專利名稱：一種重金屬超富集植物天藍遏藍菜遺傳轉化方法的建立及轉基因苗的培育的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物生物技術領域；特別涉及一種重金屬超富集植物天 藍遏藍菜的農桿菌介導的轉化以及轉基因苗的培育方法。
背景技術：
天藍遏藍菜(caejY/Jesce/75")屬于十字花科遏藍菜屬，廣 泛分布于北歐，是一種Zn和Cd的超積累植物。因此天藍遏藍菜已成為 世界上研究植物對重金屬的超累積現象的主要植物之一。天藍遏藍菜以 其對鋅的超富集而稱著，同時也是鎘和鎳的超累積植物。Baker和 NcGrath研究發現，土壤含Zn 444mg/kg時，天藍遏藍菜地上部Zn的含 量可達到土壤的16倍。有文獻報道在污染地區和富含礦物質的土壤中 生長的天藍遏藍菜對鋅、鎘、鎳的累計量分別達到30，000ugZngLwt， 14， OOOug Cdg—M. wt， 4700ugNig—M. wt。大多數植物累積Zn達到100ppm 時即表現中毒癥狀,而天藍遏藍菜可累積Zn達26,000ppm卻未表現出任 何受傷癥狀(Brown et al,1995)。隨著有關植物重金屬富集現象數據的不 斷積累，已有越來越多的研究者將研究重點轉移到植物積累重金屬中所 涉及的生物化學、分子生物學和植物生理學等研究領域。
擬南芥、煙草等是人們研究新功能基因的主要模式植物。然而，現 有的模式植物并不具備對重金屬超富集與耐受這樣的生理機能。所以， 運用分子生物學、基因組學、蛋白質組學等先進的生物學研究技術，發 展新的具有重金屬超富集和耐受性的模式植物，將使這一領域的研究規 范化、深入化，研究結果可比性高，達到事半功倍的效果。
天藍遏藍菜雖然具備較好的重金屬富集與耐受能力，而且被國內外 研究人員看好，但目前尚未出現與其轉基因研究相關的報道。本發明旨 在提供一種重金屬超富集植物天藍遏藍菜轉基因苗培育方法，建立并基 本完善天藍遏藍菜的農桿菌轉化體系，為其成為具有重金屬超富集與耐 受的模式植物提供有效技術途徑。

發明內容
本發明的目的在于提供一種重金屬超富集植物天藍遏藍菜的農桿菌 介導的轉化方法以及建立轉基因苗的培育，以滿足天藍遏藍菜轉基因研 究和生產實際應用的需求。
技術方案如下
本發明提供了重金屬超富集植物天藍遏藍菜的根癌農桿菌介導的遺 傳轉化及其轉基因苗的培養方法，其步驟如下 1)建立初代培養物一天藍遏藍菜幼苗
取天藍遏藍菜成熟種子，用酒精進行表面消毒，置于氯化汞中浸泡 后取出；再進行無菌水沖洗，滅菌，并用濾紙吸干其表面水分；
再置于種子萌發培養基上培養7 - 15天，得初代培養物一天藍遏藍 菜幼苗；其培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯，光照時間16 小時/天，溫度20-25。C;
所述種子萌發培養基為MS培養基；
2) 天藍遏藍菜叢生芽的培養
將上述天藍遏藍菜幼苗置于分化培養基上進行叢生芽的分化培養 10-14天，至莖節處分化出叢狀小苗即叢生芽；其培養條件為光照強 度為3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25°C;
所述分化培養基所含組分及配比為每升分化培養基中含水解乳蛋 白300毫克，維生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖10-40毫 克，瓊脂5-IO毫克，以及6-節基腺嘌呤、萘乙酸兩種植物生長激素各 0.1 - 8毫克，pH=5.8;
所述分化基本培養基為MS培養基；
3) 天藍遏藍菜叢生芽的預培養
將以上所述天藍遏藍菜叢生芽平鋪在預培養培養基上進行預培養2 -3天；其預培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯，光照時間 16小時/天，溫度20- 25。C;
所述預培養培養基所含組分及配比為每升預培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖 10-40毫克，瓊脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和激動素、6-卡基腺噤呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH=5.2;
所述預培養基本培養基為MS培養基；4)農桿菌的活化
分別挑取帶有雙子葉植物表達載體的農桿菌單菌落，接種到5毫升 LB農桿菌液體培養基中培養8小時；其培養條件為28。C, 200轉/分；
取培養過夜的LB農桿菌培養液，按1: 40的比例稀釋至20毫升LB 液體農桿菌培養基中，繼續培養5-6小時，至OD6o。為0.6;經5000 轉/分，離心5 min;收集菌體，用侵染液體培養基懸浮沉淀，稀釋至 OD6。。為0.15侵染液體培養基；備用；
