì)胞增殖極端重要的基因或序列標(biāo)簽位置標(biāo)記(Sequence Tagged Site marker)的800種BAC/PAC克隆。
將BAC/PAC DNA用DpnI、RsaI、HaeIII進(jìn)行消化，然后，進(jìn)行與連接體DNA(adaptor DNA)的連接。接下來(lái)，采用具有連接體序列的引物進(jìn)行2次PCR。2條引物中的一個(gè)5′端被氨基化。將該步驟稱為“無(wú)窮化”，得到的DNA被定義為“無(wú)窮化DNA”。將該無(wú)窮化DNA使用噴墨型的點(diǎn)樣儀(GENESHOT，NGK Insulators，名古屋)兩次重復(fù)地以共價(jià)鍵打印于寡聚DNA微陣列(松浪硝子工業(yè)株式會(huì)社，大阪)上。
實(shí)施例2為了檢測(cè)出胃癌中的新的同源接合體缺失，使用由32種胃癌細(xì)胞制備的基因組DNA，使用實(shí)施例1的CGH陣列進(jìn)行CGH陣列分析。
另外，作為對(duì)照，使用男性健康人的基因組DNA，用Cy5進(jìn)行標(biāo)記。作為被檢測(cè)的DNA，使用由上述胃癌細(xì)胞制備的基因組DNA，并用Cy3進(jìn)行標(biāo)記。具體地，將DpnI消化的基因組DNA(0.5μg)在0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dGTP、0.1mM dCTP和0.4mMCy3-dCTP(胃癌細(xì)胞)或0.4mM Cy5-dCTP(正常細(xì)胞)的存在下，通過(guò)缺口翻譯(nick translation)進(jìn)行標(biāo)記。Cy3和Cy5標(biāo)記的dCTP從AmershamBiosciences公司(東京)獲得。將兩個(gè)標(biāo)記的基因組DNA在Cot-1 DNA(Invitrogen公司)的存在下加入乙醇，使其沉淀，溶解于120μl雜交混合液(50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、2×SSC(1×SSC150mM氯化鈉/15mM檸檬酸鈉))、4％十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulfate，PH7)。在37℃孵育30分鐘以后，加在設(shè)于雜交室(hybridization chamber)中的CGH陣列上，在37℃下、以3rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)的速度一邊振動(dòng)一邊孵育48-72小時(shí)。然后，將CGH陣列在50％甲酰胺/2×SSC(PH7.0)的溶液中50℃下清洗15分鐘，接下來(lái)在2×SSC/0.1％SDS中50℃下清洗15分鐘，進(jìn)一步再使用包含0.1％NonidetP-40的0.1M磷酸鹽緩沖液(PH8)在室溫下清洗15分鐘。風(fēng)干以后，用GenePix4000B掃描儀(Axon Instruments，CA，USA)檢測(cè)CGH陣列上來(lái)源于Cy3和Cy5的熒光。用GenePixPro4.1imaging軟件(Axon Instruments)分析所得到的結(jié)果。將來(lái)源于Cy3的熒光強(qiáng)度的平均值與來(lái)源于Cy5的熒光強(qiáng)度的平均值調(diào)整為相同的值，求得Cy3/Cy5的比值(ratio)。在基因組沒有異常的情況下，比值為1，當(dāng)比值為1.32以上時(shí)，基因組有擴(kuò)增，為4以上時(shí)被確認(rèn)具有顯著的擴(kuò)增。當(dāng)比值為0.75以下時(shí)基因組異源接合體缺失的可能性極大，當(dāng)為0.25以下時(shí)同源接合體缺失的可能性極大。
其結(jié)果顯示，胃癌(HSC58)細(xì)胞中存在于染色體9p24.2上的人VLDLR基因缺失了。此時(shí)的Log2比值為-2.63(圖1A采用被檢細(xì)胞HSC58的基因組DNA在實(shí)施例1所示的CGH陣列上進(jìn)行CGH分析時(shí)的代表性的陣列圖像。用明顯的信號(hào)(Log2比值＝-2.63)顯示出染色體9p24.2-24.3中的人VLDLR基因拷貝數(shù)減少(用右邊放大圖中的箭頭指示)。
對(duì)其它細(xì)胞種類進(jìn)行了研究，在31種胃癌細(xì)胞中(圖2A表示胃癌細(xì)胞中人VLDLR基因的同源接合體缺失的檢測(cè)。PLC表示采用正常健康人來(lái)源的DNA進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。將GAPDH(Glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase，3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的PCR作為對(duì)照。)沒有發(fā)現(xiàn)人VLDLR基因的同源接合體缺失。進(jìn)一步，在進(jìn)行激光捕獲顯微切割(Laser-captured microdissection(LCM))處理的原發(fā)性胃癌的39個(gè)樣品中的1個(gè)樣品(用圖2C的楔形記號(hào)表示。圖2C表示激光捕獲顯微切割處理的原發(fā)性胃癌中的人VLDLR基因的同源接合體的缺失。楔形記號(hào)表示檢測(cè)出同源接合體的缺失的細(xì)胞。將GAPDH基因的PCR作為對(duì)照。)檢測(cè)出了人VLDLR基因的同源接合體缺失。
