專利名稱：一種新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白的高效表達和復性的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，具體地說是涉及新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12 肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表達和透析復性方法。
背景技術：
本發明中的復性對象水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA),是通過一個(Gly)3柔 性肽基團首次將重組水蛭素HV3的C末端12肽與rPA基因融合而成的全新蛋白。溶栓藥物瑞替普酶(ret印lase，r-PA)是人組織纖溶酶原激活劑(t-PA)的缺失變異體，它 是在t-PA分子原結構的基礎上,刪除了其中的kringle I、 Finger、 EGF 3個結構域的單鏈 非糖基化蛋白，分子量為39 kDa，含有9對二硫鍵，為第三代溶栓藥物。r-PA起效快，藥效 強，出血等副作用小。水蛭素是迄今作用最強的特異性凝血酶抑制劑，具有很強的抗凝、抗 栓活性，其抗血栓性能優于肝素，對多種血栓疾病具有預防和治療效果。目前研究已確認， 水蛭素從IO肽開始具有抗凝活性，以12肽為具有最大活性的最小肽段。水蛭素12肽其較小 的分子量相對于水蛭素全長蛋白來說更有利于減小抗原性的副作用和影響。由這兩者融合而成的新型抗凝溶栓雙功能蛋白，具有更長的作用半衰期，方便患者使用， 且能有更高選擇性地作用于血栓部位、和全身出血性副作用小等特點，作用更為肯定可靠， 而其較小的分子量更有利于減小抗原性的副作用和影響。它可以在大腸桿菌中進行表達.但在 本發明的優化之前，該融合蛋白在大腸桿菌中表達水平很低，約占全菌總蛋白的12%。經過 本發明的優化后，其表達量提高到約29%。本發明的關鍵是在培養基中添加了鈣、鎂兩種微 量元素并且通過搖床轉速來控制通風量。事實證明，這兩個因素對提高表達量具有顯著的影 響。大腸桿菌表達體系高效、經濟，可用高密度發酵工藝進行大規模培養，因而降低了成本. 但是由于融合蛋白的r-PA分子中18個Cys要形成9對二硫鍵，所以大腸桿菌表達r-PA時， 因發生二硫鍵的錯配而形成致密的包涵體，溶解變性后要使其重寫正確折疊和復性成活性狀 態非常困難，這是由于組成九對二硫鍵的18個Cys在復性時錯誤配對造成的。蛋白質復性技術是基因工程蛋白產生的重大共性關鍵技術，直接關系到生產成本和技術 能否產業化，所以，研究基因工程蛋白的復性技術不但在理論上有重大意義而且也有重大的應 用價值。蛋白的體外復性被認為是一項異常艱巨的任務，目前已存在的復性方法是很多的， 較常見的除了稀釋復性以外，還有透析復性、柱上復性……但普遍復性率不高，只有20%左 右的目的蛋白分子(汪家政等，蛋白質技術手冊，科學出版社，2001年，p31)得到正確的 空間構型，獲得生物學活性。并且，變性蛋白的體外復性受外部環境的影響較大，不同蛋白 的復性過程不同，特異的復性環境,包括緩沖液的組成、蛋白濃度、溫度、pH等應根據蛋白 的不同而異。沒有哪種復性方法可以通用于所有的蛋白。近來，有人轉向于體內蛋白質折疊 的模擬，產生了一些新的方法，例如將小分子伴侶固定化后，相當于親和層析的原理，復性 蛋白質的同時使其濃縮和純化。有很大的應用前景，但是，由于這些分子伴侶均需要特別制備技術，對于大規模多種蛋白質制備，仍屬昂貴試劑。所以，要將實驗室的研究成果產業化， 獲取實際的生產成果，就不得不考慮生產成本以及操作難易程度這兩個問題。因此，制約基 因藥物生產的一個關鍵性難題就是復性效率、復性成本以及生產操作難易的問題。水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)含有九對二硫鍵，無疑為其復性增加了更 大的難度，其復性問題是下游工作的一個很大的考驗。目前，對于這種含有多對二硫鍵的蛋 白的復性率普遍不高。例如同樣含有九對二硫鍵的瑞替普酶(r-PA) ， Kohnert (Kohnert U ，Rudolph R ,Verheijen J H ，et al .Biochemical properties of the kringle 2 and protease domains are maintained in the refolding t-PA deletion variant BM 06. 