專利名稱：一種提高dna質(zhì)量的土壤樣品總dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土壤微生物學(xué)，具體說(shuō)是一種提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總 DNA提取方法。
背景技術(shù)：
許多研究已經(jīng)表明，在現(xiàn)有的技術(shù)水平下，自然生態(tài)環(huán)境中的絕大部 分微生物(〉95%)還無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室被成功培養(yǎng)出來(lái)。由于培養(yǎng)基不能滿足 大多數(shù)微生物真實(shí)的生境條件，純培養(yǎng)技術(shù)只是選擇性地讓那些生長(zhǎng)比較 迅速、適應(yīng)條件變化快的微生物類群優(yōu)先得到生長(zhǎng)繁殖。通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù) 獲得的微生物不能代表環(huán)境中真實(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。近20年來(lái)，許多基于核酸(或16S rRNA基因序列多樣性)的分子生物學(xué)、分子生態(tài)學(xué)技術(shù)手段不斷得到發(fā)展并逐步成熟，為揭示生態(tài)系統(tǒng)中微 生物的群落結(jié)構(gòu)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。這些方法主要有擴(kuò)增核糖體 DNA限制性分析技術(shù)(Amplified ribosomal DNA restriction analysis, A腿A )、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(Single strand conformation polymorphism, SSCP)、(末端)限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)((Terminal) Restriction fragment length polymorphism, T-RFLP )、變性凝膠電泳技術(shù)(Denaturing gel electrophoresis, DGE)等。所有這些基于環(huán)境樣品中微生物基因組 DNA的研究手段都需要先從樣品中提取足量的DNA，然后通過(guò)PCR技術(shù)獲得某 一功能基因片段，再根據(jù)不同的研究目的進(jìn)行深入的分析研究。不同的DNA提取方法獲得的DNA量具有一定的差異，但是基本可以滿足后續(xù)PCR、克隆、酶切等分析操作。然而，由于環(huán)境樣品的復(fù)雜性，不同的 DNA提取方法所獲得的DNA質(zhì)量卻差異較大。對(duì)于有機(jī)質(zhì)含量較為豐富的土 壤樣品來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的"機(jī)械破壁+酶學(xué)作用"提取方法對(duì)于土壤中含有的腐 殖酸等雜質(zhì)去除能力有限。而殘余的腐殖酸或其它一些雜質(zhì)對(duì)于PCR擴(kuò)增、 酶切、克隆等操作的影響非常大。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為提取方法1)向0. 5-5. Og提取樣品中加入l. 0-5.5ml DNA提取緩沖 液，再加入O. 3-1. Og石英砂和5-50 nl濃度為的蛋白酶K并混勻，置于漩 渦振蕩器中震蕩10 20min;然后30-4(TC水洛1-2小時(shí)；其中DNA提取緩沖 液為50-150mM Tris-HCl, 50-100mM EDTA， 50-100mM磷酸鹽緩沖液， 0.5-2. 5M NaCl,質(zhì)量濃度為0. 5-2%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB );2)將震蕩后反應(yīng)液中加入200-2000 "1質(zhì)量濃度為5-10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)漩渦震蕩后反復(fù)凍融3次，而后放入65'C水浴中溫育l-2h， 進(jìn)而在室溫條件下6000-10000 x g離心10-30min,收集上清液，備用；3)在上述上清液中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，搖勻至乳 狀，室溫條件下6000-10000 xg離心10-30min，收集上清液；而后再上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻至乳狀，室溫條件下 6000-10000 x g離心10-30min，收集上清液；4 )將上述上清液中加入其0. 