專利名稱：：發酵多殺菌素產生菌的培養基的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物農藥生產
技術領域：
，具體涉及一種發酵多殺菌素產生菌的培養基。
背景技術：
：多殺菌素(Spinosad)是1982年美國禮萊公司科研人員從維爾京群島土壤中分離的刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)發酵液中提取得到的一種新穎的大環內酯類超高效生物源殺蟲劑。由美國陶氏農業科學公司生產，于1999年在我國注冊商品名為催殺(Tracer48%懸浮液)和菜喜(Success2.5%懸浮液)，分別應用于小菜蛾和棉鈴蟲等的防治。其有效成份為SpinosynA和D，其中A和D比例分別為85%和15%。多殺菌素主要應用于對棉鈴蟲、煙青蟲、小菜蛾、果蠅、甜菜夜蛾、薊馬等的防治，適用于棉花、茶、蔬菜和蘋果、梨、桃等落葉果樹。到1999年多殺菌素已經在24個國家、100多種作物上進行了注冊登記。由于多殺菌素的毒性低，陽光下易分解，使用懸浮液不同pH對其活力不受影響，經美國環保局(EnviromentalProtectionAgency)測定該藥劑不滯留于環境中，為低毒、高效的生物殺蟲劑。多殺菌素因其具有降解完全，對害蟲高效，對哺乳動物、鳥類、魚類甚至大多數益蟲具有寬廣的安全界限等優點而獲得美國"總統綠色化學品挑戰獎"。多殺菌素的一個重要特點是其選擇毒性比遠高于其他常用農藥，比阿維菌素大300-400倍。美國專利US5362634公開了一種多殺菌素產生菌發酵用培養基，其中供試菌株為Sacc/mrapo/ywora^/wosa7WiZ/<§395，所述發酵培養基的酉己方及含量為葡萄糖4%、植物蛋白(部分酶水解)1.5-3%、棉籽粉1.0%、CaC030.3%、大豆油1.0%、加自來水至l升。該培養基的發酵單位為59.3mg/L。鑒于此發酵配方的發酵單位偏低，因此不利于產業化。國內對多殺菌素的研究尚處于試驗階段。與其它農抗產生菌一樣，環境條件是影響多殺菌素產生菌的產素水平的一個重要因素，因此研究一種高效、價格低廉的發酵培養基是解決多殺菌素產業化問題的一個技術關鍵。在現有的技術中，多殺菌素的發酵培養基效果不佳，發酵單位偏低，不能滿足產業化的需要，并且存在原料成本較高和來源有限等問題，并在發酵過程中無法有效控制消除泡沫，發酵液中常含有沒有被利用完全的多糖從而導致發酵液粘稠不利用后續提取步驟的進行。因此解決以上問題成為多殺菌素產業化過程中必須面對的問題。
發明內容本發明所要解決的技術問題是通過培養基優化實驗，提供一種有利于產生多殺菌素(發酵單位提高)的發酵培養基。利用本發明的發酵培養基，可使多殺菌素產生菌在原有發酵水平基礎上最高提高19倍，有利于國內多殺菌素的產業化。本發明中，％比為重量百分比；術語"速效碳源"指葡萄糖、果糖、甘露醇。術語"遲效碳源"指蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、糊精、可溶性淀粉。本發明提供一種以&ccAflrapofy印ora印z'"o^ziV"i^i:M395為菌種，發酵多殺菌素產生菌的培養基，其組分及含量為碳源5.09.0%、氮源3.06.0%、植物油0.22.5%、氨基酸0.10.5%、CaC030.11.00/o和水81.091.6%。其中，所述的碳源可以選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精、可溶性淀粉或其組合；優選為葡萄糖，其含量優選為8.0%。所述的氮源可以選自全脂奶粉、魚粉蛋白胨、花生粕粉、玉米漿、棉籽粉、花生餅粉或其組合；優選為棉籽粉和魚粉蛋白胨，且所述棉籽粉:魚粉蛋白胨的重量比為24:02，優選為3:2。所述的植物油可以選自大豆油、棉籽游、玉米油、葵花油或其組合；優選為葵花油，其含量優選為2.0%。所述氨基酸可以選自谷氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸或其組合；優選為賴氨酸，其含量優選為0.1%。所述水可以選自自來水或蒸餾水，優選為自來水。本發明最優選的培養基的組分及含量為葡萄糖8.0%、棉籽粉3.0%、魚粉蛋白胨2.0%、葵花油2.0%、賴氨酸0.1%、0&0)30.5%、和自來水100ml。上述最優選配方的培養基的發酵單位最高可達1150mg/L，是原有發酵水平的19倍。本發明培養基配方中，所用的氮源配方簡單，來源豐富；所用碳源中不含多殺菌素產生菌不容易利用的遲效碳源，這樣就使得發酵液離心后上清液保持澄清，有利于后續提取步驟的進行；另外，此配方中所用植物油含量增加至2.0%，不僅使發酵單位有了提高，而且對于發酵過程中利用泡敵會嚴重抑制多殺菌素產生的情況來說更有利發酵過程當中泡沫的消除。