專利名稱：：老年性癡呆重組蛋白疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，特別是一種老年性癡呆重組多價(jià)13-淀粉樣蛋白1-15(AU蛋白疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：老年性癡呆(Alzheimer'sdisease,AD)是一種神經(jīng)細(xì)月包退4亍性疾病，臨床以進(jìn)^f亍性記憶和后天獲得的知識(shí)喪失為特征，直到最后病人喪失生活能力。隨著發(fā)病人數(shù)的增加，AD給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，是一個(gè)重要的社會(huì)和醫(yī)療衛(wèi)生問題。關(guān)于AD的治療，目前尚無理想方法，現(xiàn)有的治療策略主要著眼于緩解癥狀，并沒有阻止AD的病理進(jìn)程，其臨床療效并不理想。A13是老年性癡呆病理變化老年斑的主要成分，其由3942個(gè)氨基酸組成。近年來的研究表明，A15的集聚和沉積及其伴隨的神經(jīng)元損害是老年性癡呆病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，因此，針對(duì)A15的治療策略和方法相繼尋皮才是出。研究表明，1999年Schenk首次報(bào)道{Immunizationwithamyloid-betaattenuatesAlzheimer-disease-likepathologyinthePDAPPmouse[seecomments].Nature,1999Jul8;400(6740):173-7}采用免疫學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因AD模型鼠(PDAPP鼠)治療；目前，國外的老年性癡呆疫苗M42肽疫苗已進(jìn)入IIa臨床試驗(yàn)，由于部分試驗(yàn)病人出現(xiàn)了接種后綜合癥，包括無菌性腦膜炎，實(shí)驗(yàn)因此停止。尸檢發(fā)現(xiàn)，在患者的軟腦膜、血管間隙及腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有T細(xì)胞浸潤，由此推測(cè)腦膜腦炎的發(fā)生可能與八1342全肽C末端含有的毒性T細(xì)胞抗原表位(A1316-42)激發(fā)了機(jī)體Thl型自身免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，通過去除AfiT細(xì)胞抗原表位、保留其B細(xì)胞抗原表位的方法來制備第二代AD疫苗的方法成為了首選。最近文獻(xiàn)報(bào)道的第二代AD疫苗仍有許多不盡人意的地方1)研究者們制備的抗原大多為化學(xué)合成，合成肽的化學(xué)修飾難度大，成本高，而且純度不高。2)研究者們?cè)谥苽浜蠥13N末端B細(xì)胞抗原表位的多價(jià)疫苗時(shí)，大多是將B細(xì)胞抗原表位片段直接與一個(gè)新的T細(xì)胞表位連接，或者B細(xì)胞抗原表位直接串聯(lián)，容易影響抗原的空間結(jié)構(gòu)，不利于Afi的B細(xì)胞抗原表位的暴露。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服制備老年性癡呆疫苗的上述缺點(diǎn)，提供一種毒性小、免疫原性好、以柔性肽連接AfiB細(xì)胞抗原表位的一種老年性癡呆重組多價(jià)A13w5蛋白疫苗，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了重組四價(jià)ABws蛋白疫苗(4xA1315)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為了提供成本低、化學(xué)純度高的生產(chǎn)該疫苗的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案合成多條寡核苷酸引物，通過基因擴(kuò)增得到的兩個(gè)或以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)Afiws基因片斷，克隆入pQE-30原核表達(dá)質(zhì)粒(購自德國Qiagene公司的商業(yè)質(zhì)粒)中，經(jīng)細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)、純化，制備出能表達(dá)ABw5氨基酸序列間通過柔性連接肽連接形成柔性可折疊的多價(jià)ABw5的重組蛋白疫苗。其中，所述AJ3ws氨基酸序列為Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His畫Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln柔性連接肽一般采用一個(gè)或數(shù)個(gè)(多為四個(gè)以下)分子量較小的人體必需氨基酸連接,如甘氨酸、絲氨酸等，其序列可以為Gly-Gly或Gly-Ser-Ser-Gly其中，柔性連接肽避免了多拷貝ABB細(xì)胞抗原表位的空間僵化結(jié)構(gòu)，還使Al^表位更容易暴露，增強(qiáng)了免疫原性。