所述LB農桿菌液體培養基所含組分及配比為每升LB農桿菌液體 培養基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化鈉，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH = 7.0;
所述侵染液體培養基為液體MS培養基，pH = 5.2; 5)經預培養的天藍遏藍菜叢生芽的農桿菌侵染和共培養
將預培養2-3天的天藍遏藍菜叢生芽置于上述含有農桿菌的OD600 為0.15的侵染液體培養基中，浸泡5-15分鐘后取出；用濾紙吸干附著 其表面的菌液，平鋪在共培養培養基上，25。C下，暗培養2天；
所述共培養培養基所含組分及配比為每升共培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖 10-40毫克，瓊脂5-IO毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和激動素、6-千基腺嘌呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH=5.2;
所述共培養基本培養基為MS培養基；
6)前培養
將步驟5)培養后的天藍遏藍菜叢生芽取出，分別置于三角瓶中；用 無菌水沖洗3-5次后，再用含羧千青霉素500毫克/升的無菌水沖洗3 次，每次IO分鐘；用含羧千青霉素500毫克/升的MS液體培養基沖洗1 -2次；將叢生芽取出，用濾紙吸干水分，超凈工作臺中吹干；平鋪于 前培養基上培養3-15天；其培養條件光照強度3000 - 5000勒克斯， 光照時間16小時/天，溫度20-25。C;
所述前培養培養基所含組分及配比為每升前培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖 10-40毫克，瓊脂5-10毫克，羧千青霉素250毫克和激動素、6-芐基 腺嘌呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH=5.8; 所述前培養基本培養基為MS培養基；7)篩選培養
將經前培養3-15天的天藍遏藍菜叢生芽取出，轉移至篩選培養基 上；培養條件光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫 度20- 25。C; 18天繼代一次，得試管叢生芽苗；
所述篩選培養基所含組分及配比為每升篩選基本培養基中含水解 乳蛋白300毫克，維生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，羧芐青霉素250毫克，卡那霉素5-50毫克 和激動素、6-節基腺噤呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH =5.8;
所述篩選基本培養基為MS培養基； 8)壯苗培養
將經過篩選培養的不少于3厘米的試管叢生芽苗修剪成帶2-3個節的 莖段，接種到壯苗培養基中培養18-35天，得試管苗；
所述壯苗培養基所含組分及配比為每升壯苗基本培養基中含蔗糖 10-40毫克，瓊脂5-IO毫克，肌醇50- 300毫克，羧千青霉素250 毫克和卡那霉素5-50毫克，pH=5.8;
所述壯苗基本培養基為MS培養基；
9) 生根培養
將經過壯苗培養3.5-8厘米的試管苗，接種到生根培養基中培養18 -25天，得生根苗；從培養基中取出，洗去附著的培養基，轉移至荷格 蘭特液體培養基中進行水培繼續生根培養；其培養條件為以泡沫板作
為幼苗支持物，泡沫板大小應與水培槽口大小一致，盡量避免根部見光 導致綠藻滋生；每5天更換一次荷格蘭特液體培養基；22- 25°C,光 照16小時/天，濕度80- 85%;
所述生根培養基所含組分及配比為每升生根基本培養基中含蔗糖 10-40毫克，瓊脂5-10毫克，肌醇50- 300毫克，羧千青霉素250 毫克和卡那霉素5-50毫克，pH=5.8;
所述生根基本培養基為1/2MS培養基；
10) 移栽定植
待經水培生根培養至根長不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基質中，進行移栽定植；所述苗圃基質由重量份配比為1:1花土和蛭 石組成；幼苗移栽前，將苗圃基質用荷格蘭特液體培養基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆蓋，保持濕度90- 95%，注意通風；每5天噴水1次， 14天噴施1次荷格蘭特液體培養基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持溫室內濕度80%,溫度20- 30。C,每天噴水3次，14天噴施1次 荷格蘭特液體培養基，21天噴施1次尿素，進行速生培養，完成天藍遏 藍菜轉基因苗的培養。
所述步驟l)中所述的種子萌發培養中所述的培養時間為5-9天時， 效果較佳。
所述步驟3),步驟5),步驟6)和步驟7)中所述的預培養培養基， 前培養培養基，共培養培養基和篩選培養基中所述的蔗糖為25 - 40毫 克/升，激動素為1.0-5毫克/升，6-芐基嘌呤為1.0-4毫克/升，萘乙酸 為0.5-2毫克/升時，效果較佳。