2-0. 3倍體積的醋酸鈉和0. 8-1. 2倍體積 冷異丙醇混句，在4。C放置1-2 h, 10000-12000 xg離心20-30 min，收集 DNA沉淀，沉淀經(jīng)乙醇潤(rùn)洗2-3次，而后干燥；5)向干燥后的DNA沉淀中加入50-100 jaL TE緩沖液使其溶解，得到 DNA粗提液；6 )將上述粗體液中500-1000 n L的DNA提取緩沖液，重復(fù)步驟3 ) -5 ) 即可獲得較高質(zhì)量的DNA提取液。所述步驟1 )水洛過(guò)程中每隔5-15min將樣品上下翻轉(zhuǎn)混勻；所述蛋白 酶K濃度為10-20mg/L。所述經(jīng)步驟2 )離心所得沉淀中加入DNA提取緩沖 液100-600 jul， SDS溶液40-400 ja 1,漩渦震蕩混勻，放入65。C水洛中溫 育30-60min,室溫條件下6000-10000 xg離心10-30min,收集上清液，其 上清液與步驟2)中獲得的上清液混合，備用。所述步驟2)反復(fù)凍融為在 -65'C冷凍而后在65'C速融即為一次，同時(shí)在-65。C冷凍時(shí)間為30 -60min, 65。C時(shí)融化時(shí)間為10-20min。所述TE緩沖液為5-20mM Tris-HC1, pH 7.5-8.0， 0. 5-2mMEDTA，所述DNA提取緩沖液中Tris-HCl pH為7.5-8.0， EDTA pH為7. 5-8. 0,磷酸鹽緩沖液pH為7. 5-8. 0。所述步驟3 )中苯酚-氯仿-異戊醇按體積分?jǐn)?shù)比為25: 24: 1,氯仿-異戊醇按體積分?jǐn)?shù)比為24: 1。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1. 本發(fā)明所述的DNA提取方法簡(jiǎn)單易行，不需要較為復(fù)雜的設(shè)備，常 規(guī)生物化學(xué)或微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可完成；并且涉及的試劑均為常規(guī)分析、 分子生物學(xué)使用的試劑，且均已商品化，可直接從相應(yīng)的試劑公司購(gòu)得。2. 本發(fā)明在對(duì)DNA提取方法進(jìn)行改進(jìn)，提高提取的土壤總DNA的質(zhì)量。 使土壤樣品中DNA的電泳圖譜更為清晰，而且后續(xù)PCR擴(kuò)增過(guò)程變得更加 容易；這種方法的改進(jìn)不增加額外的試劑，成本增加也很小。3. 本發(fā)明所述的DNA提取方法適用范圍較廣，除了比較容易獲得DNA 的土壤外，有機(jī)質(zhì)含量較高的黑土土壤或森林土壤樣品均能夠通過(guò)該方法 提高提取的土壤DNA質(zhì)量，適于后續(xù)的PCR、酶切、雜交、克隆等分子生物學(xué)操作。


圖1為通過(guò)常規(guī)DNA提取方法與改進(jìn)方法獲得的土壤DNA瓊脂糖凝膠電 泳示意圖(其電泳圖為0. 8%瓊脂糖凝膠，從左至右依次為DNA marker; 泳道2-4:常規(guī)方法提取的DNA產(chǎn)物；5-6:改進(jìn)方法后提取的DNA產(chǎn)物)。圖2為16S rRNA基因片段(PCR擴(kuò)增引物為968f-gc/1401r )瓊脂糖凝 膠(1.5%)電泳圖(其中從左至右依次為泳道l-3:以常規(guī)方法提取的DNA 產(chǎn)物為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；DNA marker (泳道4);泳道5-6:改進(jìn) 方法后提取的DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 '1) 準(zhǔn)確稱取O. 5 g東北黑土土壤樣品，置于2 mL的滅菌離心管中， 加入O. 3g石英砂，再加入800-1000 juLDNA提取緩沖液(100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM EDTA [pH8. 0]， 100 mM磷酸鹽緩沖液(sodium phosphate ) [pH 8. 0] ， 1. 5 M NaCl， 1。/oCTAB)和5 ju L蛋白酶K ( 20 mg/mL )。 旋渦震蕩10 min,使土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)充分分散開并與DNA提取緩沖液等成分 充分混合，置于37° C水洛中溫洛lh,水浴過(guò)程中每隔15min將樣品翻轉(zhuǎn) 混勻幾次；其中磷酸鹽緩沖液為0. 147g磷酸二氫鈉；5. 08g七水合磷酸氫 二鈉溶于200亳升水中即可。