同時(shí)也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。本發(fā)明優(yōu)選AJ^5氨基酸序列為四價(jià)，即4xA1315。在這種情況下，蛋白疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性，而同時(shí)其生產(chǎn)方法相對(duì)較為簡(jiǎn)單。本發(fā)明的老年性癡呆重組多價(jià)ABw5蛋白疫苗的生產(chǎn)方法包括以下步驟(1)合成多條寡核苷酸引物，通過基因擴(kuò)增得到的兩個(gè)或兩個(gè)以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)ABw5基因片斷；Asp-Ala畫Glu-Phe畫Arg畫His-Asp-Ser-Gly畫Tyr-Glu畫Val-His-His-Gln畫G/,G/j;一Asp畫Ala-Glu畫Phe-Arg隱His-Asp陽Ser畫Gly-Tyr-Glu-Val-His隱His-Gln-G7j;-5^-5^-G/少(2xA1^5-!)和G/_y-Ser-Ser-G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G^-G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-ffis-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gin(2xA1515-2);(2)將兩個(gè)或以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)ABw5基因片斷依次克隆入pQE-30原核表達(dá)質(zhì)粒(購自德國Qiagene公司的商業(yè)質(zhì)粒)中，制備重組質(zhì)粒pQE-4xAfi15;(3)將重組質(zhì)粒pQE-4xAJ315轉(zhuǎn)化入含有pREP4質(zhì)粒的表達(dá)菌M15[pREP4]中，IPTG(isopropyl-fi-D畫thiogalactopyranoside,異丙基碌u代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)4xAi^重組蛋白；(4)將表達(dá)的4xAJ^重組蛋白經(jīng)his-tagNi^親和純化樹脂(組氨酸標(biāo)簽的鎳離子親和純化樹脂，購自德國Qiagene公司)純化后，透析獲得高純度的4xAl^重組蛋白；(5)將高純度的4xA1315重組蛋白與佐劑等體積充分乳化混合后制備成4xA"5重組蛋白疫苗。本發(fā)明選擇多價(jià)可折疊的AJ3w5為免疫原，避免了多拷貝ABB細(xì)胞抗原表位的空間僵化結(jié)構(gòu)，還使Afi,5表位更容易暴露，增強(qiáng)了免疫原性。同時(shí)也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。選擇原核表達(dá)系統(tǒng)來制備重組蛋白，避免了化學(xué)合成的高難度及高成本的缺點(diǎn)。本發(fā)明可以選擇的佐劑有MF59及鋁佐劑等，優(yōu)選以MF59為佐劑，可以促進(jìn)免疫反應(yīng)向Th2方向纟及化。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用來對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不能理解為本發(fā)明的實(shí)施方式僅限于本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例一以四價(jià)可折疊的Afiw5為免疫原的重組蛋白疫苗的制備，包括以下步驟1重組質(zhì)粒pQE-4xAfi15的制備1.1設(shè)計(jì)插入pQE-30的四價(jià)B細(xì)胞抗原表位片斷4xAJ^s序列為A13M5+GG+Afiws+GSSG+ABw5+GG+Afiws1.2重組質(zhì)粒pQE-4xA15i5構(gòu)建1.2.1ABws+GG+A6w5+GSSG(&cI)(2xAfi15-l,即第一個(gè)二價(jià)ABws基因)片段的引物設(shè)計(jì)Pl引物5，-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGATTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAGATGCAGAATTCCGA體加粗為甘氨酸連接肽，甘氨酸連接肽前后分別為Afi,5堿基序列，加粗分別為5a/wHI和5"acI酶切位點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的石威基。