具體實施例方式實施例l:本發明培養基最佳配方的確定1):單一碳源類型的確定實驗方法以基礎發酵培養基配方為對照，氮源成分及加量不變，分別加入葡萄糖、淀粉、可溶性淀粉、糊精、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇等多碳源進行單一因素碳源實驗，每種碳源加量相當，均為6%。搖瓶發酵8天，進行HPLC效價測定。碳源種類葡萄蔗糖麥芽果糖甘露乳糖淀粉糊精可溶糖糖醇性淀粉相對效價(%)1.000.280.240.800.210.400.240.370.232):碳源組合實驗根據上述結果進行選擇葡萄糖作為速效碳源，與其他遲效碳源進行組合實驗。搖瓶發酵8天，進行HPLC效價測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3):葡萄糖加量實驗在基礎培養基其他成分不變的情況下，將葡萄糖作為唯一碳源，分別添加不同量進行實驗，搖瓶發酵8天，進行HPLC效價測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由上述結果表明，遲效碳源對多殺菌素生產效果不明顯，因此本實驗只選用了葡萄糖作為多殺菌素產生菌的唯一碳源，加量為8%。4):單一氮源實驗方法以基礎發酵培養基配方為對照，碳源成分及加量不變，分別加入奶粉、魚粉蛋白胨、花生粕粉、玉米漿、棉籽粉、花生餅粉進行單一因素氮源實驗，每種氮源加量相當，均為3.4%。搖瓶發酵8天，進行HPLC效價測定。氮源種類全脂魚粉花生玉米棉籽花生奶粉蛋白粕粉漿粉胨餅粉相對效價1.000.580.400.210.800.245):氮源組合正交實驗方法根據實驗l-3結果，確定葡萄糖作為唯一碳源，保持加量為8%不變。根據實驗4中單一氮源實驗結果選取全脂奶粉、棉籽粉、魚粉蛋白胨進行三水平三因子實驗。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由以上實驗得出氮源含量及配比為棉籽粉:魚粉蛋白胨=3:2為最佳.6):前體植物油添加實驗油脂在發酵過程中常常能被菌體利用，菌體具有活躍的脂肪酶，把油脂水解成脂肪酸和甘油，二者通過代謝為菌體提供碳源和能源。多殺菌素為新型的大環內酯類化合物，生物合成也是通過聚酮合成途徑，因此，從另一個角度來說，油脂水解并且通過代謝后生成的短鏈脂肪酸，也為多殺菌素的合成提供了前體。除此之外，在發酵過程中添加油脂還能代替泡敵起到消除泡沬的作用，尤其對于多殺菌素的合成會受到泡敵嚴重抑制的情況來說，油的添加意義重大。由以上實驗確定碳氮源類型及加量后，進行前體油添加實驗油類型大豆油棉籽油玉米油葵花油相對效價(％)325195100由此確定葵花油效果最好。在此基礎上進行葵花油加量實驗。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>7):前體氨基酸類型實驗多殺菌素為新型的大環內酯類化合物，生物合成也是通過聚酮合成途徑，而支鏈氨基酸經過代謝后產生短鏈脂肪酸，可以促進多殺菌素的聚酮合成。因此本實驗選用了幾種支鏈氨基酸來做為前體。并且蛋氨酸也可為多殺菌素的合成提供必要的甲基，來促進產物的合成。在前期實驗基礎上確定碳、氮源、油類型及添加量，并作為對照，然后進行氨基酸添加實驗，每種氨基酸添加量為1%。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>8):水類型實驗在確定培養基中各營養成分后，進行水類型實驗.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2利用多殺菌素產生菌SaccAwo;o(y印ora印&om發酵，發酵培養基按照下表所列數據(重量百分比)進行配置葡萄糖5.0、棉籽粉2.0、魚粉蛋白胨1.0、葵花油2.0、賴氨酸0.2、CaC030.3和白來7jC89.5。12rC滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于28。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵8天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為536mg/L。實施例3利用多殺菌素產生菌^cc/mTO;o/j^7ora發酵，發酵培養基按照下表所列數據(重量百分比)進行配置葡萄糖8.0、棉籽粉3.0、魚粉蛋白胨2.0、葵花油2.0、賴氨酸0.1、CaC030.5和自來水84.4.12rC滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于28。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵IO天后，取發酵液2ml,離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為1150mg/L。