2) 將震蕩后反應(yīng)液加入200 mL質(zhì)量濃度為1(WSDS溶液，漩渦混勻， 而后反復(fù)凍融3次，反復(fù)凍融為在-65匸冷凍而后在65t:速融即為一次，在 -65'C冷凍時(shí)間30min， 65°C時(shí)融化時(shí)間為20min。然后放入65t:水洛中溫 洛2h,并每隔15-20min輕輕搖動(dòng)一次，使細(xì)胞壁充分裂解；進(jìn)而在室溫 條件下6000 xg離心10min,收集上清液于新的滅菌離心管中。其中所得沉淀中加入160 jiLDNA提取緩沖液，40|liL 10%SDS溶液， 重新震蕩、溶解沉淀物，并置于65'C水浴40-50 min, 6000 x g離心10 min， 收集上清，使其與上述離心所得上清液混合，備用。3) 將上述混合上清液中加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(體積比為 25:24:1 )，搖勻溶液至乳狀，6000 x g離心10min,吸取上層水相；并在 上層水相中加入等體積的氯仿異戊醇(體積比為24:1)，搖勻，6000 x g 離心10min。吸取上層水相(視實(shí)驗(yàn)具體情況可再重復(fù)該步驟一次)；4) 將上述上清液內(nèi)加入0. 2倍體積的3mol/L醋酸鈉(pH 5. 2 )和0. 8 倍體積冷異丙醇，輕輕混勻，4'C放置l-2 h， 12000 x g離心20-30 min， 棄上清，收集DNA沉淀，用100 )aL7(W的冷乙醇洗滌沉淀2-3次，室溫干 燥。5) 干燥后沉淀中加入60jaL TE緩沖液(10mM Tris-HC1, pH 8.0, lmM EDTA )溶解DNA沉淀，得到DNA粗提液；6) DNA粗提液中加入500 iaL的DNA提取緩沖液，而后重復(fù)步驟3) -5),最終可獲得高質(zhì)量的DNA粗提液(參見圖l)。如圖1所示，泳道2-4 DNA電泳圖譜有拖尾現(xiàn)象，而.泳道5-6的DNA 圖譜清晰、無(wú)拖尾。考慮到各泳道DNA的加樣量相同，可見常規(guī)DNA提取 方法不能較有效去除DNA粗提液中所含的一些雜質(zhì)，而改進(jìn)的DNA提取方 法則能彌補(bǔ)這一不足。實(shí)施例21) 準(zhǔn)確稱取l.O g長(zhǎng)白山紅松林土壤樣品，置于5 mL的滅菌離心管 中，加入O. 5g石英砂,再加入1500 |iL DNA提取緩沖液(100 mMTris-HCl [pH 7.5〗，100 mM sodium EDTA [pH 7,5], 100 mM嫌酸鹽緩沖液(sodium phosphate ) [pH7.5]， 1. 5 M NaCl， 1。/oCTAB)和15 juL蛋白酶K (20 mg/mL)。旋渦震蕩20min，使土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)充分分散開并與DNA提取緩沖 液等成分充分混合，置于37° C水浴中溫浴1.5h,水洛過(guò)程中每隔10min 將樣品翻轉(zhuǎn)混勻幾次；其中磷酸鹽緩沖液為0. 735g磷酸二氫鈉與25. 4g七 水合磷酸氫二鈉溶于1000亳升水中即可。2) 將震蕩后反應(yīng)液加入400 juL 10% SDS溶液，漩渦混勻，而后反復(fù) 凍融3次，反復(fù)凍融為在-65t:冷凍而后在65'C速融即為一次，在-65'C冷 凍時(shí)間40min, 65'C時(shí)融化時(shí)間為10min。。然后放入65"C水浴中溫洛2 h, 并每隔15-20 min輕輕搖動(dòng)一次，使細(xì)胞壁充分裂解；進(jìn)而在室溫條件下 10000 xg離心20 min,收集上清液于新的滅菌離心管中。其中所得沉淀中加入350 DNA提取緩沖液，100 yL 10。/。SDS溶液， 重新震蕩、溶解沉淀物，并置于65X:水洛30-40min, 10000 x g離心20min， 收集上清，使其與上述離心所得上清液混合，備用。3) 將上述混合上清液中加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(體積比為 25:24:1 )，搖勻溶液至乳狀，10000 x g離心20min,吸取上層水相；并在 上層水相中加入等體積的氯仿異戊醇(體積比為24:1)，搖勻，10000 xg 離心20min。吸取上層水相(視實(shí)驗(yàn)具體情況可再重復(fù)該步驟一次)；4) 將上述上清液內(nèi)加入約0. 3倍體積的3 mol/L醋酸鈉(pH 5. 2 )和 l.O倍體積冷異丙醇，輕輕混勻，4'C放置1-2 h, 12000 x g離心20min, 棄上清，收集DNA沉淀，用100 juL70y。的冷乙醇洗滌沉淀2-3次，室溫干 燥。5) 干燥后沉淀中加入100]uLTE緩沖液UOmMTris-HCl， pH 7. 5， lmM EDTA )溶解DNA沉淀，得到DNA粗提液；6) DNA粗提液中加入600 )iL的DNA提取緩沖液，而后重復(fù)步驟3) -5)，最終可獲得高質(zhì)量的DNA粗提液(參見圖2)。