所述步驟6)中所述前培養時間為5-IO天時，效果較佳。
采用本發明方法進行穩定的重金屬超富集植物天藍遏藍菜的農桿菌 轉化方法和轉基因苗的培養過程，可以在短期內得到大量健壯的陽性轉 基因幼苗，轉化率高達50%,受外界環境影響小，四季皆可進行。同時 還具備節約育苗占地、降低生產成本等優點。植物組織培養技術是利用
細胞全能性，采用植物體上的細胞團或一塊組織，通過人為條件控制， 使之形成大量植抹，并且保存了母體的全部優良性狀，且遺傳性狀穩定。 通過這種方法得到的大量健壯天藍遏藍菜轉基因試管苗，生長速度和生 物量沒有變化，完全可以滿足分子生物學研究和生產應用。
具體實施例方式
下面結合農桿菌介導的天藍遏藍菜遺傳轉化實施例進一步描述本發
明
實施例1:農桿菌介導的高效的天藍遏藍菜遺傳轉化以及轉基因苗的培 育
1、建立初代培養物一天藍遏藍菜幼苗
取天藍遏藍菜成熟種子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.P/。氯化 汞中浸泡8分鐘。無菌水沖洗3-5遍，滅菌濾紙吸干水分；置于種子 萌發培養基上培養7天。培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25。C。所述種子萌發培養基為MS培養 基；
2、 天藍遏藍菜叢生芽的培養
將上述天藍遏藍菜幼苗置于分化培養基上進行叢生芽的分化培養 10-14天，至莖節處分化出叢狀小苗即叢生芽；其培養條件為光照強 度為3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25°C;
所述分化培養基所含組分及配比為每升分化培養基中含水解乳蛋 白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6 毫克，以及6-千基腺嘌呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，pH=5.8;
所述分化基本培養基為MS培養基；
3、 天藍遏藍菜叢生芽的預培養
將以上所述天藍遏藍菜叢生芽平鋪在預培養培養基上進行預培養2 -3天；其預培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯，光照時間 16小時/天，溫度20- 25。C;
所述預培養培養基所含組分及配比為每升預培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6毫克，乙 酰丁香酮100毫摩爾和6-千基腺噪呤6毫克，萘乙酸2毫克，pH=5.2;
所述預培養基本培養基為MS培養基；
4、 農桿菌的活化
分別挑取帶有目的基因Bjcat5的雙子葉植物表達載體的農桿菌的單 菌落，接種到5毫升LB農桿菌液體培養基中；28°C, 200轉/分，培養 8小時。
取培養過夜的農桿菌，按l: 40的比例稀釋至20毫升LB農桿菌液 體培養基中，繼續培養5小時，至OD6。o為0.6;經5000轉/分，離心5 min,收集菌體；用侵染液體培養基懸浮沉淀，稀釋至0D6。。為0.15后 備用。
所述LB農桿菌液體培養基所含組分及配比為每升LB農桿菌液體 培養基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化鈉，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH = 7.0;
所述侵染液體培養基為MS培養基，pH = 5.2; 5、經預培養的天藍遏藍菜叢生芽的農桿菌侵染和共培養
將預培養2天的天藍遏藍菜叢生芽置于上述含有農桿菌的OD6。o為0.15的侵染液體培養基中，浸泡8分鐘后取出；用濾紙吸干附著其表面 的菌液，平鋪在共培養培養基上，25。C下，暗培養2天；
所述共培養培養基所含組分及配比為每升共培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 瓊脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和6-芐基腺嘌呤6毫克，萘乙酸2 毫克，pH=5.2;
所述共培養基本培養基為MS培養基；
6、 前培養
將步驟5培養后的天藍遏藍菜叢生芽取出，分別置于三角瓶中；用無 菌水沖洗3 - 5次后，再用含羧卡青霉素500毫克/升的無菌水沖洗3次， 每次10分鐘；用含羧爺青霉素500毫克/升的MS液體培養基沖洗2次； 將叢生芽取出，用濾紙吸干水分，超凈工作臺中吹干；平鋪于前培養基 上；其培養條件光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天， 溫度20-25°C;
所述前培養培養基所含組分及配比為每升前培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 瓊脂6毫克，羧節青霉素250毫克和6-芐基腺嘌呤6毫克，萘乙酸2毫 克，pH=5.8;
