一種多殺菌素的發酵方法
【專利摘要】本發明公開了一種多殺菌素的發酵方法，包括如下步驟：（1）將能提高多殺菌素產量的基因工程菌LU104經斜面培養、種子培養，得到種子液；（2）將種子液接種到發酵培養基中，發酵；在發酵0-12h時添加硬脂酸，在40-56h時添加異丁醇，在90-105h時添加甘氨酸，丙氨酸和纈氨酸，共發酵192-216h。本發明的方法可使多殺菌素產量最高達到531.7mg/L。另外，這種培養方法所添加的物質成分單一，針對性更強，對于研究多殺菌素發酵過程的調控過程具有一定的指導意義。
【專利說明】一種多殺菌素的發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多殺菌素的發酵方法，屬于微生物發酵領域。
【背景技術】
[0002]多殺菌素是由刺糖多孢菌生產的一種大環內酯類農用抗生素，兼具出色的殺蟲效果和環保特性。作為一種廣譜的生物農藥，多殺菌素對昆蟲的毒害有高度的選擇性，其對非靶標生物基本無毒或低毒，對哺乳動物無致癌、致畸、致突變或神經毒性。目前，制約多殺菌素實現產業化和廣泛推廣應用的主要問題在于生產成本高，發酵工藝復雜，發酵效能低。培養基優化和菌株改造是目前國內多殺菌素研究的重點，李能威等通過單因素、多因素試驗和2次正交試驗獲得最優發酵培養基，使多殺菌素產量達395.4mg/L，較對照提高62.5%。梁艷等通過紫外線誘變篩選得到一株具有鼠李糖和丙酸鈉抗性的突變株，添加前體正丙醇后產量達到125.3mg/L,比初始菌株提高了 285.5% ;但繼續提高產量效果都不明顯。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種多殺菌素的發酵方法。
[0004]本發明的技術方案概述如下:
[0005]一種多殺菌素的發酵方法，包括如下步驟:
[0006](I)將能提高多殺菌素產量的基因工程菌LU104經斜面培養、種子培養，得到種子液；
[0007](2)將種子液以接種量10% - 15%的比例接種到發酵培養基中，于30°C、200 - 250rpm發酵；在發酵O - 12h時添加硬脂酸，使濃度為1.0 - 2g/L，在40 - 56h時添加異丁醇，使濃度為1.8 - 2.5g/L，在90 - 105h時添加甘氨酸使濃度為0.3 - lg/L，添加丙氨酸使濃度為0.2 - 0.8g/L和添加纈氨酸使濃度為0.1 - 0.5g/L，共發酵192 - 216h。
[0008]發酵培養基組份按g/L計:葡萄糖50-70、麥芽糖10-20、棉籽蛋白20_30、豆粉10-15、酵母膏 10-25，K2HPO40.5-2，NaCl0.5-2，MgS042_3，CaC035_7，余量為水，ρΗ=7.2-8.0。
[0009]步驟(2)優選為:將種子液以接種量10%的比例接種到發酵培養基中，于30°C、220rpm發酵；在發酵Oh時添加硬脂酸，使濃度為1.0g/L,在48h時添加異丁醇，使濃度為
2.2g/L，在96h時添加甘氨酸使濃度為0.5g/L，添加丙氨酸使濃度為0.5g/L和添加纈氨酸使濃度為0.25g/L，共發酵192h。
[0010]本發明的方法可使多殺菌素產量最高達到531.7mg/L。另外，這種培養方法所添加的物質成分單一，針對性更強，對于研究多殺菌素發酵過程的調控過程具有一定的指導意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為重組質粒構建過程圖。
[0012]圖2是重組質粒pLUlOl的質粒圖譜。[0013]圖3是重組質粒pLU102的質粒圖譜。
[0014]圖4是重組質粒pLU104的質粒圖譜。
[0015]圖5是多殺菌素野生菌株與多殺菌素基因工程菌發酵結果。
[0016]圖6是重組質粒pLUlOl驗證電泳圖。
[0017]圖7是重組質粒pLU102驗證電泳圖。
[0018]圖8是重組質粒pLU104驗證電泳圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明作進一步說明。但本發明的保護范圍不能認為僅局限于下述【具體實施方式】，在不脫離本發明基本構思的前提下，所屬領域的技術人員據此作出的簡單推演或同等替換方案，均屬于本發明的保護范圍。