實施例4利用多殺菌素產生菌^2Cc/mro;7o/3^ora印&om發酵，發酵培養基按照下表所列數據(重量百分比)進行配置葡萄糖6.0、棉籽粉4.0、魚粉蛋白胨1.0、葵花油0.2、賴氨酸0.1、CaC030.4和自來7K88.3。121。C滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml,置于28。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵IO天后，取發酵液2ml,離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為807mg/L。實施例5葡萄糖7.0、棉籽粉4.0、魚粉蛋白胨2.0、葵花油2.5、賴氨酸0.1、CaC030.2和自來7乂84.2。121。C滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于25。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵10天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為733mg/L。實施例6葡萄糖9.0、棉籽粉3.5、魚粉蛋白胨2.0、葵花油1.0、賴氨酸0.3、CaC031.0禾口自來7jC83.2。12rC滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于25。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵IO天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為952mg/L。實施例7葡萄糖8.0、棉籽粉2.0、魚粉蛋白胨2.0、葵花油0.5、賴氨酸0.5、CaCO30.7和自來7JC86.3。12rC滅菌30min。接種量15%，裝量80ml/750ml，置于25。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵IO天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為625mg/L。實施例8葡萄糖6.0、棉籽粉2.5、魚粉蛋白胨1.5、葵花油1.5、賴氨酸0.3、CaC030.6和自來水87.6。12rC滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于25。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵8天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為668mg/L。實施例9葡萄糖5.0、棉籽粉2.5、魚粉蛋白胨0.5、葵花油1.0、賴氨酸0.1、CaC030.6和自來水90.3。12rC滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于25。C恒溫室中旋轉式搖床220rpm搖瓶發酵8天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為421mg/L。實施例10葡萄糖7.0、棉籽粉3.0、魚粉蛋白胨0.5、葵花油1.7、賴氨酸0.4、CaC030.6和自來水86.8。12rC滅菌30min。接種量20%，裝量40ml/750ml，置于28。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵8天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為689mg/L。、實施例11葡萄糖7.0、棉籽粉4.5、魚粉蛋白胨1.5、葵花油2.5、賴氨酸0.1、CaC031.0禾口自來7夂83.4。121。C滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于28。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵8天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為413mg/L。12實施例12葡萄糖6.0、棉籽粉4.0、葵花油2.0、賴氨酸O.l、CaCO30.5和自來7乂87.4。121"滅菌30min。接種量10%，裝量100ml/750ml，置于28。C恒溫室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵8天后，取發酵液2ml，離心取菌絲體，用6ml的丙酮浸泡過夜，再離心取上清進行HPLC效價測定，發酵單位為356mg/L。