所述前培養基本培養基為MS培養基；
7、 篩選培養
將經前培養天藍遏藍菜叢生芽取出，轉移至篩選培養基上；培養條件 光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25。C; 18 天繼代一次，得試管叢生芽苗；
所述篩選培養基所含組分及配比為每升篩選基本培養基中含水解 乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊 脂6毫克，羧節青霉素250毫克，卡那霉素25毫克和6-芐基腺嘌呤6 毫克，萘乙酸2亳克，pH=5.8;
所述篩選基本培養基為MS培養基；
8、 壯苗培養
將經過篩選培養的不少于3厘米的試管叢生芽苗修剪成帶2-3個節的 莖段，接種到壯苗培養基中培養18-35天，得試管苗；
所述壯苗培養基所含組分及配比為每升壯苗基本培養基中含蔗糖30毫克，瓊脂6毫克，肌醇200毫克，羧千青霉素250毫克和卡那霉素 25毫克，pH=5.8;
所述壯苗基本培養基為MS培養基；
9、 生根培養
將經過壯苗培養3.5-8厘米的試管苗，接種到生根培養基中培養18 -25天，得生根苗；從培養基中取出，洗去附著的培養基，轉移至荷格 蘭特液體培養基中進行水培繼續生根培養；其培養條件為以泡沫板作 為幼苗支持物，泡沫板大小應與水培槽口大'J、一致，盡量避免根部見光 導致綠藻滋生；每5天更換一次荷格蘭特液體培養基；22 - 25 。C，光 照16小時/天，濕度80- 85%;
所述生根培養基所含組分及配比為每升生根基本培養基中含蔗糖 30毫克，瓊脂5毫克，肌醇100毫克，羧千青霉素250毫克/升和卡那 霉素20毫克/升，pH=5.8;
所述生根基本培養基為1/2MS培養基；
10、 移栽定植
待經水培生根培養至根長不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基質中，進行移栽定植；所述苗圃基質由重量份配比為1:1花土和蛭 石組成；幼苗移栽前，將苗圃基質用荷格蘭特液體培養基淋透；移栽后， 用聚氯乙烯薄膜覆蓋，保持濕度90- 95%，注意通風；每5天噴水1次， 14天噴施1次荷格蘭特液體培養基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持溫室內濕度80%,溫度20- 30。C,每天噴水3次，14天噴施1次 荷格蘭特液體培養基，21天噴施1次尿素，進行速生培養，完成天藍遏 藍菜轉基因苗的培養。
實施例2:農桿菌介導的高效的天藍遏藍菜遺傳轉化以及轉基因苗的培 育
1、建立初代培養物一天藍遏藍菜幼苗
取天藍遏藍菜成熟種子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化 汞中浸泡8分鐘。無菌水沖洗3-5遍，滅菌濾紙吸干水分；置于種子 萌發培養基上培養7天。培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯， 光照時間16小時/天，溫度20- 25。C。所述種子萌發培養基為MS培養 基；2、 天藍遏藍菜叢生芽的培養
將上述天藍遏藍菜幼苗置于分化培養基上進行叢生芽的分化培養 10-14天，至莖節處分化出叢狀小苗即叢生芽；其培養條件為光照強 度為3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25。C;
所述分化培養基所含組分及配比為每升分化培養基中含水解乳蛋 白300毫克，維生素B 5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6 毫克，以及6-芐基腺嘌呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，pH=5.8;
所述分化基本培養基為MS培養基；
3、 天藍遏藍菜叢生芽的預培養
將以上所述天藍遏藍菜叢生芽平鋪在預培養培養基上進行預培養2 -3天；其預培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯，光照時間 16小時/天，溫度20- 25。C;
所述預培養培養基所含組分及配比為每升預培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6毫克，乙 酰丁香酮100毫摩爾和激動素5毫克，6-節基腺噤呤2毫克，萘乙酸3 亳克，pH=5.2;
所述預培養基本培養基為MS培養基；
4、 農桿菌的活化
分別挑取帶有目的基因Bjcat5的雙子葉植物表達載體的農桿菌的單 菌落，接種到5毫升LB農桿菌液體培養基中；28°C， 200轉/分，培養 8小時。
取培養過夜的農桿菌，按l: 40的比例稀釋至20毫升LB農桿菌液 體培養基中，繼續培養5小時，至OD6oo為0.6;經5000轉/分，離心5 min,收集菌體；用侵染液體培養基懸浮沉淀，稀釋至OD6Q()為0.15后 備用。