022. Protein Engineering ，1992 ，5 (1) :93 100)等用稀釋復性法復性r_PA，具體步驟是將 變性蛋白加入到緩沖液(O. 05mol/L Tris-HCl， pH 9. 3; 6mol/L鹽酸胍，0. 1 mol/L GSSG)中， 25 °C， 3.5h ，用氧化型谷胱甘肽使r-PA的巰基衍生化(derivatized)以對巰基進行保護。 再用10 L蛋白質復性(折疊)緩沖液[refolding buffer : 0. 7mol/L精氨酸-鹽酸，pH8. 6 ; 2誦ol/L GSH; l誦ol/L EDTA ]，添加300ml 二硫化物混合液，分成3部分，放置24h進行 復性，其復性率不超過5%。孫石靜(孫石靜等.瑞替普酶融合蛋白在大腸桿菌中表達條件的 優化及其復性.中國藥科大學學報，2005 ,36 (4) :363 - 367)等運用金屬螯合柱一步復性， 融合蛋白復性率也僅達10%。趙友春(趙友春等.提高溶栓新藥瑞替普酶生產得率的中試研 究.化工科技,2003 ，11(1) :15 17)等改進了 Kohnert的方法,在谷胱甘肽還原體系中，用 重組人二硫鍵異構酶(PDI)輔助瑞替普酶復性,其復性率達到14%以上。但是PDI價格昂貴， 用于工業化無疑大大提高了成本。在本專利中，采用了透析復性方法對水蛭素12肽和瑞替普 酶融合蛋白進行復性，本發明中的透析復性法，與常用方法相比，其改進在于首先采用了 Gly-NaOH代替常用的Tris-HCl作為緩沖體系，Gly價格更低廉，且被動物耐受，使該蛋白在 復性后可以直接用于藥效學評價以及臨床研究及應用，Tris則必須除去后才能用于動物和人 體，而Tris的去除又是一個有待研究的課題。二是采用胱氨酸-半胱氨酸代替了GSSG/GSH作 為氧化還原體系，二者相比，后者價格昂貴，只能用于實驗室研究而不能用于產業化。做出 這兩個改進后，復性后溶栓活性可達6209IU/mg，抗凝活性為709ATU/mg。且透析復性后蛋白 濃度較高，加入蔗糖或海藻糖等保護劑后可凍干保存，其穩定性較好。發明內容本發明針對的對象是一種全新的抗凝溶栓雙功能融合蛋白——瑞替普酶-水蛭素12肽融 合蛋白(HV12p-rPA)，在大腸桿菌中表達的該融合蛋白，其表達水平的高低直接影響后續的研 究及其產業化的進展，且它以不溶性的包涵體形式存在，含有九對二硫鍵，疏水性也較強， 極易造成二硫鍵錯配和聚集體形成，復性非常困難，且復性后必須保證其具有雙功能活性。 本專利針對這些問題，公開了一種高效表達該融合蛋白的方法和梯度透析復性法。高效表達方法如下以1%的接種量，將甘油(15%)管保存的菌種接種至新鮮含Am (100ug/ml)的LB液體培 養基中37'C培養12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液轉接至蒸餾水配制的LB培養基(含，按照5%的接種量加入菌種，37°C， 200r/min恒溫培養3h后，加 入誘導劑IPTG使終濃度為lmmol/L，再以200r/min， 39'C恒溫誘導4h，結束后，收菌，即 4'C下以8 000r/min離心3min，所得菌體沉淀以PBS (pH7. 4)吹勻洗滌一次后，同條件離心 得菌體，可獲得高效表達的水蛭素12肽與r-PA融合蛋白，表達量約占總蛋白29 %。 其中優化方案如下-.采用正交法，選取搖瓶培養條件中七個主要因素進行兩水平正交優化實驗。該七個因素 為培養基的配制、接種量、誘導時間、轉速、誘導溫度、補料方式、微量元素。借助SDS-PAGE 和Bandscan凝膠分析軟件，獲得該融合蛋白在菌體總蛋白中的表達量百分數，作為考察條件 優化的目標量。選用18(27)安排，進行八次實驗，對實驗結果進行分析，通過極差分析，顯 示出微量元素鈣、鎂的添加以及搖床轉速(即通風量)對表達量結果影響最大。其他因素則 是綜合發酵工藝的簡便以及節約資源的角度來選取。本發明是通過控制通風量和添加微量元素來提高水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的表 達水平，使其表達量提高到約29%。該方法的優點在于方法簡便、易行，提高產量，但不 提高成本。大大節省了時間、人力、物力和財力。無論對于實驗室規?；蛏虡I化生產均有較 好的應用價值。.