[0020]各實施例的斜面培養基組分按g/L計為酪蛋白胨2.5，葡萄糖5，牛肉膏3，瓊脂20，硫酸鎂2，余量為水，pH=7.5，115°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0021]種子培養基(g/L):葡萄糖10，N-Z-Amine A (酸水解酪蛋白)30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0，MgS042.0，余量為水，滅菌前pH=7.3。
[0022]實施例1
[0023]1.基因元件克隆和含有對應基因原件的質粒構建
[0024]將包含ermE*啟動子(SEQ ID N0.23)的pIB139質粒用HindIII和XbaI酶切消化，所用酶為Fermentas Fast Taq限制性內切酶,酶切體系如下:目的DNA片段30ng,加入2 μ LlOXbuffer，限制性內切酶Hin`dIII和XbaI各I μ L(內切酶最后加入)，補充蒸餾水至20 μ L0將酶切體系置于37°C 30min，得到0.3kb的包含ermE*啟動子的HindIII/Xbal片段。將該HindIII/Xbal片段插入質粒p0J260，得到p0J261質粒。
[0025]用引物對spnK-F-Ndel (SEQ ID N0.1)和 spnK-R-Xbal (SEQ ID N0.2)從刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460 (以下簡稱刺糖多胞菌 ATCC49460)染色體中獲取spnK基因序列并擴增，再用Ndel和Xbal酶切消化spnK的PCR產物。隨后將處理過的片段插入到同樣被Ndel和Xbal酶切消化的p0J261質粒中，得到重組pLUlOl質粒，質粒驗證見圖6。
[0026]本發明所用per酶為北京全式金生物技術有限公司的pfu聚合酶，PCR擴增體系如下:依照下述在冰上配制PCR反應體系，先加水，最后加pfu聚合酶；
[0027]
DNI 模機1.P L
Forward primer(10 P i)4 P L
Reverse primer(10 μ Μ)4P L
d^TP(2.ami)5 P 1.10 X Buffer10 μ L
Pfu 聚介_I μ L
dcIH2025 μ L
總體積SOpL[0028]在PCR儀上設置擴增程序。擴增條件為98°C預變性2分鐘(I個循環)；98°C變性10秒、退火10秒、72°C延伸I分鐘(32個循環)；72°C延伸8分鐘(I個循環)。
[0029]本發明中涉及到的寡核苷酸引物列于表1。
[0030]表1引物序列
[0031]
【權利要求】
1.一種多殺菌素的發酵方法，其特征是包括如下步驟: (1)將能提高多殺菌素產量的基因工程菌LU104經斜面培養、種子培養，得到種子液； (2)將種子液以接種量10%- 15%的比例接種到發酵培養基中，于300C>200 - 250rpm發酵；在發酵O - 12h時添加硬脂酸，使濃度為1.0 - 2g/L，在40 - 56h時添加異丁醇，使濃度為1.8 - 2.5g/L，在90 - 105h時添加甘氨酸使濃度為0.3 - lg/L，添加丙氨酸使濃度為0.2 - 0.8g/L和添加纈氨酸使濃度為0.1 - 0.5g/L，共發酵192 - 216h。
2.根據權利要求1所述的一種多殺菌素的發酵方法，其特征是所述發酵培養基組份按g/L計:葡萄糖50-70、麥芽糖10-20、棉籽蛋白20-30、豆粉10-15、酵母膏10-25，K2HPO40.5-2，NaCl0.5-2, MgS042_3，CaC035_7，余量為水，pH=7.2-8.0。
3.根據權利要求1所述的一種多殺菌素的發酵方法，其特征是所述步驟(2)為:將種子液以接種量10%的比例接種到發酵培養基中，于30°C、220rpm發酵；在發酵Oh時添加硬脂酸，使濃度為1.0g/L,在48h時添加異丁醇，使濃度為2.2g/L，在96h時添加甘氨酸使濃度為0.5g/L，添加丙氨酸使濃度為0.5g/L和添加纈氨酸使濃度為0.25g/L，共發酵192h。
【文檔編號】C12R1/01GK103725733SQ201310756416
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】盧文玉, 王美玲, 趙方龍, 尹靜 申請人:天津大學