所述LB農桿菌液體培養基所含組分及配比為每升LB農桿菌液體 培養基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化鈉，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH-7.0;
所述侵染液體培養基為MS培養基，pH = 5.2;
5、 經預培養的天藍遏藍菜叢生芽的農桿菌侵染和共培養 將預培養2天的天藍遏藍菜叢生芽置于上述含有農桿菌的OD6。o為
0.15的侵染液體培養基中，浸泡8分鐘后取出；用濾紙吸干附著其表面的菌液，平鋪在共培養培養基上，25。C下，暗培養2天；
所述共培養培養基所含組分及配比為每升共培養基本培養基中含
水解乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，
瓊脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和激動素5毫克，6-芐基腺嘌呤2
毫克，萘乙酸3毫克，pH=5.2;
所述共培養基本培養基為MS培養基；
6、 前培養
將步驟5培養后的天藍遏藍菜叢生芽取出，分別置于三角瓶中；用無 菌水沖洗3 - 5次后，再用含羧節青霉素500毫克/升的無菌水沖洗3次， 每次10分鐘；用含羧卡青霉素500毫克/升的MS液體培養基沖洗2次； 將叢生芽取出，用濾紙吸干水分，超凈工作臺中吹干；平鋪于前培養基 上；其培養條件光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天， 溫度20-25°C;
所述前培養培養基所含組分及配比為每升前培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 瓊脂6毫克，羧千青霉素250毫克和激動素5毫克，6-芐基腺嘌呤2毫 克，萘乙酸3毫克，pH=5.8;
所述前培養基本培養基為MS培養基；
7、 篩選培養
將經前培養天藍遏藍菜叢生芽取出，轉移至篩選培養基上；培養條件 光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20-25°C; 18 天繼代一次，得試管叢生芽苗；
所述篩選培養基所含組分及配比為每升篩選基本培養基中含水解 乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊 脂6毫克，羧芐青霉素250毫克，卡那霉素25毫克和激動素5毫克， 6-卡基腺嘌呤2毫克，萘乙酸3毫克，pH=5.8; 所述篩選基本培養基為MS培養基； 8、壯苗培養
將經過篩選培養的不少于3厘米的試管叢生芽苗修剪成帶2-3個節的 莖段，接種到壯苗培養基中培養18-35天，得試管苗；
所述壯苗培養基所含組分及配比為每升壯苗基本培養基中含蔗糖 30毫克，瓊脂6毫克，肌醇200毫克，羧芐青霉素250毫克和卡那霉素25毫克，pH=5.8;
所述壯苗基本培養基為MS培養基； 9、生4艮培養
將經過壯苗培養3.5-8厘米的試管苗，接種到生根培養基中培養18 -25天，得生根苗；從培養基中取出，洗去附著的培養基，轉移至荷格 蘭特液體培養基中進行水培繼續生根培養；其培養條件為以泡沫板作 為幼苗支持物，泡沫板大小應與水培槽口大小一致，盡量避免根部見光 導致綠藻滋生；每5天更換一次荷格蘭特液體培養基；22- 25°C,光照 16小時/天，濕度80- 85%;
所述生根培養基所含組分及配比為每升生根基本培養基中含蔗糖 30毫克，瓊脂5毫克，肌醇100毫克，羧芐青霉素250毫克/升和卡那 霉素20毫克/升，pH=5.8;
所述生根基本培養基為1/2MS培養基； 10、移栽定柏—
待經水培生根培養至根長不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基質中，進行移栽定植；所述苗圃基質由重量份配比為1:1花土和蛭 石組成；幼苗移栽前，將苗圃基質用荷格蘭特液體培養基淋透；移栽后， 用聚氯乙烯薄膜覆蓋，保持濕度90- 95%,注意通風；每5天噴水1次， 14天噴施1次荷格蘭特液體培養基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持溫室內濕度80%,溫度20- 30°C，每天噴水3次，14天噴施1次 荷格蘭特液體培養基，21天噴施1次尿素，進行速生培養，完成天藍遏 藍菜轉基因苗的培養。
實施例3: 農桿菌介導的天藍遏藍菜遺傳轉化以及轉基因苗的培育
1、 建立初代培養物一天藍遏藍菜幼苗
取天藍遏藍菜成熟種子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化 汞中浸泡8分鐘。無菌水沖洗3-5遍，滅菌濾紙吸干水分；置于種子 萌發培養基上培養7天。培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯， 光照時間16小時/天，溫度20-25°C。所述種子萌發培養基為MS培養 基；
2、 天藍遏藍菜叢生芽的培養
