專利名稱：一種制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種磁性納米固定化酶的制備方法，尤其涉及一種以四氧化三鐵納米顆 粒為載體可重復利用的磁性納米固定化酶的制備方法。
背景技術：
酶作為一種高效專一的生物催化劑，被廣泛應用于釀造、食品、醫藥等領域。但由 于酶的蛋白質屬性，在熱、強酸、強堿及有機溶劑中不穩定，故酶通常存在于水溶液中 使用，致使其回收和重復利用成為一個難題。
利用四氧化三鐵納米顆粒作為載體制備固定化酶可以有效地解決酶制品回收利用 的難題，但現有的固定化方法，多通過在四氧化三鐵表面引入硅烷基、羧基等進行表面 修飾，進而加入戊二醛、碳二亞胺等交聯劑與酶分子交聯，但由于所述表面修飾過程中 引入了多種化學試劑，導致酶活力嚴重喪失。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可重復利用的磁性納米固定化酶 的制備方法。該方法可以方便地回收化學性質穩定的固定化酶，特別適用于催化領域、 環境污染物降解及能源物質的合成過程。
本發明所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，步驟如下
(1) 用共沉淀法制備納米四氧化三鐵粉末，所述共沉淀法是以氨水作為沉淀劑，
氮氣保護下加入氯化高鐵與氯化亞鐵，其中Fe":Fe2+:0H一的摩爾比為2:1:8，化學反應 的方程式是2《++F/++8(9/r =《36>4+4//2(9;反應后經冷凍干燥得表面吸附氨基的 納米四氧化三鐵粉末；
(2) 將表面吸附氨基的納米四氧化三鐵粉末分散于蒸餾水中，超聲分散得到濃度 為0. 15 0. 5克四氧化三鐵/毫升的磁流體；
(3) 取步驟(2)所述的磁流體，滴加其體積量0. 2 2倍的質量濃度為25% (w/w) 的交聯劑戊二醛，再加入其體積量0. 05 2倍的質量濃度為0. 01% 10% (w/w)的酶溶 液；
(4) 充分混勻后在25r 3(TC溫度條件下，交聯O. 5 1.5小時； (5) 在磁場強度為-150000z 150000z的外磁場作用下固液分離步驟(4)所述的
交聯產物，然后用蒸餾水洗滌固相產物3 4次，得可重復利用的磁性納米固定化酶。
將上述制備的固定化酶常規方式冷凍干燥，能進一步獲得可重復利用、易儲運的固 定化酶干粉。
上述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法中，步驟(2)所述磁流體的濃度 優選0.2 0.4克四氧化三鐵/毫升。步驟(3)所述交聯劑的滴加量優選是磁流體體積 量的0.5 1.5倍；所述酶溶液的加入量優選是磁流體體積量的O. 1 1.5倍。步驟(4) 所述交聯溫度優選是3(TC，交聯時間優選是l小時。
上述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法中，步驟(3)所述酶溶液優選是脂肪酶、木瓜蛋白酶、辣根過氧化物酶或葡萄糖苷酶的溶液，其質量濃度優選0. 1% 1. 5%。
其中所述酶溶液最優選是脂肪酶溶液。
本發明方法在納米四氧化三鐵的制備過程中加入了氨水作為沉淀劑，將四氧化三鐵 顆粒表面引入氨基，再加入戊二醛作為交聯劑，在交聯劑的作用下與酶分子氨基作用， 從而交聯形成高蛋白質載量的固定化酶。整個過程中酶活力喪失少，操作簡便易行，所 得固定化酶化學性質穩定，便于回收。凍干后重復利用性不變，且便于儲運。
根據所選酶的類型確定底物，測定固定化酶活力。第一輪反應結束后在外磁場作用 下固液分離，上清用于測定酶活力，殘留固定化酶加入蒸餾水洗滌3次，重新加入等量 底物進行下一輪反應。如此重復十次，前三次重復利用后酶活力可保留同等量游離酶活
力的60% 95%;重復利用十次后，可保留同等游離酶活力的10% 20%。相對于化學法 進行表面修飾制備固定化酶的方法，酶活力提高了6 10倍。固定化酶凍干粉具有相同 特性。
本發明與現有技術相比，有如下優點-
本發明方法更加簡便易行，其制備的固定化酶具有高蛋白質載量，便于回收的特點， 且在制備過程中涉及化學試劑少可保持高酶活力，成品酶在外加磁場的作用下，可經外 部磁場回收多次重復利用并保持高的活性回收率，從而提高了酶的利用率，降低了成本。