從圖2所知在相同的PCR條件下，以常規(guī)方法提取的DNA為模板沒(méi)有獲 得目的基因產(chǎn)物(泳道l-3),而改進(jìn)方法后，DNA純度得以提高，成功擴(kuò) 增出16S rRNA基因片斷(如泳道5-6所示)。 實(shí)施例3與實(shí)施例l不同之處在于1 )準(zhǔn)確稱取5 g 土壤樣品，加入lg石英砂，再加入5mL DNA提取緩 沖液(50mM Tris-HCl [pH 7.5], 80mM sodium EDTA [pH 7.5]， 60 mM磷 酸鹽緩沖液(sodium phosphate ) [pH 7.5]，2.5M NaCl，2% CTAB )和50 HL蛋白酶K (20mg/raL)。旋渦震蕩15min,使土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)充分分散開并與DNA提取緩沖液等成分充分混合，置于30° C水洛中溫浴2h,水洛過(guò) 程中每隔5min將樣品翻轉(zhuǎn)混勻幾次；2) 將震蕩后反應(yīng)液加入2000 nL 10% SDS溶液，在室溫條件下8000 xg離心30 min,收集上清液于新的滅菌離心管中。其中所得沉淀中加入600 pLDNA提取緩沖液，40jaL 10。/。SDS溶液，重 新震蕩、溶解沉淀物，并置于65。C水洛50-60min, 8000 x g離心30min, 收集上清，使其與上述離心所得上清液混合，備用。3) 將上述混合上清液中加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(體積比為 25:24:1 ),搖勻溶液至乳狀，10000 x g離心20min,吸取上層水相；并在 上層水相中加入等體積的氯仿異戊醇(體積比為24:1)，搖勻，8000 xg 離心30min。4 )將上述上清液內(nèi)加入0. 2倍體積的3 mol/L醋酸鈉(pH 5. 2 )和1. 2 倍體積冷異丙醇，輕輕混勻，4。C放置l-2 h， 11000 x g離心25min,棄上 清，收集DNA沉淀，用100 juL 70%的冷乙醇洗滌沉淀2-3次，室溫干燥。5)干燥后沉淀中加入80iuL TE緩沖液U0mM Tris-HCl， pH 7. 5， lmM EDTA )溶解DNA沉淀，得到DNA粗提液；6)DNA粗提液中加入1000 n L的DNA提取緩沖液，而后重復(fù)步驟3)-5), 最終可獲得高質(zhì)量的DNA粗提液。實(shí)施例4與實(shí)施例l不同之處在于1) 準(zhǔn)確稱取3g土壤樣品，加入0.8g石英砂，再加入3mLDNA提取緩 沖液(80mM Tris-HC1 [pH 7.5]， 50mM sodium EDTA [pH 7.5], 5隨磷酸 鹽緩沖液(sodium phosphate ) [pH 7. 5]，0.5M NaCl， 0. 5% CTAB )和30 juL蛋白酶K (20 mg/mL)。2) 將震蕩后反應(yīng)液加入1000liL 10% SDS溶液。 其中所得沉淀中加入lOOjiL DNA提取緩沖液，400|iL 10%SDS溶液，重新震蕩、溶解沉淀物，并置于65。C水浴40-50min, 9000 x g離心15min,收集上清，使其與上述離心所得上清液混合，備用。 3 ) 9000 x g離心15min。5)干燥后沉淀中加入80 iaLTE緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 8.0， 2mM EDTA )溶解DNA沉淀，得到DNA粗提液；6)DNA粗提液中加入800iaL的DNA提取緩沖液，而后重復(fù)步驟3)-5), 最終可獲得高質(zhì)量的DNA粗提液。實(shí)施例5與實(shí)施例1不同之處在于1) 準(zhǔn)確稱取2g土壤樣品，加入lg石英砂，再加入lmL DNA提取緩沖 液和20jaL蛋白酶K (20 mg/mL)。2) 將震蕩后反應(yīng)液加入800jiL 10% SDS溶液。5 )干燥后沉淀中加入50jiL TE緩沖液(20mM Tris-HC1， pH 8. 0， 2mM EDTA )溶解DNA沉淀，得到DNA粗提液；6 )DNA粗提液中加入900 ja L的DNA提取緩沖液，而后重復(fù)步驟3 )-5 )， 最終可獲得高質(zhì)量的DNA粗提液。以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的相應(yīng)擴(kuò)大，而相應(yīng)的增加。
權(quán)利要求