將上述天藍遏藍菜幼苗置于分化培養基上進行叢生芽的分化培養10-14天，至莖節處分化出叢狀小苗即叢生芽；其培養條件為光照強 度為3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25°C;
所述分化培養基所含組分及配比為每升分化培養基中含水解乳蛋 白300毫克，維生素B 5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6 毫克，以及6-卡基腺噤呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，pH=5.8;
所述分化基本培養基為MS培養基；
3、 天藍遏藍菜叢生芽的預培養
將以上所述天藍遏藍菜叢生芽平鋪在預培養培養基上進行預培養2 -3天；其預培養條件為光照強度為3000- 5000勒克斯，光照時間 16小時/天,溫度20-25。C;
所述預培養培養基所含組分及配比為每升預培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6毫克，乙 酰丁香酮100毫摩爾和6-千基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，pH-5.2;
所述預培養基本培養基為MS培養基；
4、 農桿菌的活化
分別挑取帶有目的基因Bjcat5的雙子葉植物表達載體的農桿菌的單 菌落，接種到5毫升LB農桿菌液體培養基中；28°C, 200轉/分，培養 8小時。
取培養過夜的農桿菌，按l: 40的比例稀釋至20毫升LB農桿菌液 體培養基中，繼續培養5小時，至OD6。。為0.6;經5000轉/分，離心5 min，收集菌體；用侵染液體培養基懸浮沉淀，稀釋至OD,為0.15后 備用。
所述LB農桿菌液體培養基所含組分及配比為每升LB農桿菌液體 培養基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化鈉，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH = 7.0;
所述侵染液體培養基為MS培養基，pH = 5,2; 5、經預培養的天藍遏藍菜叢生芽的農桿菌侵染和共培養
將預培養2天的天藍遏藍菜叢生芽置于上述含有農桿菌的OD,為 0.15的侵染液體培養基中，浸泡8分鐘后取出；用濾紙吸干附著其表面 的菌液，平鋪在共培養培養基上，25。C下，暗培養2天；
所述共培養培養基所含組分及配比為每升共培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和6-卡基腺嘌呤1毫克，萘乙酸 0.2毫克，pH=5.2;
所述共培養基本培養基為MS培養基；
6、 前培養
將步驟5培養后的天藍遏藍菜叢生芽取出，分別置于三角瓶中；用無 菌水沖洗3 - 5次后，再用含羧千青霉素500毫克/升的無菌水沖洗3次， 每次10分鐘；用含羧節青霉素500毫克/升的MS液體培養基沖洗2次； 將葉片取出，用濾紙吸干水分，超凈工作臺中吹千；平鋪于前培養基上； 其培養條件光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度 20-25。C;
所述前培養培養基所含組分及配比為每升前培養基本培養基中含 水解乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 瓊脂6毫克，羧千青霉素250毫克和6-卡基腺嘌呤l毫克，萘乙S臾0.2 毫克，pH=5.8;
所述前培養基本培養基為MS培養基；
7、 篩選培養
將經前培養天藍遏藍菜叢生芽取出，轉移至篩選培養基上；培養條件 光照強度3000- 5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20- 25。C; 18 天繼代一次，得試管叢生芽苗；
所述篩選培養基所含組分及配比為每升篩選基本培養基中含水解 乳蛋白300毫克，維生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，瓊 脂6毫克，羧千青霉素250毫克，卡那霉素25毫克和6-千基腺嘌呤1 毫克，萘乙酸0.2毫克，pH=5.8;
所述篩選基本培養基為MS培養基； 8、壯苗培養
將經過篩選培養的不少于3厘米的試管叢生芽苗修剪成帶2-3個節的 莖段，接種到壯苗培養基中培養18-35天，得試管苗；
所述壯苗培養基所含組分及配比為每升壯苗基本培養基中含蔗糖 30毫克，瓊脂6毫克，肌醇200毫克，羧芐青霉素250毫克和卡那霉素 25毫克，pH=5.8;
所述壯苗基本培養基為MS培養基；
9、生根培養將經過壯苗培養3.5-8厘米的試管苗，接種到生根培養基中培養18 -25天，得生根苗；從培養基中取出，洗去附著的培養基，轉移至荷格 蘭特液體培養基中進行水培繼續生根培養；其培養條件為以泡沫板作
為幼苗支持物，泡沫板大小應與水培槽口大小一致，盡量避免根部見光 導致綠藻滋生；每5天更換一次荷格蘭特液體培養基；22- 25 。C，光 照16小時/天，濕度80 - 85%;