附表主要試劑_~~試劑名稱生產廠家葡萄糖食用級新昌制藥廠蔗糖食用級可溶性淀粉化學純上海化學試劑公司小麥淀粉食用級酵母浸出粉BR英國Oxiod公司花生粕粉HS7660北京康明威公司花生餅粉DB3-6460北京康明威公司棉籽蛋白MZ9220北京康明威公司玉米油食用級上海融氏企業有限公司豆油食用級上海良友海獅油脂實業有限公司魚粉蛋白胨上海源聚生生物科技有限公司葵花油食用級上海良友海獅油脂實業有限公司乳糖AR上海源聚生生物科技有限公司果糖AR上海源聚生生物科技有限公司麥芽糖AR魚粉蛋白胨AR賴氨酸分析純纈氨酸分析純蛋氨酸分析純碳酸鈣分析純上海源聚生生物科技有限公司上海中洋海洋生物工程股份有限公司上海源聚生生物科技有限公司上海源聚生生物科技有限公司上海源聚生生物科技有限公司上海泗聯化工廠有限公司主要儀器儀器電平低溫離心機高效液相色譜儀型號JA2003J6畫M11100產地上海天平儀器廠BECKMAN美國安捷倫公司1權利要求1.一種以SaccharopolysporaspinosaNRRL18395為菌種，發酵多殺菌素產生菌的培養基，其組分及含量為碳源5.0～9.0％氮源3.0～6.0％植物油0.2～2.5％氨基酸0.1～0.5％CaCO30.1～1.0％水81.0～91.6％。2.根據權利要求1所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精、可溶性淀粉或其組合。3.根據權利要求2所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述碳源為葡萄糖。4.根據權利要求3所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述葡萄糖的含量為8.0%。5.根據權利要求1所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述氮源為全脂奶粉、魚粉蛋白胨、花生粕粉、玉米漿、棉籽粉、花生餅粉或其組合。6.根據權利要求5所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述氮源為棉籽粉和/或魚粉蛋白胨。7.根據權利要求6所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述棉籽粉:魚粉蛋白胨的重量比為24:02。8.根據權利要求7所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述棉籽粉:魚粉蛋白胨的重量比為3:2。9.根據權利要求1所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述植物油為大豆油、棉籽游、玉米油、葵花油或其組合。10.根據權利要求9所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述植物油為葵花油。11.根據權利要求10所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述葵花油的含量為2.0%。12.根據權利要求1所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述氨基酸為谷氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸或其組合。13.根據權利要求12所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述氨基酸為賴氨酸。14.根據權利要求13所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述賴氨酸的含量為0.1%。15.根據權利要求1所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述水為自來水或蒸餾水。16.根據權利要求15所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，所述水為自來水。17.根據權利要求1至16任一所述的發酵多殺菌素產生菌的培養基，其特征在于，該培養基的組分及含量為葡萄糖8.0%、棉籽粉3.0%、魚粉蛋白胨2.0%、葵花油2.0%、賴氨酸0.1%、CaCO30.5%、和自來水100ml。全文摘要本發明提供一種以SaccharopolysporaspinosaNRRL18395為菌種，發酵多殺菌素產生菌的培養基，其組分及含量為碳源5.0～9.0％、氮源3.0～7.0％、植物油0.2～2.5％、氨基酸0.1～0.5％、CaCO₃0.1～1.0％和水81.0～91.6％。利用本發明的發酵培養基，可使多殺菌素產生菌在原有發酵水平基礎上最高提高19倍，有利于國內多殺菌素的產業化。文檔編號C12N1/20GK101560477SQ20081003612公開日2009年10月21日申請日期2008年4月16日優先權日2008年4月16日發明者李繼安,韓麗敏申請人:上海醫藥工業研究院