實(shí)施例3由人VLDLR基因序列設(shè)計(jì)各2種引物，在胃癌細(xì)胞中用RT-PCR法檢測(cè)來(lái)源于兩區(qū)域的mRNA。
其結(jié)果顯示，在發(fā)生同源接合體缺失的細(xì)胞株中檢測(cè)不到mRNA。進(jìn)一步，在沒有發(fā)生同源接合體缺失的32個(gè)細(xì)胞株中的9個(gè)細(xì)胞株中沒有檢測(cè)出RT-PCR產(chǎn)物，在7個(gè)細(xì)胞株中同通常的胃組織比較顯示明顯的表達(dá)降低(圖2B表示通過(guò)RT-PCR分析檢測(cè)出的胃癌細(xì)胞的人VLDLR基因的表達(dá)。對(duì)圖2A中箭頭所示的表示同源接合體缺失的細(xì)胞同樣給予了箭頭標(biāo)記。在沒有發(fā)生同源接合體缺失的31種細(xì)胞中的9種細(xì)胞中，人VLDLR mRNA的表達(dá)以29.0％的比率消失，以22.6％的比率出現(xiàn)表達(dá)降低)。因此，不能檢測(cè)出人VLDLRmRNA的理由，除基因組上的基因缺失以外，還需要考慮其它機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了研究。
實(shí)施例4CpG島的甲基化是抑制基因表達(dá)的機(jī)制之一。采用CpGPLOT分析了人VLDLR基因的CpG島，結(jié)果鑒定了人VLDLR基因的外顯子1周圍的4個(gè)片段。顯示出本區(qū)域中CpG部位和CpG部位密集存在的CpG島(圖2D為人VLDLR基因的外顯子1周圍的CpG島的圖解，以白色方框表示外顯子1，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以+1表示。CpG島由CpGPLOT(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)鑒定，以水平箭頭表示。CpG島由人VLDLR基因的-514至+1914組成。用啟動(dòng)子分析法分析的區(qū)域(片段1至3)、進(jìn)行亞硫酸氫鹽-PCR分析的區(qū)域、進(jìn)行亞硫酸氫鹽測(cè)序的區(qū)域用水平線表示)。
這里，為了研究鑒定的人VLDLR基因的CpG島的啟動(dòng)子活性，將包含該CpG島周圍的區(qū)域分為3個(gè)片斷(圖2D的片段1-3)，將這些片段插入到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pGL3-Basic載體Promega，WI，USA)中，將SNU601細(xì)胞和MK704細(xì)胞與pRL-hTK內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)載體(Promega)瞬間共轉(zhuǎn)染。所使用的報(bào)告分析(reporter assay)，是通過(guò)對(duì)表達(dá)螢火蟲熒光素酶的信使RNA、并轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)作為活性酶起作用的發(fā)光物進(jìn)行測(cè)定來(lái)完成的。用pGL3-Basic載體(Promega)，將在下游配置熒光素酶基因、并作為啟動(dòng)子分析區(qū)域包含VLDLR基因的片段1至3的構(gòu)建體導(dǎo)入到不表達(dá)VLDLR基因的SNU601、MK704細(xì)胞中，測(cè)定其酶活性(圖3B)。片段2在兩個(gè)細(xì)胞中均顯示了較高的熒光素酶活性，由此證明，VLDLR基因的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的基本單位位于片段2。
根據(jù)是否進(jìn)行作為基因變異的檢測(cè)方法的亞硫酸氫鈉處理，基因組DNA中的非甲基化胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶結(jié)構(gòu)上比較穩(wěn)定，不受此反應(yīng)的影響，不轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁ＿M(jìn)行將其作為模板的PCR檢測(cè)，再與受甲基化影響的限制酶組合，通過(guò)限制酶是否進(jìn)行切割來(lái)分析來(lái)源于改變了的胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶的擴(kuò)增產(chǎn)物中的序列差異，即可以鑒定出甲基化DNA的存在(COBRA法亞硫酸氫鹽-PCR法與限制酶切割進(jìn)行組合的方法)。因此，通過(guò)COBRA法檢測(cè)出了VLDLR基因的外顯子1附近的甲基化(圖3C)。在VLDLR基因表達(dá)降低的MKN28、MKN74、KATO-III、SNU601、SNU638和SNU719細(xì)胞株中，由于存在HhaI的切割位點(diǎn)，在電泳中可觀察到3個(gè)切斷DNA(箭頭)。另一方面，在可以確認(rèn)VLDLR基因表達(dá)的MKN45、HSC41、NUGC-3、AZ-521、SNU216、SNU484和SH101P4細(xì)胞株中，由于不存在依賴于甲基化的限制酶切割位點(diǎn)，所以電泳只顯示單一條帶(M)。