具體實施方式
實施例1
將1. 5克納米四氧化三鐵粉末分散于10毫升蒸餾水中，取1. 5毫升加入50微升25% 戊二醛，再加入1毫升1%脂肪酶(豬胰腺來源)溶液，室溫(約25'C)交聯0.5小時。 在外磁場作用下固液分離，交聯產物用蒸餾水洗滌三次后，得到所需的磁性納米固定化 酶。進一步將制備的固定化酶冷凍干燥，能獲得可重復利用、易儲運的固定化酶干粉。 以對硝基酚棕櫚酸酯為底物，測定固定化酶活力。反應結束后在外磁場作用下固液 分離，交聯產物加入蒸餾水洗滌三次，加入底物重復測定十次。 實施例2
將3克納米四氧化三鐵粉末分散于10毫升蒸餾水中，取0. 6毫升加入600微升25% 戊二醛，再加入0. 75毫升0. 01%脂肪酶(假單胞菌來源)溶液，3(TC交聯1小時。在外 磁場作用下固液分離，交聯產物用蒸餾水洗滌三次后，得到所需的磁性納米固定化酶。 以對硝基酚棕櫚酸酯為底物，測定固定化酶活力。反應結束后在外磁場作用下固液 分離，交聯產物加入蒸餾水洗滌三次，加入底物重復測定十次。 實施例3
將5克納米四氧化三鐵粉末分散于10毫升蒸餾水中，取1. 5毫升加入1000微升25% 戊二醛，再加入3毫升10%脂肪酶(假絲酵母來源)溶液，3(TC交聯1.5小時。在外磁 場作用下固液分離，交聯產物用蒸餾水洗滌三次后，得到所需的磁性納米固定化酶。
以對硝基酚棕櫚酸酯為底物，測定固定化酶活力。反應結束后在外磁場作用下固液 分離，交聯產物加入蒸餾水洗滌三次，加入底物重復測定十次。 實施例4
(1)用共沉淀法制備納米四氧化三鐵粉末，所述共沉淀法是以氨水作為沉淀劑，氮氣保護下加入氯化高鐵與氯化亞鐵，其中Fe":Fe2+:0H—的摩爾比為2:1:8，化學反應 的方程式是2《+ +《2++8(9//-= Fe304+4/f2(9;反應后經冷凍干燥得表面吸附氨基的 納米四氧化三鐵粉末；
(2) 將表面吸附氨基的納米四氧化三鐵粉末分散于蒸餾水中，超聲分散得到濃度 為0. 3克四氧化三鐵/毫升的磁流體；
(3) 取步驟(2)所述的磁流體，滴加其體積量1倍的質量濃度為25%的交聯劑戊 二醛，再加入其體積量1倍的質量濃度為1%的脂肪酶溶液；
(4) 充分混勻后在3(TC溫度條件下，交聯1.5小時；
(5) 在磁場強度為150000z的外磁場作用下固液分離步驟(4)所述的交聯產物， 然后用蒸餾水洗滌固相產物3次，得可重復利用的磁性納米固定化酶。
實施例5
(1) 用共沉淀法制備納米四氧化三鐵粉末，所述共沉淀法是以氨水作為沉淀劑， 氮氣保護下加入氯化高鐵與氯化亞鐵，其中Fe,Fe":0H—的摩爾比為2:1:8，化學反應 的方程式是2《+ +尸/++8(9//-=《304+4//2(9;反應后經冷凍干燥得表面吸附氨基的 納米四氧化三鐵粉末；
(2) 將表面吸附氨基的納米四氧化三鐵粉末分散于蒸餾水中，超聲分散得到濃度 為0. 5克四氧化三鐵/毫升的磁流體；
(3) 取步驟(2)所述的磁流體，滴加其體積量1.5倍的質量濃度為25%的交聯劑 戊二醛，再加入其體積量1. 5倍的質量濃度為1%的脂肪酶溶液；
(4) 充分混勻后在25'C溫度條件下，交聯1.5小時；
(5) 在磁場強度為100000z的外磁場作用下固液分離步驟(4)所述的交聯產物， 然后用蒸餾水洗滌固相產物4次，得可重復利用的磁性納米固定化酶。
實施例6
制備兩份固定化酶，每份各將3克納米四氧化三鐵粉末分散于10毫升蒸餾水中， 加入10毫升25%戊二醛，再加入12.5毫升0.01%脂肪酶(假單胞菌來源)溶液，30°C 交聯1小時。交聯產物用蒸餾水洗滌三次后， 一份經冷凍干燥制成固定化酶干粉， 一份 加入10毫升蒸餾水。以對硝基酚棕櫚酸酯為底物，分別測定固定化酶活力。反應結束 后在外磁場作用下固液分離，上清在410nm下測定吸光度，折算成酶活力；殘留固定化 酶加入蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進入第二輪反應。如此重復測定十次。重復利 用三次結束后，可保留同等量游離酶酶活力的63%，十次結束后，可保留同等量游離酶 酶活力的12%。固定化酶凍干粉具有相同特性。 實施例7