所述生根培養基所含組分及配比為每升生根基本培養基中含蔗糖 30毫克，瓊脂5毫克，肌醇100毫克，羧芐青霉素250毫克/升和卡那 霉素20毫克/升，pH=5.8;
所述生根基本培養基為1/2MS培養基； 10、移栽定植
待經水培生根培養至根長不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基質中，進行移栽定植；所述苗圃基質由重量份配比為1:1花土和蛭 石組成；幼苗移栽前，將苗圃基質用荷格蘭特液體培養基淋透；移栽后， 用聚氯乙烯薄膜覆蓋，保持濕度90-95%,注意通風；每5天噴水1次， 14天噴施1次荷格蘭特液體培養基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持溫室內濕度80%，溫度20- 30°C,每天噴水3次，14天噴施1次 荷格蘭特液體培養基，21天噴施1次尿素，進行速生培養，完成天藍遏 藍菜轉基因苗的培養。
權利要求
1、一種重金屬超富集植物天藍遏藍菜遺傳轉化方法的建立及轉基因苗的培育，其步驟如下1)建立初代培養物-天藍遏藍菜幼苗取天藍遏藍菜成熟種子，用酒精進行表面消毒，之后，置于氯化汞中浸泡后取出；再進行無菌水沖洗，滅菌，并用濾紙吸干其表面水分；再置于種子萌發培養基上培養7-15天，得初代培養物-天藍遏藍菜幼苗；其培養條件為光照強度為3000-5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20-25℃；所述種子萌發培養基為MS培養基；2)天藍遏藍菜叢生芽的培養將上述天藍遏藍菜幼苗置于分化培養基上進行叢生芽的分化培養10-14天，至莖節處分化出叢狀小苗即叢生芽；其培養條件為光照強度為3000-5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20-25℃；所述分化培養基所含組分及配比為每升分化培養基中含水解乳蛋白300毫克，維生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，以及6-芐基腺嘌呤、萘乙酸兩種植物生長激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述分化基本培養基為MS培養基；3)天藍遏藍菜叢生芽的預培養將以上所述天藍遏藍菜叢生芽平鋪在預培養培養基上進行預培養2-3天；其預培養條件為光照強度為3000-5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20-25℃；所述預培養培養基所含組分及配比為每升預培養基本培養基中含水解乳蛋白300毫克，維生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和激動素、6-芐基腺嘌呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述預培養基本培養基為MS培養基；4)農桿菌的活化分別挑取帶有目的基因Bjcat5的雙子葉植物表達載體的農桿菌的單菌落，接種到5毫升LB農桿菌液體培養基中培養8小時；其培養條件為28℃，200轉/分；取培養過夜的LB農桿菌培養液，按1∶40的比例稀釋至20毫升LB液體農桿菌培養基中，繼續培養5-6小時，至OD600為0.6；經5000轉/分，離心5min；收集菌體，用侵染液體培養基懸浮沉淀，稀釋至OD600為0.15侵染液體培養基；備用；所述LB農桿菌液體培養基所含組分及配比為每升LB農桿菌液體培養基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，10克的氯化鈉，50毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH＝7.0；所述侵染液體培養基為MS培養基，pH＝5.2；5)經預培養的天藍遏藍菜叢生芽的農桿菌侵染和共培養將預培養2-3天的天藍遏藍菜叢生芽置于上述含有農桿菌的OD600為0.15的侵染液體培養基中，浸泡5-15分鐘后取出；用濾紙吸干附著其表面的菌液，平鋪在共培養培養基上，25℃下，暗培養2天；所述共培養培養基所含組分及配比為每升共培養基本培養基中含水解乳蛋白300毫克，維生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩爾和激動素、6-芐基腺嘌呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述共培養基本培養基為MS培養基；6)前培養將步驟5)培養后的天藍遏藍菜叢生芽取出，分別置于三角瓶中；用無菌水沖洗3-5次后，再用含羧芐青霉素500毫克/升的無菌水沖洗3次，每次10分鐘；用含羧芐青霉素500毫克/升的MS液體培養基沖洗1-2次；將叢生芽取出，用濾紙吸干水分，超凈工作臺中吹干；平鋪于前培養基上培養3-15天；其培養條件光照強度3000-5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