通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfite sequence)法分析了人VLDLR基因的CpG島內(nèi)的各CpG二核苷酸的甲基化程度，結(jié)果顯示，在不存在同源接合體缺失的細(xì)胞(SNU601和MKN74)中，人VLDLR基因的CpG島的甲基化程度特別高，在表達(dá)人VLDLR基因的細(xì)胞(AZ-521)中沒有出現(xiàn)甲基化(圖3D表示人VLDLR基因的CpG島的基因組亞硫酸鹽測(cè)序序列。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以+1表示，CpG島為從+471至+1914。在該區(qū)域具有71個(gè)CpG部位，用格子表示，白格子是沒有甲基化的CpG部位，黑格子是被甲基化的CpG部位。使用的細(xì)胞是表達(dá)人VLDLR基因的細(xì)胞(用表達(dá)(+)表示)的AZ-521、和不表達(dá)人VLDLR基因的細(xì)胞(用表達(dá)(-)表示)的SNU601和MKN74)。因此，在胃癌細(xì)胞中存在人VLDLR基因的同源接合體的缺失的情況下和人VLDLR基因的CpG島高度甲基化的情況下，檢測(cè)不出人VLDLR基因的表達(dá)或表達(dá)非常低。這兩種情形強(qiáng)烈暗示了人VLDLR基因表達(dá)與胃組織細(xì)胞癌化之間的關(guān)系。
實(shí)施例5到此為止，已經(jīng)進(jìn)行了胃癌細(xì)胞中人VLDLR基因的CpG島的甲基化的分析。此外，又研究了實(shí)際上在胃癌細(xì)胞中是否也會(huì)發(fā)生同樣的現(xiàn)象。其結(jié)果顯示，在7例原發(fā)性胃癌中，發(fā)生了人VLDLR基因的CpG島的甲基化(圖4C表示COBRA分析原發(fā)性胃癌的人VLDLR基因的CpG島的甲基化。N為非癌胃組織，T為原發(fā)性胃癌組織)。根據(jù)以上結(jié)果可以推理得出由人VLDLR基因的CpG島的甲基化導(dǎo)致的人VLDLR基因的失活對(duì)胃組織細(xì)胞的癌化具有重要的作用。
實(shí)施例6研究了將胃癌細(xì)胞中的人VLDLR基因CpG島進(jìn)行脫甲基化時(shí)的人VLDLR基因的表達(dá)情況。具體地，在各種濃度的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC的存在下，將胃癌細(xì)胞處理5日，測(cè)定此時(shí)的人VLDLRmRNA的誘導(dǎo)能力。其結(jié)果顯示，在人VLDLR基因不缺失但也檢測(cè)不出人VLDLR mRNA的細(xì)胞中，通過(guò)進(jìn)行5-aza-dC處理，呈現(xiàn)出了人VLDLR mRNA的誘導(dǎo)能力(圖3A表示在5-aza-dC的存在和不存在下胃癌細(xì)胞中人VLDLR基因的表達(dá)分析。采用用于擴(kuò)增人VLDLR基因的2種特異引物進(jìn)行RT-PCR，顯示了其電泳結(jié)果的條帶。GAPDH作為內(nèi)標(biāo)使用。作為模板使用的基因組是將不存在同源接合體缺失、但又不表達(dá)人VLDLR基因的細(xì)胞(SNU601、MKN74)在5-aza-dC的存在和不存在下培養(yǎng)5天后進(jìn)行制備)。
實(shí)施例7明確了伴隨CpG島甲基化的基因抑制是起因于改變了基因組的染色體結(jié)構(gòu)。同樣，與基因組互作的組蛋白的低乙?；哺淖兞嘶蚪M結(jié)構(gòu)，影響基因表達(dá)。采用組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA) (Trichostatin A)與甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC研究了CpG甲基化與組蛋白乙酰化的關(guān)系。
將人VLDLR基因的CpG島呈密集甲基化的SNU601細(xì)胞和MKN74細(xì)胞在TSA存在下孵育，結(jié)果與TSA不存在下相比表達(dá)量沒有變化(圖3A表示在5-aza-dC和TSA存在下培養(yǎng)后的、不表達(dá)人VLDLR基因的胃癌細(xì)胞(SNU601和MKN74)中人VLDLR mRNA的表達(dá)。將兩種細(xì)胞在5-aza-dC存在下培養(yǎng)5天、在TSA存在下或5-aza-dC和TSA共同存在下培養(yǎng)12小時(shí)。將由各自的細(xì)胞制備的基因組DNA作為模板，采用擴(kuò)增人VLDLR基因的2種特異引物進(jìn)行RT-PCR，示出電泳結(jié)果條帶。GAPDH作為內(nèi)標(biāo)使用)。結(jié)果，在TSA和5-aza-dC共同存在下孵育的兩種細(xì)胞均沒有發(fā)現(xiàn)人VLDLR基因的表達(dá)變化。該結(jié)果暗示出，只有CpG島的甲基化對(duì)人VLDLR基因的表達(dá)具有影響，人VLDLR基因的表達(dá)與染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化無(wú)關(guān)。