P2引物5，-CGAGCTCCCTTGATGATGAAC-3';加粗為SacI酶切位點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的堿基；1.2.2GSSG(&cI)+Afiw5+GG+A13w5(2xA1515.2，即第二個(gè)二價(jià)AfiM5基因)片段的引物設(shè)計(jì)P3引物5'-GGAGCTCGGGTGATGCAGAATTCCGACATGATTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAGATGCAGAATTCCGACATGATTCAGGATATGAAGTTCATCATCAATGAAAGCTTGGG-3，;斜體加粗為甘氨酸連接肽，甘氨酸連接肽前后分別為A仏5堿基序列，加粗分別為&cl和歷wdni酶切位點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的堿基；P4引物5，-CCCAAGCTTTCATTGATGATGAAC-3，;加粗為///wdni酶切位點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的i咸基；1.2.32xAJ3^片段的擴(kuò)增Pl,P2為引物，以合成的Pl引物為模板，ExTaq酶，94。C預(yù)變性5min,然后94。C變性45s;52。C退火30s;72。C延伸45s,30次循環(huán)。最后72°C延伸7min，擴(kuò)增P2xAAw片段。1.5%的瓊脂糖電泳觀測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。1.2.42xAJ^.2片段的擴(kuò)增P3,P4為引物及模板，ExTaq酶，94。C預(yù)變性5min,然后9《C變性45s;52。C退火30s;72。C延伸45s，30次循環(huán)。最后72。C延伸7min，擴(kuò)增2xAfi,5.2片段。1.2.5pQE-4xA1^5的構(gòu)建用SamHI和SacI雙酶切2xA13w片段和pQE-30。回收線狀pQE-30載體與2xA1315—i片段，T4DNA連接酶，16。C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5a,挑選轉(zhuǎn)化子，含氨千青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，Omega質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒，用SamHI/5"acI于37。C雙酶切鑒定，陽性重組子命名為pQE-2xA13w。同樣，用SacI和歷"dIII雙酶切2><八1315-2片段和pQE-2xAJ^5—p回收線狀pQE-2xAi^5—i載體與2xA13!5-2酶切片段，T4DNA連接酶，16。C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5a,獲得陽性重組子pOE-4xAfi二。2重組質(zhì)粒pQE-4xAl^的表達(dá)及鑒定pQE-4xA仏5轉(zhuǎn)化M15[pREP4]菌，lmMIPTG30。C誘導(dǎo)6小時(shí)，取對(duì)照菌體和表達(dá)4xAf^5菌體，以加樣緩沖液裂解后，煮沸10min后，12000rpm，離心10min，取20(al上清上樣。5%濃縮膠，20%的分離膠的制備的PAGE膠(PolyacrylamideGelElectrophoresis,聚丙烯酰胺凝膠電泳)，Tricine《三(羥曱基)曱基甘氨酸)電泳緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE(SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳，電泳條件先40v恒壓約40min，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至恒壓60v,約3h。再100v電轉(zhuǎn)1.5h至聚偏二氟乙烯(PolyvinylideneFluioride，PVDF)膜上，用5。/。脫脂奶粉封閉2h，加入抗A13單抗(1:2000，Sigma)孵育1h,TBST(TrisBufferSalineTween，吐溫Tris石成緩沖液)緩沖液洗滌5次后，加入HRP-羊抗鼠IgG(1:4000),孵育1h。TBST緩沖液洗滌5次后，顯影，同時(shí)以本申請(qǐng)人原核表達(dá)并純化的GST-Afi42肽為免疫印跡(WesternBlotting)實(shí)-瞼的陽性對(duì)照。3重組4xA1^5蛋白表達(dá)及純化培養(yǎng)2000ml細(xì)菌培養(yǎng)物，600nm光學(xué)密度值(OD600)為0.6時(shí)加入1molIPTG2ml,30°C200rpm振搖11h。收獲誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物，12000g離心5min沉淀菌液，棄上清。往沉淀中加入100ml4。C預(yù)冷的lxPBS重懸。水浴超聲，功率30%,超聲10s，間隔30s,持續(xù)40min，避免起泡。液體變清亮后，4°C,13000g離心30min，取上清。上清中加入平衡后的his-tagN卜親和純化樹脂(組氨酸標(biāo)簽的鎳離子親和純化樹脂，購自德國Qiagene^^司)2ml,室溫:旋轉(zhuǎn)混勻30min,500g離心5min,棄上清，沉淀中加入10ml洗滌緩沖液(Washingbuffer)重懸，反復(fù)顛倒混勻5min,500g離心5min，棄上清，重復(fù)2次。