專利名稱：：一種多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法
技術領域：
：本發明涉及蛋白質樣品的酶解方法，具體地說是一種基于多孔整體材料的固定化酶微反應器，實現蛋白質樣品的高效、快速酶解。
背景技術：
：作為化學酶工程的一個重要分支，酶的固定化是指通過吸附、包埋、交聯、共價接合等方法使目標酶分子固定于特定的載體上而發揮酶的生物催化作用。與溶液中的蛋白質酶解反應相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、可重復使用，并能減少酶的自身降解等優點。此外，使用固定化酶反應器還可以避免樣品的手工處理，從而也就減少了蛋白樣品被污染的可能性。固定化酶的性能與載體材料和固定化方法密切相關。根據載體材料的不同，固定化酶反應器可以分為顆粒填充型和整體材料型兩大類。顆粒填充型酶反應器的制備往往是先將表面帶有某種官能團的顆粒進行活化而后固定上酶分子，再將顆粒填充到柱管中。對于填充型酶反應器而言，液流主要通過顆粒之間的空隙，從流動相向固定化酶的傳質和從固定化酶向流動相的傳質主要由擴散系數決定，與填料孔徑大小、流速和底物的擴散系數等有關。蛋白質這類生物大分子的擴散系數較小，而填料顆粒之間往往有較大空隙，使得填充型酶反應器的傳質速率較低，活性不高。因此，填充型顆粒載體通常并非理想的酶固定化載體材料。多孔整體材料是近年發展起來的一種新型的色譜分離介質。通過優化合成條件，可以制備得到同時具有大的通孔和小的擴散孔的多孔結構整體材料載體。對于基于多孔整體材料的固定化酶反應器而言，傳質速率得以顯著提高，較快的傳質使得蛋白分子更容易接近固定化酶的活性位點，因此可以大大提高固定化酶反應的速度。最近，Zare等采用光引發聚合法制備了一種硅膠整體材料共價鍵合型酶反應器，可使25mMBAEE(L-苯丙氨酸-精氨酸-乙酯)在2分鐘內酶解(Dulay,M.T.;Baca,Q.J.;Zare,R.N.C/2泄2005,77，4604-4610)。Sakai畫Kato等采用溶膠-凝膠法制備了一種硅膠整體材料包埋型酶反應器，可使50mMBAEE在2秒鐘內酶解(Sakai-Kato,K.;Kato，M.;Toyo，oka,T.爿"a/.Ozew.2002,74，2943-2949)，然而該酶反應器卻不能對大分子蛋白質進行有效酶解。
發明內容本發明的目的在于提供一種多孔整體材料固定化酶反應器的制備方法，而且所制備的酶反應器可實現蛋白質樣品的高效、快速的酶解。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為本發明采用四乙氧基硅垸(TEOS)和氨丙基三乙氧基硅垸(APTES)為前體分子，以十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)為模板分子，以無水乙醇為共溶劑，經由溶膠-凝膠法和模板分子自組裝法制備得到了一種多孔的有機-無機雜化硅膠整體材料載體載體；對雜化硅膠整體材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制備得到有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶反應叫益。具體為1)采用四乙氧基硅垸TEOS或四甲氧基硅烷TMOS與氨丙基三乙氧基硅烷APTES—起作為前體分子，以帶有C8-C16烷基鏈的陽離子表面活性劑為模板分子，以無水乙醇或甲醇為共溶劑，加水后經由溶膠-凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有機-無機雜化硅膠整體材料載體；步驟1)中TEOS或TMOS與APTES的物質的量之比為3〃—7/3;水與前體分子(TEOS和APTES的物質的量的總和)物質的量之比為二2.5/l—1.2/l，模板分子的質量mg與前體分子物質的量mmol之比為6—10;無水乙醇或甲醇的體積與前體分子物質的量mmol之比為175—250;溶膠-凝膠法聚合反應溫度為25。C80。C，聚合時間為12~24小時；所述模板分子最好為十六烷基三甲基溴化氨CTAB;其采用的前體分子之一是氨丙基三乙氧基硅烷，其同時也是溶膠-凝膠反應的催化劑。2)對雜化硅膠整體材料載體用戊二醛活化，最后連續泵過含有胰蛋白酶、芐甲脒及的氰基硼氫化鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶液，即可制備得到一種有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶微反應器。步驟2)中載體用戊二醛活化過程為將含有體積濃度5—20%戊二醛的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖液浸泡整體材料，在室溫下反應4—12小時；步驟2)中酶的固定化過程為含有1—5mg/mL胰蛋白酶、25—100mM苯甲脒及2.5—7.5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液，在1—10。C下反應12一8小時；所制備得到的微反應器用含有體積濃度5—30%ACN的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶反應器2—6小時；最后，用0.5-1.25M的pH=7.5—8.5Tris-HCl沖洗酶反應器2—6小時。所述微反應器不使用時，用含有5—15mMCaCl2、質量濃度0.01—0.04%NaN3的50—100mMpH=7.5—8.5Tris-HCl保護液保護起來，貯存于1—10。C下。所述有機-無機雜化硅膠整體材料載體的制備可在10300pm內徑的毛細管中進行。本發明的優點為本發明在毛細管中以兩種硅烷化試劑為前體分子，以表面活性劑為模板分子，經由溶膠-凝膠法和模板分子自組裝法原位聚合得到一種連續的、均一的多孔有機無機雜化硅膠整體材料載體，對載體表4面進行活化后即可用于酶的共價固定。其制備方法簡便，成本低；制備得到的酶反應器的通透性好，反壓小，機械強度好，酶活性高，與自由溶液酶解相比，大大縮短了反應時間，避免了酶的自降解(即降低了最終質譜譜圖解析的復雜性)，可反復使用(減少了酶的消耗)，也可與HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系統聯用從而實現在線分析。圖1有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶反應器的制備示意圖；其中(a)有機-無機雜化硅膠整體材料載體的制備；(b)載體材料上酶的固定化。圖2有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶反應器的截面掃描電鏡圖(x600)。圖3BAEE經酶反應器酶解后的產物經HPLC-UV分析得到的色譜當200mMBAEE經酶反應器5秒后幾乎完全酶解，這說明本發明所制備的酶反應器可以對小分子底物進行高效、快速的酶解。圖4肌紅蛋白經酶反應器酶解后的產物經HPLC-MS/MS分析得到的基峰色譜圖；當200ng肌紅蛋白經酶反應器30秒后即得以完全酶解，這說明本發明所制備的酶反應器可以對蛋白進行高效、快速的酶解。具體實施例方式按照如下步驟制備有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶反應器。1)按下述所列比例取一定量的TEOS、APTES、無水乙醇、水和CTAB充分混勻，而后經注射器引入預處理好的內徑為10300pm的毛細管中，引入過程在原料混合后的2分鐘內完成。