實(shí)施例8關(guān)于啟動(dòng)子區(qū)的甲基化的檢測(cè)方法，通過(guò)亞硫酸氫鈉處理，基因組DNA中的非甲基化胞嘧啶(C)可以改變?yōu)槟蜞奏?U)，通過(guò)采用與亞硫酸氫鈉處理后的變化部位尿嘧啶對(duì)應(yīng)的引物對(duì)此被檢DNA進(jìn)行PCR，即可以進(jìn)行特定部位甲基化的檢測(cè)(甲基化特異的PCR法Methylation Specific PCR，MSP)。利用該方法，采用如圖2D所示的MSP引物對(duì)來(lái)自于胃癌細(xì)胞株、以及臨床樣品的鄰近正常組織、癌組織的樣品進(jìn)行分析(圖4A和4B；U非甲基化、M甲基化、N正常部位、T腫瘤部位)。并且，在胃癌細(xì)胞株中獲得了預(yù)想的結(jié)果，即不表達(dá)VLDLR基因的MKN74(No.5)、SNU601(No.27)兩株的啟動(dòng)子部位被甲基化(MSP法的結(jié)果)，而在表達(dá)VLDLR基因的AZ-521(No.24)細(xì)胞中則未被甲基化。在通過(guò)MSP法對(duì)臨床癌組織的甲基化進(jìn)行分析，20個(gè)樣本中7個(gè)樣本被檢出了甲基化。而且在能夠分析癌組織和鄰近正常組織的7個(gè)樣本中，有5個(gè)樣本在癌組織檢測(cè)出了癌部位特異的甲基化，而在鄰近正常部位沒有檢測(cè)出甲基化。采用檢測(cè)出這些甲基化差異的樣本(17、21)，按照亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfite-sequence)法進(jìn)一步對(duì)VLDLR基因BS-2區(qū)域(參考圖2D)進(jìn)行甲基化分析(圖4D)。在檢測(cè)出甲基化差異的癌樣本17、21中觀察到了預(yù)想的甲基化(甲基化部位用黑色表示)。
將在上述各實(shí)施例中使用的引物序列和PCR條件記載于下面的表1中。
表1VLDLR基因的引物序列和PCR條件

序列表<110>富士膠片株式會(huì)社<120>檢測(cè)胃組織細(xì)胞中人VLDLR基因的失活的方法<130>FI-070327-59<160>14<210>1<211>3646<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ctctccggcc gccgccggtg cgggtgctcc gctaccggct cctctccgtt ctgtgctctc 60ttctgctctc ggctccccac cccctctccc ttccctcctc tccccttgcc tcccctcctc 120tgcagcgcct gcattatttt ctgcccgcag gctcggcttg cactgctgct gcagcccggg 180gaggtggctg ggtgggtggg gaggagactg tgcaagttgt aggggagggg gtgccctctt 240cttccccgct cccttccccc gccaactcct tcccctcctt ctcccccttt cccctccccg 300cccccacctt cttcctcctt tcggaaggac tggtaacttg tcgtgcggag cgaacggcgg 360cggcggcggc ggcggcggca ccatccaggc gggcaccatg ggcacgtccg cgctctgggc 420gctctggctg ctgctcgcgc tgtgctgggc gccccgggag agcggcgcca ccggaaccgg 480gagaaaagcc aaatgtgaac cctcccaatt ccagtgcaca aatggtcgct gtattacgct 540gttgtggaaa tgtgatgggg atgaagactg tgttgacggc agtgatgaaa agaactgtgt 600aaagaagacg tgtgctgaat ctgacttcgt gtgcaacaat ggccagtgtg ttcccagccg 660atggaagtgt gatggagatc ctgactgcga agatggttca gatgaaagcc cagaacagtg 720ccatatgaga acatgccgca tacatgaaat cagctgtggc gcccattcta ctcagtgtat 780cccagtgtcc tggagatgtg atggtgaaaa tgattgtgac agtggagaag atgaagaaaa 840ctgtggcaat ataacatgta gtcccgacga gttcacctgc tccagtggcc gctgcatctc 900caggaacttt gtatgcaatg gccaggatga ctgcagcgat ggcagtgatg agctggactg 960tgccccgcca acctgtggcg cccatgagtt ccagtgcagc acctcctcct gcatccccat 1020cagctgggta tgcgacgatg atgcagactg ctccgaccaa tctgatgagt ccctggagca 