沉淀中加入1ml溶解緩沖液(ElutionBuffer),室溫旋轉(zhuǎn)混勻10min，500g離心5min,收集上清，重復(fù)2次，合并3次收集的上清，透析后，取5pl上樣SDS-PAGE電泳及WesternBlotting鑒定。將4xA1315蛋白濃縮并測(cè)定蛋白濃度后低溫保存下送至測(cè)試中心行電噴霧質(zhì)譜觀'J試其純度。4重組4xAl^蛋白疫苗的制備重組4xA1^5蛋白與等量的佐劑MF59(鯊烯5ml，Tween800.5ml,span850.5ml，PBS94ml，配成100混合液，混合后乳化15min)混合充分乳化后制備成重組4xAfiu蛋白疫苗。本實(shí)施例中，八]315即為Afiw5。實(shí)例例二重組4xAl^蛋白疫苗接種Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠后免疫學(xué)、病理學(xué)及行為學(xué)觀察試驗(yàn)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只12月齡Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠為美國Taconic公司產(chǎn)品，并在本室繁育成功)。飼養(yǎng)到12月齡后隨機(jī)分為2組4xA1315組和PBS對(duì)照組，每組各6只。1.2免疫接種重組4xA1315蛋白與等量的佐劑MF59(鯊烯5ml,Tween800.5ml,span850.5ml，PBS94ml，配成100混合液，混合后乳化15min)混合充分乳化后制備成重組4xAf^5蛋白疫苗，以100貼只/次背部皮下多點(diǎn)注射接種6只12月齡的Tg2576鼠，每次注射100pL，，第1次接種后,兩周后加強(qiáng)1次,以后每隔4周接種一次。第6次接種后第7次不接種，進(jìn)行抗體滴度測(cè)定。1.3間才妻酶耳關(guān)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法檢測(cè)血清中抗A1342的滴度鼠尾采血，凝固后，離心分離血清，間接ELISA法檢測(cè)AJ3抗體。用以本i果題組原核表達(dá)并純化的GST-A1542肽(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶，glutathioneS-transferase,GST)為抗原包被ELISA板，每孔1嗎(0.05M碳酸鹽緩沖液,pH9.0配制)，4。C包被過夜。PBST(phosphatebuffersalinetween,吐溫磷酸鹽緩沖液)洗板后，于37°C，3%BSA(BovineSerumAlbumin,牛血清白蛋白)封閉2h。血清樣品從l:20開始倍比稀釋，平行兩孔，100pl/孔，37°C,2h;以PBS對(duì)照組免疫接種的小鼠血清為陰性對(duì)照，AB單抗為陽性對(duì)照。PBST洗板四次，拍干后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1:5000),37°C,1h;PBST洗4反四次，拍干后，加入TMB(3,3',5，5畫Tetramethylbenzidine,3,3,5,5-四曱基聯(lián)苯胺)底物，室溫顯色10min，2mol/LH2S04終止，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm的OD值(opticaldensity,光學(xué)密度)。(測(cè)定值OD畫空白OD)/(陰性對(duì)照OD-空白OD)大于或等于2.1,且實(shí)驗(yàn)組OD值大于0.4，判斷為陽性。1.4Moms水迷宮行為學(xué)測(cè)試Morris水迷宮主要由三部分組成，即內(nèi)含平臺(tái)的圓形水池、自動(dòng)記錄裝置和電腦分析系統(tǒng)。水池由不銹鋼板制成，直徑100cm、水池深40cm，平臺(tái)由透明有機(jī)玻璃制成，臺(tái)高29cm,加水至30cm。水中加入奶粉成乳白色，使水面看不清平臺(tái)，水溫保持2(tc左右。按電腦分析系統(tǒng)內(nèi)所標(biāo)象限坐標(biāo)，標(biāo)記東(E,X軸正極)、南(S,Y軸負(fù)極)、西(W,X軸負(fù)極)、北(N,Y軸正極)4個(gè)入水點(diǎn)。自動(dòng)記錄裝置包括攝像頭、攝像儀和電腦組成，攝像儀與電腦相連。電腦Morris水迷宮自動(dòng)分析軟件，對(duì)動(dòng)物游泳軌跡進(jìn)行自動(dòng)分析，分析結(jié)果包括小鼠游泳軌跡圖，各象限游泳時(shí)間及距離，20%邊緣區(qū)、40%邊緣區(qū)和中心區(qū)域游泳路徑占全部路徑比，第一次找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)等。定位航行測(cè)試測(cè)試前，讓少鼠自由游泳一天，上下午各一次，每次2min。