專利名稱：豬疫苗使用的pil-10基因佐劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及PIL-10基因的一種應用及其制備方法，具體地說涉及到PIL-10基因在作為 到豬疫苗的佐劑時的制備方法。
背景技術：
迄今為止，許多傳染性疾病尚未得到有效防治，現行的滅活疫苗或弱毒疫苗等傳統疫苗 或免疫效力低下，或存在安全性問題，促使人們開發安全有效的新型疫苗，基于重組DNA技 術的基因工程疫苗安全可靠、易于鑒別診斷，具有很大的應用前景，但其抗原性一般較弱， 需要有效的免疫佐劑以增強其保護效力，PIL-10是一種很好的免疫調節因子，可是在豬疫苗 中使用的時候它尚未有明確的制備方法。

發明內容
本發明的目的是本研究構建的高效表達pIL-10的基因工程菌株，對于研究pIL-10在豬 吝種疾病中的免疫調節作用，以及井發治療免疫功能襲亂的免疫調節劑及某些炎性疾病的抗 炎防治劑，無疑具有很大的應用價值。
本發明的技術方案為 一種豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，從LPS活化的豬 外周血單個核細胞PBMC提取總RNA，用RT-PCR方法擴增出pIL-10編碼基因，將其連接 到克隆載體上，克隆pIL-10基因。
優選的是所述的總RNA的提取過程為從豬前腔靜脈采血，然后用淋巴細胞分離液分 離單個核細胞，將得到的細胞在RPMI1640完全培養基中培養0.5小時，然后加入LPS繼續 培養5小時，然后取培養細胞用Trizol試劑盒提取總RNA。
優選的是所述的RPMI1640完全培養基為RPMI+10。/。胎牛血清。
優選的是所述RT-PCR方法過程為先取總RNA3uL加入適量Oligo(dT)、 dNTP、
310Xbuffer (RAV)、 RNasin、 AMV反轉錄酶，42。C作用1小時，合成IL-10cDNA;然后取 cDNA2uL加入適量P1、 P2、 dNTP 、 10Xbuffer、 ExTaq DNA聚合酶進行PCR擴增，反 應條件為95'C預加熱5min,然后94°C lmin,54'C lmin，72。C lmin^O個循環，最后72'C延 伸10min,擴增結束后取5 u L混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳。
優選的是用RT-PCR方法生產的產物需要進行酶切鑒定，鑒定過程如下取50uLPCR 產物用1%低熔點瓊脂糖凝膠回收目的片段，懸溶于30ixL TE溶液，取8uL用EcoRV酶 切鑒定。
優選的是:所述的克隆pIL-10基因過程為取PCR回收產物用BamHI和HindIII雙酶切， 然后用1%低熔點瓊脂糖凝膠回收目的片段，pUC18同樣用BamHI和HindIII雙酶切回收純 化，取酶切處理的luLpUC18質粒、4uLIL-10PCR產物、1 u LT4 DNA連接酶和1 w L 10 X連接酶buffer, 16'C進行12小時連接反應，連接產物轉化E.coli JM109感受態細胞，挑取 陽性菌落，提取質粒。
優選的是克隆之后需要進行克隆鑒定及序列測定，將提取的質粒用BamHI和HindIII 雙酶切和PCR分別鑒定并篩選陽性克隆。
本發明的有益效果為豬疫苗中與抗原同時注射或預先注射細胞因子可明顯增強機體產 生針對該抗原的免疫應答。白介素PIL-10作為一種理想的抗炎因子， 一方面抑制炎性細胞的 激活、遷移與粘附；另一方面抑制炎癥因子的合成與釋放。用此種制備方法制成的白介素 PIL-10對免疫系統的作用主要是抑制細胞免疫直接或間接抑制T淋巴細胞的增殖與成熟；上 調體液免疫一促進B淋巴細胞的增殖、成熟及抗體的分泌，用本發明提供的方法制備PIL-IO 制備過程簡單，作為佐劑應用到豬疫苗中有很好的免疫效果。


圖1為本發明plO/pPROEXHTb的構建示意圖
具體實施例方式
本發明的具體實施例如下 一種豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，從LPS活化的豬外周血單個核細胞PBMC提取總RNA，用RT-PCR方法擴增出pIL-10編碼基因，將其 連接到克隆載體上，克隆pIL-IO基因。所述的總RNA的提取過程為從豬前腔靜脈采血， 然后用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，將得到的細胞在RPMI1640完全培養基中培養0.5 小時，然后加入LPS繼續培養5小時，然后取培養細胞用Trizol試劑盒提取總RNA。所述的 RPMI 1640完全培養基為RPMI+10%胎牛血清。所述RT-PCR方法過程為先取總RNA 3 u L 加入適量Oligo(dT)、 dNTP、 10Xbuffer (RAV)、 RNasin、 AMV反轉錄酶，42。C作用1小 時，合成IL-10 cDNA;然后取cDNA 2 u L力口入適量P1 、 P2、 dNTP 、 10 X buffer、 ExTaq DNA 聚合酶進行PCR擴增，反應條件為95"C預加熱5min，然后94°C lmin，54'C lmin，72'C lmin,30個循環，最后72'C延伸10min,擴增結束后取5uL混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳。用 RT-PCR方法生產的產物需要進行酶切鑒定，鑒定過程如下取50uL PCR產物用1%低熔 點瓊脂糖凝膠回收目的片段，懸溶于30 y L TE溶液，取8 y L用EcoRV酶切鑒定。所述的 克隆pIL-10基因過程為取PCR回收產物用BamHI和HindIII雙酶切，然后用1%低熔點瓊 脂糖凝膠回收目的片段，pUC18同樣用BamHI和HindIII雙酶切回收純化，取酶切處理的1 nLpUC18質粒、4uLIL-10PCR產物、1 w LT4DNA連接酶和1 w L 10X連接酶buffer, 16 'C進行12小時連接反應，連接產物轉化E.coliJM109感受態細胞，挑取陽性菌落，提取質粒。 克隆之后需要進行克隆鑒定及序列測定，將提取的質粒用BamHI和IIindIII雙酶切和PCR分 別鑒定并篩選陽性克隆。序列分析取陽性質粒序列測定結果如下