圖中1為中分子量marker (6—10分別表示97. 4KD、 66. 2KD、 42. 7KD、 31. OKD、 14.4KD); 2-4分別為三次平行實驗包涵體表達量；ll代表融合蛋白。 最佳實施例1. 方法① 保種取牛奶凍千管中的HrP/BL21表達工程菌，以LB液體培養基配成溶液后，在LB 固體培養基(含100ug/mL Amp)'平板上涂布，37'C培養過夜，挑取平板上菌落接種至LB液 體培養基(含100ug/mL Amp)， 37°C, 200r/min振搖過夜。以15%的甘油保存于-20。C冰箱中備用o② 搖瓶發酵以1%的接種葶，將甘油(15%)管保存的菌種接種至新鮮含Amp (100ug/ml) 的LB液體培養基中37'C培養12h，使菌種得到活化。再將此活化的菌液按5%的接種量轉接 至搖瓶中，搖瓶內為蒸餾水配制的LB培養基，其中含AmplOOug/ml， Ca"l腿ol/L、 Mg"20咖ol/L繼續培養3h后，加IPTG (lmmol/L)作為誘導劑，39。C下，200r/min誘導4h。③ 收菌誘導結束后，收菌，即4'C下以8 000r/rain離心3min，所得菌體沉淀以PBS(pH7. 4) 吹勻洗滌一次后，同條件離心得菌體。④ 菌體的破碎以Tris-Cl (pH 8.0)重懸菌體，250W， 5sX10s，冰浴超聲累計5min， 12 000r/inin, 4'C離心20min得包涵體，-20'C保存。2. 結果鑒定吸取超聲裂解后的溶液(未離心)100ul到EP管中，加入100ul 1XSDS 的上樣緩沖液。煮沸3-5分鐘后，每個電泳樣品各加20ul做SDS-PAGE，以考馬斯亮藍G-25 染色6h，脫色后進行掃描，再以bandscan 3.0軟件計算目的蛋白在菌體總蛋白中的表達量。釆用該條件做三次平行試驗，結果表達量分別為28.3%、 26.5%、 31.1%平均表達量為 28.6%，其SDS-PAGE結果如附圖.梯度透析復性技術方案用工程菌表達融合蛋白——超聲破碎菌體——離心分離得包涵 體沉淀——Triton洗滌包涵體——離心，保留包涵體沉淀——用加入精氨酸及氯化鈉的脲或 鹽酸胍溶液變性溶解包涵體——將澄清的包涵體溶液裝入透析袋，袋外用含梯度濃度尿素的 緩沖液于4'C進行梯度透析，每6-8h換液一次——透析結束后，測定袋內溶液的溶栓活性和 抗凝活性——冷凍干燥，干燥器內保存。最佳實施例1. 包涵體的洗滌稱取超聲破菌后的200mg包涵體，按1: 10(w/v)比例用Triton溶液(50面ol/L Gly-Na0H buffer (pH8.6)， 10mmol/L EDTA， 0.5% Triton X-100， 100咖ol/L NaCl)吹勻，攪拌2h, 在4'C下，以12 000r/min離心，收集沉淀。2. 包涵體的溶解按照1: 30 (w/v)的比例用8mol/L的尿素緩沖液(8mol/L尿素，0. 7mol/L L-Arg， 50mmol/L DTT， 100mmol/L NaCl ， 50mraol/L Gly-Na0H buffer ， pH8. 6)溶解洗滌后的包涵 體，攪拌溶解4h-6h，在4'C下，以12 000r/min離心，收集上清液，棄去不溶沉淀物。3. 變性蛋白溶液濃度測定以考馬斯亮蘭法測定蛋白質濃度，約為427/ig/ml。4. 將上步中所述上清液裝進透析袋(規格10000道爾頓)中，依次用含6、 4、 2、 1、 0.5、 0mol/L尿素的基礎透析緩沖液(袋內袋外溶液體積比為1: 50)于4'C進行透析，每 8h換液一次。其中，基礎透析緩沖液為20mmol/L Gly-NaOH(pH9. 2) ， 0. 5mol/L L-Arg， lranol/L半胱氨酸，lmmol/L胱氨酸。5. 透析結束后，采用考馬斯亮蘭法測定透析袋內蛋白液的濃度，約為225.6ug/ml6. 生物活性的測定'(1) 抗凝活性的測定于酶標板小孔中加200 ul 4mg/ml的人纖維蛋白原(O. 05 rao1/ L Tris-HCl ，0. 15mol/L NaCl緩沖液(pH7. 4)配制)，再加入50y 1復性的蛋白溶液，充分 混勻。