1080gtgtggccgt cagccagtca tacacaccaa gtgtccagcc agcgaaatcc agtgcggctc 1140tggcgagtgc atccataaga agtggcgatg tgatggggac cctgactgca aggatggcag 1200tgatgaggtc aactgtccct ctcgaacttg ccgacctgac caatttgaat gtgaggatgg 1260cagctgcatc catggcagca ggcagtgtaa tggtatccga gactgtgtcg atggttccga 1320tgaagtcaac tgcaaaaatg tcaatcagtg cttgggccct ggaaaattca agtgcagaag 1380tggagaatgc atagatatca gcaaagtatg taaccaggag caggactgca gggactggag 1440tgatgagccc ctgaaagagt gtcatataaa cgaatgcttg gtaaataatg gtggatgttc 1500
tcatatctgc aaagacctag ttataggcta cgagtgtgac tgtgcagctg ggtttgaact 1560gatagatagg aaaacctgtg gagatattga tgaatgccaa aatccaggaa tctgcagtca 1620aatttgtatc aacttaaaag gcggttacaa gtgtgaatgt agtcgtggct atcaaatgga 1680tcttgctact ggcgtgtgca aggcagtagg caaagagcca agtctgatct tcactaatcg 1740aagagacatc aggaagattg gcttagagag gaaagaatat atccaactag ttgaacagct 1800aagaaacact gtggctctcg atgctgacat tgctgcccag aaactattct gggccgatct 1860aagccaaaag gctatcttca gtgcctcaat tgatgacaag gttggtagac atgttaaaat 1920gatcgacaat gtctataatc ctgcagccat tgctgttgat tgggtgtaca agaccatcta 1980ctggactgat gcggcttcta agactatttc agtagctacc ctagatggaa ccaagaggaa 2040gttcctgttt aactctgact tgcgagagcc tgcctccata gctgtggacc cactgtctgg 2100ctttgtttac tggtcagact ggggtgaacc agctaaaata gaaaaagcag gaatgaatgg 2160attcgataga cgtccactgg tgacagcgga tatccagtgg cctaacggaa ttacacttga 2220ccttataaaa agtcgcctct attggcttga ttctaagttg cacatgttat ccagcgtgga 2280cttgaatggc caagatcgta ggatagtact aaagtctctg gagttcctag ctcatcctct 2340tgcactaaca atatttgagg atcgtgtcta ctggatagat ggggaaaatg aagcagtcta 2400tggtgccaat aaattcactg gatcagagct agccactcta gtcaacaacc tgaatgatgc 2460ccaagacatc attgtctatc atgaacttgt acagccatca ggtaaaaatt ggtgtgaaga 2520agacatggag aatggaggat gtgaatacct atgcctgcca gcaccacaga ttaatgatca 2580ctctccaaaa tatacctgtt cctgtcccag tgggtacaat gtagaggaaa atggccgaga 2640ctgtcaaagt actgcaacta ctgtgactta cagtgagaca aaagatacga acacaacaga 2700aatttcagca actagtggac tagttcctgg agggatcaat gtgaccacag cagtatcaga 2760ggtcagtgtt cccccaaaag ggacttctgc cgcatgggcc attcttcctc tcttgctctt 2820agtgatggca gcagtaggtg gctacttgat gtggcggaat tggcaacaca agaacatgaa 2880aagcatgaac tttgacaatc ctgtgtactt gaaaaccact gaagaggacc tctccataga 2940cattggtaga cacagtgctt ctgttggaca cacgtaccca gcaatatcag ttgtaagcac 3000agatgatgat ctagcttgac ttctgtgaca aatgttgacc tttgaggtct aaacaaataa 3060tacccccgtc ggaatggtaa ccgagccagc