測(cè)試時(shí)平臺(tái)放在第一象限，小鼠分別從東、南、西、北(E、S、W、N)四個(gè)象限面對(duì)池壁放入水池，小鼠找到平臺(tái)后在平臺(tái)保持30s后，在行下一個(gè)入水點(diǎn)測(cè)試，超過60s未找到的按60s計(jì)算，取逃避潛伏期時(shí)間作統(tǒng)計(jì)。每天上下午各測(cè)試一單元(block),連續(xù)4天，共8個(gè)block。空間探索測(cè)試第8次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，使小鼠在無平臺(tái)情況下尋找記憶中的平臺(tái)，游泳60s,取穿過平臺(tái)的次數(shù)和平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比作統(tǒng)計(jì)，無記憶障礙的老鼠穿過平臺(tái)次數(shù)較多，平臺(tái)象限的游泳時(shí)間百分比高。整個(gè)測(cè)試過程中，水池周圍的參照物(包括實(shí)驗(yàn)者所站位置)不變，實(shí)驗(yàn)在安靜環(huán)境中完成。1.5夾心法ELISA才企測(cè)^元原凈爭(zhēng)異'l"生(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)y干擾素(IFN-力和白細(xì)素介素-4(IL-4)的合成將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液加入96孔聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)4反，每孔100pL，含2乂105個(gè)細(xì)胞。力。4xAB。和Afi42(先用雙蒸水溶解，再與RPMI1640培養(yǎng)基混勻)，4xA13i5和AB42終濃度都是10)ig/ml。37°C,5%C02,培養(yǎng)72h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸取上清，-20。C凍存。將1:250的包被抗體加入96孔聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板，每孔100iliL，4。C過夜。去掉液體，PBST(phosphatebuffersalinetween，吐溫磷酸鹽緩沖液)洗滌3次，每次5min。1%的BSA隱PBS(0.01MPBS配制,含0.3%TritonX-100,含1%牛血清白蛋白BSA)封閉，每孔200pL,室溫孵育1h。去掉液體，PBST洗滌3次，每次5min。加倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，每孔100|iL，室溫孵育5h。去掉液體，PBST洗滌5次，每次5min。力。1:250的生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，每孔100^L,室溫孵育1h。去掉液體，PBST洗滌5次，每次5min。加1:250的HRP-抗生物素抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素抗體)，每孔100|xL，室溫孵育30min。去掉液體，PBST洗滌7次，每次5min。加底物液3，3,5，5-四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),每孔100|iL，室溫孵育15min。加終止液，每孑L50|liL。于波長(zhǎng)450nm下測(cè)定每孔爿值，以P/N=2.1為陽性，在20min內(nèi)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。各組樣本分別加4><AJ315和A154。。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。陽性對(duì)照加入輔酶A(ConA)，每孔50^L,含ConA5|tig/ml。陰性對(duì)照只加培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。為避免BSA中含有的IFN-y和IL-4對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)用不含BSA的RPMI1640培養(yǎng)液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣本中的IFN-y和IL-4的含量。1.6老年斑的才企測(cè)和定量分析腦組織取材，4%多聚甲醛固定的全腦用于老年斑的4企測(cè)和定量分析。腦組織脫水、包埋，腦組織切片厚8pm，表于經(jīng)黏附劑處理的載玻片上。采用免疫組織化學(xué)染色方法，曱醇(含3%11202)反應(yīng)20min,0.01M磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.4)洗滌5minx3次，70%曱酸滴注于切片后靜置5min,0.01MPBS洗滌5minx3次，1%BSA,37。C封閉30min,加抗AB42單克隆抗體(1:2000),37°C2h,再轉(zhuǎn)至4。C過夜，0.01MPBS洗滌5minx3次，加過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1:200),37。