20-25℃；所述前培養培養基所含組分及配比為每升前培養基本培養基中含水解乳蛋白300毫克，維生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，羧芐青霉素250毫克和激動素、6-芐基腺嘌呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述前培養基本培養基為MS培養基；7)篩選培養將經前培養3-15天的天藍遏藍菜叢生芽取出，轉移至篩選培養基上；培養條件光照強度3000-5000勒克斯，光照時間16小時/天，溫度20-25℃；18天繼代一次，得試管叢生芽苗；所述篩選培養基所含組分及配比為每升篩選基本培養基中含水解乳蛋白300毫克，維生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，羧芐青霉素250毫克，卡那霉素5-50毫克和激動素、6-芐基腺嘌呤、萘乙酸三種植物生長激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述篩選基本培養基為MS培養基；8)壯苗培養將經過篩選培養的不少于3厘米的試管叢生芽苗修剪成帶2-3個節的莖段，接種到壯苗培養基中培養18-35天，得試管苗；所述壯苗培養基所含組分及配比為每升壯苗基本培養基中含蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，肌醇50-300毫克，羧芐青霉素250毫克和卡那霉素5-50毫克，pH＝5.8；所述壯苗基本培養基為MS培養基；9)生根培養將經過壯苗培養3.5-8厘米的試管苗，接種到生根培養基中培養18-25天，得生根苗；從培養基中取出，洗去附著的培養基，轉移至荷格蘭特液體培養基中進行水培繼續生根培養；其培養條件為以泡沫板作為幼苗支持物，泡沫板大小應與水培槽口大小一致，盡量避免根部見光導致綠藻滋生；每5天更換一次荷格蘭特液體培養基；22-25℃，光照16小時/天，濕度80-85％；所述生根培養基所含組分及配比為每升生根基本培養基中含蔗糖10-40毫克，瓊脂5-10毫克，肌醇50-300毫克，羧芐青霉素250毫克和卡那霉素5-50毫克，pH＝5.8；所述生根基本培養基為1/2MS培養基；10)移栽定植待經水培生根培養至根長不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗圃基質中，進行移栽定植；所述苗圃基質由重量份配比為1∶1花土和蛭石組成；幼苗移栽前，將苗圃基質用荷格蘭特液體培養基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆蓋，保持濕度90-95％，注意通風；每5天噴水1次，14天噴施1次荷格蘭特液體培養基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持溫室內濕度80％，溫度20-30℃，每天噴水3次，14天噴施1次荷格蘭特液體培養基，21天噴施1次尿素，進行速生培養，完成天藍遏藍菜轉基因苗的培養。
2、 按權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟l)中所述的種 子萌發培養中所述的培養時間為5-9天。
3、 按權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟3),步驟5)， 步驟6)和步驟7)中所述的預培養培養基，前培養培養基，共培養培養 基和篩選培養基中所述的維生素B為3-7毫克/升，蔗糖為25 - 40毫 克/升，激動素為0.1-8毫克/升，6-芐基腺嘌呤為l-4毫克/升，萘乙 酸為0.1-8毫克/升。
4、 按權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟6)中所述前 培養時間為5 - 10天。
全文摘要
一種重金屬超富集植物天藍遏藍菜的農桿菌介導的轉基因方法及其轉基因苗的培養方法天藍遏藍菜成熟種子經消毒處理后置于種子萌發培養基上發芽后轉移至分化培養基培養至叢生芽生成并接種于預培養基中培養；農桿菌侵染后置于共培養基上進行共培養，轉接到前培養基上至叢生芽增生；轉接到篩選培養基上分化出抗性叢生芽；將叢生芽置于基本培養基中進行壯苗培養；轉移至生根培養基進行初步生根培養后轉移至荷格蘭特營養液中水培繼續生根培養，之后再將生根的壯苗移栽到苗圃基質中進行移栽定植培養，得到轉基因天藍遏藍菜成熟植株。本方法可排除外界條件影響，四季可行，節約育苗占地，降低生產成本，而且短期內得到大量健壯轉基因幼苗，滿足分子生物學研究和生產應用。
文檔編號C12N15/09GK101302507SQ20071009905
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月10日 優先權日2007年5月10日
發明者林 叢, 官子楸, 進 徐, 柴團耀, 璐 韓, 嵬 魏 申請人:中國科學院研究生院