agctgaagtc tctttttctt cctctcggct 3120ggaagaacat caagatacct ttgcgtggat caagcttgtg tacttgaccg tttttatatt 3180acttttgtaa atattcttgt ccacattcta cttcagcttt ggatgtggtt accgagtatc 3240tgtaaccctt gaatttctag acagtattgc cacctctggc caaatatgca ctttccctag 3300aaagccatat tccagcagtg aaacttgtgc tatagtgtat accacctgta catacattgt 3360ataggccatc tgtaaatatc ccagagaaca atcactattc ttaagcactt tgaaaatatt 3420tctatgtaaa ttattgtaaa ctttttcaat ggttgggaca atggcaatag gacaaaacgg 3480gttactaaga tgaaattgcc aaaaaaattt ataaactaat tttgtacgta tgaatgatat 3540ctttgacctc aatggaggtt tgcaaagact gagtgttcaa actactgtac attttttttc 3600
aagtgctaaa aaattaaacc aagcagctta accatgaaaa aaaaaa 3646<210>2<211>873<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Gly Thr Ser Ala Leu Trp Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Cys1 5 10 15Trp Ala Pro Arg Glu Ser Gly Ala Thr Gly Thr Gly Arg Lys Ala Lys20 25 30Cys Glu Pro Ser Gln Phe Gln Cys Thr Asn Gly Arg Cys Ile Thr Leu35 40 45Leu Trp Lys Cys Asp Gly Asp Glu Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu50 55 60Lys Asn Cys Val Lys Lys Thr Cys Ala Glu Ser Asp Phe ValCys Asn65 70 75 80Asn Gly Gln Cys Val Pro Ser Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Pro Asp85 90 95Cys Glu Asp Gly Ser Asp Glu Ser Pro Glu Gln Cys His Met Arg Thr100 105 110Cys Arg Ile His Glu Ile Ser Cys Gly Ala His Ser Thr Gln Cys Ile115 120 125Pro Val Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Asn Asp Cys Asp Ser Gly Glu130 135 140Asp Glu Glu Asn Cys Gly Asn Ile Thr Cys Ser Pro Asp Glu Phe Thr145 150 155 160Cys Ser Ser Gly Arg Cys Ile Ser Arg Asn Phe Val Cys Asn Gly Gln165 170 175Asp Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Leu Asp Cys Ala Pro Pro Thr180 185 190Cys Gly Ala His Glu Phe Gln Cys Ser Thr Ser Ser Cys Ile Pro Ile195 200 205Ser Trp Val Cys Asp Asp Asp Ala Asp Cys Ser Asp Gln Ser Asp Glu210 215 220Ser Leu Glu Gln Cys Gly Arg Gln Pro Val Ile His Thr Lys Cys Pro
225 230 235 240Ala Ser Glu Ile Gln Cys Gly Ser Gly Glu Cys Ile His Lys Lys Trp245 250 255Arg Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn260 265 270Cys Pro Ser Arg Thr Cys Arg Pro Asp Gln Phe Glu Cys Glu Asp Gly275 280 285Ser Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Val290 295 300Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn Cys Lys Asn Val Asn Gln Cys Leu Gly305 310 315 320Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg Ser Gly Glu Cys Ile Asp Ile Ser Lys325 330 335Val Cys Asn Gln Glu Gln Asp Cys Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu340 345 350Lys Glu Cys His Ile Asn Glu Cys Leu Val Asn Asn Gly Gly Cys Ser355 360 365His Ile Cys Lys Asp Leu Val Ile Gly Tyr Glu Cys Asp Cys Ala Ala370 375 380Gly Phe Glu Leu Ile Asp Arg Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys385 390 395 400Gln Asn Pro Gly Ile Cys Ser Gln Ile Cys Ile Asn Leu Lys Gly Gly405 410 415Tyr Lys Cys Glu Cys Ser Arg Gly Tyr Gln Met Asp Leu Ala Thr Gly420 425 430Val Cys Lys Ala Val Gly Lys Glu Pro Ser Leu Ile Phe Thr Asn Arg435 440 445Arg Asp Ile Arg Lys Ile Gly Leu Glu Arg Lys Glu Tyr Ile Gln Leu450 455 460Val Glu Gln Leu Arg Asn Thr Val Ala Leu Asp Ala Asp Ile Ala Ala465 470 475 480Gln Lys Leu Phe Trp Ala Asp Leu Ser Gln Lys Ala Ile Phe Ser Ala485 490 495Ser Ile Asp Asp Lys Val Gly Arg His Val Lys Met Ile Asp Asn Val500 505 510
Tyr Asn Pro Ala Ala Ile Ala Val Asp Trp Val Tyr Lys Thr Ile Tyr515 520 525Trp Thr Asp Ala Ala Ser Lys Thr Ile Ser Val Ala Thr Leu Asp Gly530 535 540Thr Lys Arg Lys Phe Leu Phe Asn Ser Asp Leu Arg Glu Pro Ala Ser545 550 555 560Ile Ala Val Asp Pro Leu Ser Gly Phe Val Tyr Trp Ser Asp Trp Gly565 570 575Glu Pro Ala Lys Ile Glu Lys Ala Gly Met Asn Gly Phe Asp Arg Arg580 585 590Pro Leu Val Thr Ala Asp Ile Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp595 600 605Leu Ile Lys Ser Arg Leu Tyr Trp Leu Asp Ser Lys Leu His Met Leu610 615620Ser Ser Val Asp Leu Asn Gly Gln Asp Arg Arg Ile Val Leu Lys Ser625 630 635 640Leu Glu Phe Leu Ala His Pro Leu Ala Leu Thr Ile Phe Glu Asp Arg645 650 655Val Tyr Trp Ile Asp Gly Glu Asn Glu Ala Val Tyr Gly Ala Asn Lys660 665 670Phe Thr Gly Ser Glu Leu Ala Thr Leu Val Asn Ash Leu Asn Asp Ala675 680 685Gln Asp Ile Ile Val Tyr His Glu Leu Val Gln Pro Ser Gly Lys Asn690 695 700Trp Cys Glu Glu Asp Met Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys Leu705 710 715 720Pro Ala Pro Gln Ile Asn Asp His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ser Cys725 730 735Pro Ser Gly Tyr Asn Val Glu Glu Asn Gly Arg Asp Cys Gln Ser Thr740 745 750Ala Thr Thr Val Thr Tyr Ser Glu Thr Lys Asp Thr Asn Thr Thr Glu755 760 765Ile Ser Ala Thr Ser Gly Leu Val Pro Gly Gly Ile Asn Val Thr Thr770 775 780Ala Val Ser Glu Val Ser Val Pro Pro Lys Gly Thr Ser Ala Ala Trp