用微量進樣器吸取標準的凝血酶溶液(400NIH單位)，時間間隔為1 min ,若在1 min內 纖維蛋白原發生凝固，即說明已達滴定終點。由凝血酶的消耗量換算出水蛭素的單位數。由于 水蛭素與凝血酶是1 : 1結合，故每消耗一個凝血酶單位(NIH)相當于一個抗凝血酶單位(ATU)。(2) 纖溶活性測定纖維蛋白-瓊脂糖平板測定法配制平板用溶液均為O. 05mol/L Tris-HCl , 0. 15mol/L NaCl 緩沖液(pH7. 4)。將50nl凝血酶(400NIH單位)加到25ml人纖維蛋白原溶液(4mg/ml)中， 迅速混勻，傾入完全融化且降溫至5(TC左右的25iid瓊脂糖溶液(1%)，混勻，倒入直徑為15cm 的平板中，室溫放置O. 5以上，凝固后打孔使用。孔中滴加不同比活性(10—20000單位/ml) 的尿激酶標準品30ul。平皿加蓋，37'C溫育15h。測量溶栓圈相互垂直的兩直徑，以直徑積 的對數lg中將lBP單位AiL的凝血酶溶液貼壁加入10mL血纖蛋白原(5mg/mL)溶液中，快速混勻， 傾入至完全融化且已降至45。C的10mL瓊脂糖溶液(1.0 %)中，混勻，倒入直徑90國的平皿中， 凝固后打孔使用。用微量移液器分別吸取不向比活性的尿激酶標準品30yl ，滴于孔中，平皿加蓋后，于37 °C 溫育36h。用游標卡尺測量溶圈相互垂直的兩直徑，以兩直徑乘積的對數(lg^A)為縱坐標， 以對照品尿激酶單位活性的對數(lglU/mL)為橫坐標，作標準曲線。同樣，取待測定的蛋白樣 品依上述方法檢測，將測得數據代入標準曲線方程，求出相應的單位活性(IU/mL)，再根據樣 品的蛋白含量，進而求得比活性(IU/mg)。利用^商定法測定復性后蛋白液的抗凝活性為709ATU/mg;利用平板法測定復性后蛋白 液的溶栓活性為6209 IU/mg。7.將透析后的蛋白液加入1%的蔗糖作為保護劑進行冷凍干燥后保存。透析3^為一種常見的復性方法，因此它具有操作簡單方便的優點。本法的優點在于(1) 方法簡單易操作，能夠同時將融合蛋白的兩種功能較好地恢復；(2)所用試劑均為普通實際， 成本低廉；(3)提高了復性后蛋白的濃度，實現了高濃度蛋白質的復性，為后續處理比如凍 干保存等歩驟減少了麻煩，降低了生產成本，實現了工業化的可能。
權利要求
1.一種高效表達水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的方法，其特征在于優化表達該融合蛋白的大腸桿菌的培養條件(培養基組成、接種量、誘導時間、搖床轉速即通風量、誘導溫度和微量元素)，建立了一套使表達量提到高30％的培養條件，即在蒸餾水配制的LB培養基(含Amp濃度為100ug/ml)中，按照5％的接種量加入菌種，37℃，200r/min恒溫培養3h后，加入誘導劑IPTG使終濃度為1mmol/L，再以200r/min，39℃恒溫誘導4h，可獲得表達量約為29％的水蛭素12肽與r-PA融合蛋白。水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的透析復性方法，其特征在于采用“Triton洗滌”—“變性溶解”—“梯度透析”的復性過程，復性后溶栓活性達到6209IU/mg，抗凝活性達到709ATU/mg。
2. 按照權利要求1所述新型雙功能HV12p-rPA融合蛋白高效表達方法，其特征在于表 達對象為全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，其表達形式為包涵體蛋白。
3. 按照權利要求1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表達方法，其特征在于 培養基組成為LB培養基，其中添加了微量元素Ca2+、 Mg"濃度分別為l隱ol/L和20mmol/L。
4. 按照權利要求1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表達方法，其特征在于.-接種量為5%，誘導時間為4h，搖床轉速為200r/min，誘導溫度為39'C，誘導劑為IPTG,其 濃度為l咖ol/L。 .