制備兩份固定化酶，每份各將4. 5克納米四氧化三鐵粉末分散于30毫升蒸熘水中， 加入10毫升25%戊二醛，再加入20毫升W脂肪酶(豬胰腺來源)溶液，室溫(約25 。C)交聯0.5小時。交聯產物用蒸餾水洗漆三次后，以對硝基酚棕櫚酸酯為底物，測定 固定化酶活力。反應結束后在外磁場作用下固液分離，上清在410mn下測定吸光度，折 算成酶活力；殘留固定化酶加入蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進入第二輪反應。如 此重復測定十次。重復利用三次結束后，可保留同等量游離酶酶活力的91%，十次結束 后，可保留同等量游離酶酶活力的29%。
權利要求
1. 一種制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，步驟如下(1)用共沉淀法制備納米四氧化三鐵粉末，所述共沉淀法是以氨水作為沉淀劑，氮氣保護下加入氯化高鐵與氯化亞鐵，其中Fe3+∶Fe2+∶OH-的摩爾比為2∶1∶8，化學反應的方程式是id="icf0001" file="S2008100164186C00011.gif" wi="63" he="4" top= "63" left = "50" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>反應后經冷凍干燥得表面吸附氨基的納米四氧化三鐵粉末；(2)將表面吸附氨基的納米四氧化三鐵粉末分散于蒸餾水中，超聲分散得到濃度為0.15～0.5克四氧化三鐵/毫升的磁流體；(3)取步驟(2)所述的磁流體，滴加其體積量0.2～2倍的質量濃度為25％的交聯劑戊二醛，再加入其體積量0.05～2倍的質量濃度為0.01％～10％的酶溶液；(4)充分混勻后在25℃～30℃溫度條件下，交聯0.5～1.5小時；(5)在磁場強度為-150000z～150000z的外磁場作用下固液分離步驟(4)所述的交聯產物，然后用蒸餾水洗滌固相產物3～4次，得可重復利用的磁性納米固定化酶。
2. 如權利要求1所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，其特征在于，步 驟(2)所述磁流體的濃度為0.2 0.4克四氧化三鐵/毫升。
3. 如權利要求1所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，其特征在于，步 驟(3)所述交聯劑的滴加量是磁流體體積量的0.5 1.5倍。
4. 如權利要求1所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，其特征在于，步 驟(3)所述酶溶液的加入量是磁流體體積量的0.1 1.5倍。
5. 如權利要求1所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，其特征在于，步 驟(3)所述酶溶液是脂肪酶、木瓜蛋白酶、辣根過氧化物酶或葡萄糖苷酶的溶液，其 質量濃度為0. 1% 1.5%。
6. 如權利要求5所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，其特征在于，步 驟(3)所述酶溶液是脂肪酶溶液。
7. 如權利要求1所述制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，其特征在于，步 驟(4)所述交聯溫度是30。C，交聯時間是l小時。
全文摘要
本發明公開了一種制備可重復利用的磁性納米固定化酶的方法，步驟是用共沉淀法制備表面吸附氨基的納米四氧化三鐵粉末；利用該表面基團，在交聯劑的作用下與酶分子氨基作用，完成交聯過程，再在外磁場作用下固液分離，回收固定化酶，得可重復利用的磁性納米固定化酶。本發明的磁性納米固定化酶具有高蛋白質載量，高酶活，便于回收，化學性質穩定的特點，適用于催化領域、環境污染物降解及能源物質的合成過程。
文檔編號C12N11/00GK101280298SQ200810016418
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月29日 優先權日2008年5月29日
發明者霞 王, 竇培培, 平 許, 鵬 趙, 趙傳明 申請人:山東大學