785 790 795 800Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Leu Val Met Ala Ala Val Gly Gly Tyr805 810 815Leu Met Trp Arg Asn Trp Gln His Lys Asn Met Lys Ser Met Asn Phe820 825 830Asp Asn Pro Val Tyr Leu Lys Thr Thr Glu Glu Asp Leu Ser Ile Asp835 840 845Ile Gly Arg His Ser Ala Ser Val Gly His Thr Tyr Pro Ala Ile Ser850 855 860Val Val Ser Thr Asp Asp Asp Leu Ala865870<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>3ccacagatat cagttgtaag ca22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4aaaagagact tcagctgctg g21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>5ctagtcaaca acctgaatga tg22
<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>6aagaatggcc catgcggcag aa22<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>7gaaattgtaa gtatttttta ggtgt25<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>8tacctatcct aatttcctaa tcc23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>9ggattaggaa attaggatag gta23<210>10<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>10cccacccaac cacctccc1 8<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>11gagttttagg cgaacgcgc19<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>12ctcctttccc tcgacgcg18<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>13ttgtgagttt taggtgaatg tgt23<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA
<400>14ccctcctttc cctcaacaca。20
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)胃組織細(xì)胞中人VLDLR基因的失活的方法，其采用DNA芯片法、Southern印記法、Northern印記法、實(shí)時(shí)RT-PCR法、FISH法或者CGH法。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其使用人VLDLR基因的基因組DNA、cDNA、或者mRNA檢測(cè)該基因的失活。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其中，人VLDLR基因的失活是由該基因的缺失所導(dǎo)致的失活。
4.權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其中，人VLDLR基因的缺失是該基因的同源接合體缺失。
5.權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其中，人VLDLR基因的失活是該基因CpG島的甲基化所導(dǎo)致的失活。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的檢測(cè)胃組織細(xì)胞中人VLDLR基因的失活的方法。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)胃組織細(xì)胞中人VLDLR基因的失活方法，其采用DNA芯片法、Southern印記法、Northern印記法、實(shí)時(shí)RT－PCR法、FISH法或者CGH法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101092650SQ20071009794
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者高田久, 井本逸勢(shì), 稻澤讓治 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社, 國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)