5. 按照權利要求l所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)的透析復性方法，其特征在于 以全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的包涵體為原料，具體操作過程如下(1) 在室溫下，收集超聲破菌后的包涵體，加入到含有10-20mmol/L金屬螯合劑EDTA， 50-100mmol/L NaCl的Triton洗滌液中，吹勻后磁力攪拌2-3小時，冷凍離心得沉淀；(2) 在室溫卞，將洗滌后的包涵體，使用6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍緩沖液，使包 涵體變性溶解，其中緩沖液含有還原劑DTT (0.5-lmmol/L)或e-巰基乙醇(10-20mmol/L)， 含分子伴侶L-精氨酸0. 6-0. 7mol/L。攪拌溶解4h以上，12000r/min， 15 min，除去不溶物， 收集上清液。(3) 將(2)中上清液裝進透析袋(規格10000道爾頓)中，依次用分別加入6、 4、 2、 1、0. 5、0mol/L尿素的基礎透析緩沖液(含0. 5-0. 6mol/L L-Arg， lmmol/L半胱氨酸，l咖ol/L 胱氨酸，20鵬ol/L Gly-Na0H， PH9. 2)，袋內袋外溶液體積比》1: 50，于4。C進行梯度透析， 每6-8h換液一次，使其逐漸折疊恢復活性。(4) 將透析后的蛋白液加入1%的蔗糖作為保護劑進行冷凍干燥保存。
6. 按照權利要求1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性法，其特征在于復 性對象為全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，其復性成功后應具有抗凝溶 栓的雙功能。
7.按照權利要求1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性方法，其特征在于 洗滌包涵體的Triton溶液組成為:10-20 mmol/L EDTA， 0. 5% Triton X-100， 50-100mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-CI pH8. 5。
8.按照權利要求1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性方法，其特征在于 變性溶解包涵體的溶液組成為6-8mol/L脲或3-7raol/L胍中含0.5-1 mmol/L DTT或10-20鵬ol/L e -巰基乙醇，0. 6-0. 7mol/L L-精氨酸，100-15Ommol/L NaCl, 50ramol/L Tris-Cl 或Gly-NaOH pH8.6。
9.按照權利要求l所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性方法，其特征在于: 所述基礎透析緩沖液組成為0.5-0.6mol/L L-Arg， lmmol/L半胱氨酸，lmmol/L胱氨酸， 20mmol/L Tri-HC1或Gly-NaOH， pH9. 0-9.3 。
10. 按照權利要求l所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性方法，其特征在于 所述梯度透析緩沖液為在基礎透析緩沖液中分別加入6、 4、 2、 1、 0.5、 Omol/L尿素。
11. 按照權利要求l所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性方法，其特征在于 分子伴侶為L-Arg。
12.按照權利要求1所述新型雙功能融合蛋白(HV12p-rPA)透析復性方法，其特征在于: 所述氧化還原系統是指GSSG/GSH，半胱氨酸/胱氨酸。
全文摘要
本發明屬于生物制藥領域，具體涉及到一種新型抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表達和透析復性法。高效表達法通過優化表達HV12p-rPA蛋白的大腸桿菌的7個培養條件，證明搖床轉速即通風量和微量元素對表達量提高有顯著影響，使其提高到約29％。本方法簡單、易行、高效，不提高成本，對實驗室規模或商業化生產均有較好應用價值。透析復性法其特征在于采用“洗滌”—“變性溶解”—“梯度透析”的過程。本法與通常的透析復性法相比，證明了用Gly-NaOH代替Tris-HCl作緩沖體系和用胱氨酸-半胱氨酸代替GSSG/GSH作為氧化還原體系，同樣效果良好。該法效果穩定，蛋白濃度高，易操作，去除了會對臨床使用有毒的物質，且成本低廉，產業化前景良好。
文檔編號C12N1/21GK101245111SQ20081004506
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月27日 優先權日2008年3月27日
發明者蓉 余, 吳梧桐, 李玲靈, 楊繼虞, 蘭 梁, 玲 高 申請人:四川大學