C孵育2h;0.01MPBS洗滌5minx3次，0.05%DAB(3,3，-diaminobenzidine，二氨基聯(lián)苯胺)(含0.03%H202)顯色5-10min，顯微鏡下見老年斑著色后，0.01MPBS洗滌終止液終止反應(yīng)。脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。選背側(cè)海馬部位，每間隔40iLim取一張腦片，每只小鼠腦取6張腦片用于定量分析。分析的部位是整個(gè)海馬及其上方頂葉聯(lián)合皮質(zhì)的老年斑。使用Leica顯微鏡及配套的軟件系統(tǒng)和JVCky-F30B3-CCD彩色圖像掇錄系統(tǒng)對(duì)老年斑面積進(jìn)行定量分析，計(jì)算頂葉聯(lián)合皮質(zhì)和海馬部位淀粉樣斑塊面積占皮質(zhì)和海馬面積的百分比。每只小鼠腦6張切片的結(jié)果平均后作為一只小鼠頂葉聯(lián)合皮質(zhì)和海馬部位的淀粉樣斑塊面積百分比計(jì)算。2結(jié)果2.1—般情況第一次采血(第2次接種后2周)實(shí)驗(yàn)組有抗Afi42抗體的產(chǎn)生，但各組產(chǎn)生抗體的量不同。隨著接種次數(shù)的增多，各實(shí)驗(yàn)組抗體的滴度都在增高。各組鼠血清抗體的平均滴度顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，PO.Ol。實(shí)驗(yàn)期間，各組Tg2576小鼠外觀正常；飲食無明顯變化；毛發(fā)無脫落；精神狀態(tài)好；意識(shí)清醒；四肢運(yùn)動(dòng)正常；免疫部位未見明顯炎癥反應(yīng)。腦、肝和腎HE染色顯示腦皮質(zhì)細(xì)胞清晰，層次分明細(xì)胞構(gòu)筑無異常；肝細(xì)胞形態(tài)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；Perls染色呈陰性反應(yīng)，表明疫苗接種沒有引起Tg2576小鼠腦出血。2.2疫苗接種后免疫應(yīng)答的分型(抗原特異性IFN-y和IL-4的合成)ConA作為陽性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照，4xA1^5作為特異性抗原刺激，應(yīng)用eBioscienceMouseThl/Th2ELISARead-SET-GO試劑盒檢測(cè)上清中的IFN-y和IL-4。用4xA1^5刺激脾細(xì)胞3天后收集產(chǎn)生的上清液中，IL-4的含量高于IFN-y;與PBS組比較，有顯著性差異(尸<0.01)，結(jié)果見表1。表明重組4xA1^5蛋白疫苗免疫轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)了以Th2型為主的免疫反應(yīng)。表1經(jīng)不同抗原刺激后Tg2576小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與PBS組相比，尸<0.01。2.3Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果取每個(gè)block的三組小鼠的逃避潛伏期均值，可見隨著小鼠學(xué)習(xí)次數(shù)的增加，各組的逃避潛伏期均逐漸縮短。每個(gè)block的逃避潛伏期，與PBS組相比，4xA1^5組差異均有顯著性(尸O.Ol)。平臺(tái)撤離后的穿環(huán)實(shí)驗(yàn)，以穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限泳距百分比和20%邊緣區(qū)泳距百分比來判斷動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。PBS組、4xA13!5組小鼠穿過平臺(tái)次數(shù)分別為1.17±0.89次和5.33±1.50次；4xA1315組較PBS組次數(shù)增多，差異有顯著性(尸O.01);而平臺(tái)象限游泳距離百分比分別為22.48±3.56y。和51.61土5.75。/。，4xA1^5組較PBS組有明顯增高，差異有顯著性(P0.01);20%邊緣區(qū)泳距百分比分別為44.8±5.25%和13.8±5.02%,4xAi^組較PBS組明顯下降，差異有顯著性(尸O.Ol)。結(jié)果見表2。表2各組小鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.4老年斑的檢測(cè)和定量分析疫苗接種6個(gè)月后，18月齡的4xAB,5組和PBS組鼠老年斑染色均可見淀粉樣斑塊，致密斑、彌散斑都存在，致密斑結(jié)構(gòu)致密，邊界清晰，多呈圓形，斑塊的中心有一較為致密的核。有的在斑塊的中心卻呈現(xiàn)一不規(guī)則的淡染區(qū)。主要分布在胼胝體壓部后方和枕葉的皮質(zhì)、頂葉和額葉的皮質(zhì)以及海馬，白質(zhì)及其它區(qū)域無斑塊沉積發(fā)生。圖像分析定量結(jié)果顯示PBS組18月齡的Tg2576鼠淀粉樣斑塊面積占腦片面積平均為4.28±2.41%。