1.一種提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法，其特征在于1)向0.5-5.0g提取樣品中加入1.0-5.5ml DNA提取緩沖液，再加入0.3-1.0g石英砂和5-50μl濃度為的蛋白酶K并混勻，置于漩渦振蕩器中震蕩10～20min；然后30-40℃水浴1-2小時(shí)；其中DNA提取緩沖液為50-150mM Tris-HCl，50-100mM EDTA，50-100mM磷酸鹽緩沖液，0.5-2.5MNaCl，質(zhì)量濃度為0.5-2％十六烷基三甲基溴化銨；2)將震蕩后反應(yīng)液中加入200-2000μl質(zhì)量濃度為5-10％的十二烷基磺酸鈉漩渦震蕩后反復(fù)凍融3次，而后放入65℃水浴中溫育1-2h，進(jìn)而在室溫條件下6000-10000×g離心10-30min，收集上清液，備用；3)在上述上清液中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，搖勻至乳狀，室溫條件下6000-10000×g離心10-30min，收集上清液；而后再上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻至乳狀，室溫條件下6000-10000×g離心10-30min，收集上清液；4)將上述上清液中加入其0.2-0.3倍體積的醋酸鈉和0.8-1.2倍體積冷異丙醇混勻，在4℃放置1-2h，10000-12000×g離心20-30min，收集DNA沉淀，沉淀經(jīng)乙醇潤(rùn)洗2-3次，而后干燥；5)向干燥后的DNA沉淀中加入50-100μL TE緩沖液使其溶解，得到DNA粗提液；6)將上述粗體液中500-1000μL的DNA提取緩沖液，重復(fù)步驟3)-5)即可獲得較高質(zhì)量的DNA提取液。
2. 按權(quán)利要求1所述的提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法，其 特征在于所述步驟l)水浴過(guò)程中每隔5-15min將樣品上下翻轉(zhuǎn)混勻；所 述蛋白酶K濃度為10-20mg/L。
3. 按權(quán)利要求1所述的提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法，其 特征在于所述經(jīng)步驟2)離心所得沉淀中加入dna提取緩沖液100-600 m 1， SDS溶液40-400 漩渦震蕩混勻，放入65。C水洛中溫育30-60min， 室溫條件下6000-10000 x g離心10-30min，收集上清液，其上清液與步驟2 )中獲得的上清液混合，備用。
4. 按權(quán)利要求1所述的提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法，其特征在于所述步驟2)反復(fù)凍融為在-65。C冷凍而后在65C速融即為一次， 同時(shí)在-65。C冷凍時(shí)間為30 -60min, 65'C時(shí)融化時(shí)間為10-20min。
5. 按權(quán)利要求1所述的提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法，其 特征在于所述TE緩沖液為5-20mMTris-HC1， pH 7. 5-8. 0, 0. 5-2mMEDTA, 所述DNA提取緩沖液中Tris-HCl pH為7.5-8.0， EDTA pH為7. 5-8. 0,磷 酸鹽緩沖液pH為7.5-8.0。
6. 按權(quán)利要求1所述的提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法，其特征在于所述步驟3)中苯酚-氯仿-異戊醇按體積分?jǐn)?shù)比為25:24:1,氯 仿-異戊醇按體積分?jǐn)?shù)比為24: 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及土壤微生物學(xué)，具體說(shuō)是一種能夠提高DNA質(zhì)量的土壤樣品總DNA提取方法。具體為向土壤樣品中加入DNA提取緩沖液，再加入蛋白酶K，-65℃～65℃凍融后離心，棄沉淀，收集上清液；用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇抽提、離心，取水相；再用氯仿-異戊醇抽提一次；加入醋酸鈉和冷異丙醇，離心，收集DNA沉淀，經(jīng)乙醇潤(rùn)洗后室溫干燥，加入TE緩沖液溶解，得到DNA粗提液；向粗提液中加入DNA提取緩沖液，再加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇抽提，并重復(fù)上述沉淀、潤(rùn)洗、干燥、溶解等步驟，即獲得較高質(zhì)量的DNA。采用本發(fā)明方法可有效去除DNA中所含的一些雜質(zhì)，使DNA的純度以及質(zhì)量獲得顯著提高。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101230342SQ200810010349
公開日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日
發(fā)明者史榮久, 穎 張, 慧 徐, 楊偉超, 莫旭華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所