用硅橡膠封口，于25~80。C下聚合反應12~24小時；經由溶膠-凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有機-無機雜化硅膠整體材料載體；合成實例具體參數如下表1所示；2)活化所制備的整體材料先經恒流泵先用乙醇沖洗去CTAB，再先后用水及100mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)沖洗30min。而后，將含有體積濃度10%戊二醛的100mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)泵入柱中，在室溫下反應6小時。酶的固定化用緩沖液沖洗去多余的戊二醛，再連續泵入含有2.5mg/mL胰蛋白酶、50mM苯甲脒及5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的lOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，在4。C下反應24小時。再用含有體積濃度20。/。ACN的lOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)沖洗酶反應器4小時。最后，用1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)沖洗酶反應器4小時。載體活化及酶的固定化實例具體參數如下表2所示。不使用時，用含有10mMCaCl2、質量濃度0.02%NaN3的50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)保護液保護起來，貯存于4。C下。表l.有機-無機雜化硅膠整體材料載體的合成實例。5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>按照上表所示比例制備得到有機-無機雜化硅膠整體材料載體后，先后用無水乙醇和水沖洗掉模板分子，再經活化后即可用于酶的固定化。表2.整體材料活化及酶的固定化合成參數。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>15，51.5604.54，2422，41，4108，824052，2620，41，4115，101252.51，485，60.5，61220，451007.510，1230，21.25，2具體應用如圖3所示，當200mMBAEE經酶反應器5秒后幾乎完全酶解，這說明本發明所制備的酶反應器可以對小分子底物進行高效、快速的酶解。如圖4所示，當200ng肌紅蛋白經酶反應器30秒后即得以完全酶解，這說明本發明所制備的酶反應器可以對蛋白進行高效、快速的酶解。權利要求1.一種多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS與氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作為前體分子，以帶有C8-C16烷基鏈的陽離子表面活性劑為模板分子，以無水乙醇或甲醇為共溶劑，加水后經由溶膠-凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有機-無機雜化硅膠整體材料載體；2)對雜化硅膠整體材料載體用戊二醛活化，最后連續泵過含有胰蛋白酶、芐甲脒及的氰基硼氫化鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶液，即可制備得到一種有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶微反應器。2.按照權利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于所述步驟1)中TEOS或TMOS與APTES的物質的量之比為3/7-7/3;水與前體分子物質的量之比為=2.5/1—1.2/1，模板分子的質量mg與前體分子物質的量mmol之比為6—10;無水乙醇或甲醇的體積與前體分子物質的量mmol之比為175—250;溶膠-凝膠法聚合反應溫度為25°C80°C，聚合時間為12~24小時。3.按照權利要求1或2所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于所述模板分子為十六烷基三甲基溴化氨CTAB。4.按照權利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于所述步驟2)中載體用戊二醛活化的過程為將含有體積濃度5—20%戊二醛的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖液浸泡整體材料，在室溫下反應4—12小時。5.按照權利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于所述步驟2)中含有1—5mg/mL胰蛋白酶、25—100mM苯！脒及2.5—7.5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液，在1—10。C下反應12—48小時。6.按照權利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于所述制備得到的微反應器用含有體積濃度5—30%ACN的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶反應器2—6小時；最后，用0.5-1.25M的pH=7.5—8.5Tris-HCl沖洗酶反應器2—6小時。7.按照權利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于所述微反應器不使用時，用含有5—15mMCaCl2、質量濃度0.01—0.04%NaN3的50—100mMpH=7.5—8.5Tris-HCl保護液保護起來，ie存于1一10。C下。8.按照權利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應器的制備方法，其特征在于有機-無機雜化硅膠整體材料載體的制備可在10~300^im內徑的毛細管中進行。全文摘要本發明涉及蛋白質樣品的酶解方法，具體地說是采用四乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷為前體分子，以十六烷基三甲基溴化氨為模板分子，以無水乙醇為共溶劑，經由溶膠-凝膠法和模板分子自組裝法制備得到了一種多孔的有機-無機雜化硅膠整體材料載體載體；對雜化硅膠整體材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制備得到有機-無機雜化硅膠整體材料固定化酶反應器。本發明的優點為制備方法簡便，酶反應器的通透性好，反壓小，機械強度高，具有高的酶解活性，與自由溶液酶解相比，大大縮短了反應時間，避免了酶的自降解，可反復使用，也可與HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系統聯用從而實現樣品的在線分析。文檔編號C12N11/14GK101497879SQ20081001034公開日2009年8月5日申請日期2008年2月3日優先權日2008年2月3日發明者張麗華,張玉奎,振梁,馬俊鋒申請人:中國科學院大連化學物理研究所