而4xAB15組淀粉樣沉積斑塊明顯減少，而且面積較小，平均斑塊面積占相應(yīng)面積的2.27±0.66%，與PBS組相比差異有顯著性(尸O.OOl)。結(jié)果表明通過免疫Tg2576小鼠顯示，原核表達(dá)制備的4xAl^蛋白疫苗可以誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生，引起以Th2型為主的免疫應(yīng)答。重組4xAB^蛋白疫苗可以阻止Tg2576鼠的認(rèn)知功能的下降，改善其學(xué)習(xí)和記憶功能。疫苗接種組和對(duì)照組相比，其老年斑的數(shù)量明顯減少。因此，本發(fā)明制備的重組四價(jià)A13w5蛋白疫苗將在AD的治療中將具有廣闊的前景。權(quán)利要求1、一種老年性癡呆重組蛋白疫苗，為重組多價(jià)Aβ1-15蛋白疫苗，所述Aβ1-15氨基酸序列為Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-GlnAβ1-15氨基酸序列間采用柔性連接肽連接形成多價(jià)Aβ1-15。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種老年性癡呆重組蛋白疫苗，其特征在于所說的柔性連接肽的序列為Gly-Gly或Gly-Ser-Ser-Gly。3、根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的一種老年性癡呆重組蛋白疫苗，其特征在于所說的A15w5氨基酸序列為四價(jià)，即4xA13w5。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種老年性癡呆重組蛋白疫苗，其特征在于蛋白疫苗中以MF59為佐劑。5、如權(quán)利要求1所述的一種老年性癡呆重組蛋白疫苗的制備方法，包括如下步驟包括以下步驟(1)合成多條寡核苷酸引物，通過基因擴(kuò)增得到的兩個(gè)或兩個(gè)以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)ABw5基因片斷；Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G/y-G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg畫His-Asp誦Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln隱G7;;H-G/j;(2x線w)和G/_yH-G(y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G/;;-G/,Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(2xAfi15-2);(2)將兩個(gè)或以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)Afiw5基因片斷依次克隆入pQE-30原核表達(dá)質(zhì)粒中，制備重組質(zhì)粒pQE-4xAJ315;(3)將重組質(zhì)粒pQE-4xA1^5分別轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌M15[pREP4],IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4xAJ^重組蛋白；(4)將表達(dá)的4xAl^重組蛋白經(jīng)his-tagNi^親和純化樹脂純化后，透析獲得高純度的4xAfi15重組蛋白；(5)將高純度的4xAJ315重組蛋白與佐劑等體積充分乳化混合后制備成4xA仏5重組蛋白疫苗。全文摘要一種老年性癡呆重組多價(jià)β-淀粉樣蛋白1-15(Aβ_1-15)蛋白疫苗及其制備方法，采取以下方案合成多條寡核苷酸引物，通過基因擴(kuò)增得到的兩個(gè)或以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)Aβ_1-15基因片斷克隆入pQE-30原核表達(dá)質(zhì)粒中，經(jīng)細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)、純化，制備出能表達(dá)柔性可折疊的多價(jià)Aβ_1-15的重組蛋白疫苗。本發(fā)明選擇多價(jià)可折疊的Aβ_1-15為免疫原，避免了多拷貝AβB細(xì)胞抗原表位的空間僵化結(jié)構(gòu)，還使Aβ₁₅表位更容易暴露，增強(qiáng)了免疫原性。同時(shí)也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。選擇原核表達(dá)系統(tǒng)來制備重組蛋白，避免了化學(xué)合成的高難度及高成本的缺點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N15/12GK101318015SQ20081002900公開日2008年12月10日申請(qǐng)日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者姚志彬申請(qǐng)人:中山大學(xué)