5' GGA TCC ATG CCC AGC TCA GCA CTG CTC TAT TCC CTG ATC TTC CTG GCA GGG GTG 54 MPSSALLYCLIFLAGV GCA GCC AGC ATT MG TCT GAG AAC AGC TGC ATC CAC TTC CCA ACC AGC CTG CCC 108
AASIKSENSCIHFPTSLP CAC ATG CTC CGG GAA CTC CGA GCT GCC TTC GGC CCA GTG AAG AGT TTC TTT CAA 162
HMLRELRAAFGPVKSFFQ ACG MG GAC CAG ATG GGC GAC TTG TTG CTG ACC GGG TCT CTG CTG GAG GAC TTT 216
TKDQMGD'LLLTGSLLEDF MG GGT TAC CTG GGT TGC CAA GCC TTG TCA GAG ATG ATC CAG TTT TAC CTG GM 270
KGYLGC&ALSEMIQFYLE GAC GTA ATG CCG AAG GCA GAG AGT GAT GGG GAG GAT ATC MG GAG CAC GTG AAC 324
DVMPKAESDGEDIKEHVN TCC CTG GGG GAG AAG CTG AAG ACC CTC AGG CTG AGG CTG CGG CGC TGT CAT CAA 378
SLGEKLKTLRLRLRRCHQ TTT CTG CCC TGT GM MC MG AGC MG GCC GTG GAG GAG GTG MG AGT GCC TTT 4.32<formula>formula see original document page 6</formula>
權利要求
1、一種豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于從LPS活化的豬外周血單個核細胞PBMC提取總RNA，用RT-PCR方法擴增出pIL-10編碼基因，將其連接到克隆載體上，克隆pIL-10基因，將pIL-10編碼基因亞克隆到表達載體pPROEXTM HTb中，轉化DH5α后，用IPTG誘導培養，表達了具有活性的重組pIL-10。
2、 如權利要求l所述的豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的總 RNA的提取過程為從豬前腔靜脈采血，然后用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，將得 到的細胞在RPMI1640完全培養基中培養0.5小時，然后加入LPS繼續培養5小時，然 后取培養細胞用Trizol試劑盒提取總RNA。
3、 如權利要求2所述的豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 RPMI1640完全培養基為RPMI+10。/。胎牛血清。
4、 如權利要求1所述的豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于所述 RT-PCR方法過程為先取總RNA3 u L加入適量Oligo(dT)、 dNTP、 10Xbuffer(RAV)、 RNasin、 AMV反轉錄酶，42。C作用1小時，合成IL-10cDNA;然后取cDNA2uL加 入適量P1、 P2、 dNTP 、 10Xbuffer、 ExT叫DNA聚合酶進行PCR擴增，反應條件為 95'C預加熱5min，然后94'C lmin,54"C lmin,72。C lmin，30個循環，最后72。C延伸10min， 擴增結束后取5 u L混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳。
5、 如權利要求4所述的豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于:用RT-PCR 方法生產的產物需要進行酶切鑒定，鑒定過程如下取50iiLPCR產物用1%低熔點瓊 脂糖凝膠回收目的片段，懸溶于30"LTE溶液，取8yL用EcoRV酶切鑒定。
6、 如權利要求1所述的豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的克 隆pIL-lO基因過程為取PCR回收產物用BamHI和HindIII雙酶切，然后用1%低熔點 瓊脂糖凝膠回收目的片段，pUC18同樣用BamHI和HindlH雙酶切回收純化，取酶切處 理的luLpUC18質粒、4uLIL-10PCR產物、luLT4DNA連接酶和luL10X連接酶 buffer, 16'C進行12小時連接反應，連接產物轉化Exoli JM109感受態細胞，挑取陽性 菌落，提取質粒。
7、 如權利要求6所述的豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，其特征在于克隆之后 需要進行克隆鑒定及序列測定，將提取的質粒用Bamffl和HindIII雙酶切和PCR分別鑒 定并篩選陽性克隆。
全文摘要
本發明涉及一種豬疫苗使用的PIL-10基因佐劑的制備方法，從LPS活化的豬外周血單個核細胞PBMC提取總RNA，用RT-PCR方法擴增出pIL-10編碼基因，將其連接到克隆載體上，克隆pIL-10基因，將pIL-10編碼基因亞克隆到表達載體pPROEXTM HTb中，轉化DH5α后，用IPTG誘導培養，表達了具有活性的重組pIL-10。用本發明提供的方法制備PIL-10制備過程簡單，作為佐劑應用到豬疫苗中有很好的免疫效果。
文檔編號C12N15/12GK101469328SQ200710306039
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優先權日2007年12月29日
發明者溫建新, 峰 邵 申請人:邵 峰;溫建新