本發明涉及一種抗USP2a單克隆抗體及其應用，屬于分子免疫學技術領域；具體涉及一種抗USP2a蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的抗USP2a單克隆抗體和在腫瘤組織切片免疫組織化學檢測中的應用。

二、

背景技術：
：

USP2又稱泛素特異性蛋白酶2，是去泛素化酶家族，泛素特異性蛋白酶的成員，USP2基因定位于11號染色體長臂(11q23.3)，最早是在大鼠睪丸中經克隆鑒定出來的。USP2基因經過5’末端的選擇性剪切可產生兩個不同的亞基USP2a(USP2-69；UBP-t2)和USP2b(USP2-45；UBP-t1)，但它們都擁有基因3’末端的催化結構域。

研究證明，當USP2a在未轉變的細胞中超表達時，顯示出致癌性，并且能阻止化療因子誘導的凋亡；而在多種腫瘤細胞株中，USP2a基因沉默能誘導細胞凋亡。USP2a在人前列腺癌細胞中高表達，高表達的USP2a能夠穩定脂肪酸合成酶(fatty acid synthase:FAS)，FAS在包括前列腺癌在內的許多惡性腫瘤中超表達，并能促進細胞增生，并且FAS的表達與前列腺癌的級別密切相關。通過siRNA作用下調USP2a的表達后發現，FAS含量降低，導致細胞凋亡。另外USP2a的異常表達能夠使MDM2以劑量依賴形式聚集，同時能促進MDM2介導的p53降解，而抑制USP2a則能使MDM2不穩定，從而引起p53蛋白的聚集和激活。除此之外，在膀胱癌、卵巢癌和胃癌等的研究中均發現USP2a與癌細胞增生和遷移密切相關。這些實驗結果都證明USP2a與腫瘤的發生、發展有重要的聯系，USP2a是治療腫瘤的又一個重要靶點。

USP2a單克隆抗體藥物具有廣泛的應用前景，可用于多個類型腫瘤的檢測和治療，主要包括：前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃癌等。因此，開發與USP2a具有高親和力的抗體藥物，用于癌癥的檢測和免疫治療，使其具有更好的治療效果、更低的毒副作用具有重要的意義。然而，目前現有的USP2a抗體藥物親和力低，尚缺少一種具有高親和力的USP2a抗體。

三、

技術實現要素：
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本發明要解決的技術問題是：提供一種抗USP2a蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株(命名為雜交瘤細胞株3D9)及其產生的抗USP2a單克隆抗體和應用。本發明的雜交瘤細胞株3D9分泌產生的抗USP2a的單克隆抗體具有效價高、性質穩定和特異性強等特點。

本發明要解決的技術問題是采用如下技術方案實現的：

本發明提供了雜交瘤細胞株3D9，該雜交瘤細胞株3D9已于2016年11月1日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：C2016186；經檢測為存活。

本發明提供了抗USP2a的單克隆抗體，它是由保藏編號為CCTCC NO：C2016186的雜交瘤細胞株3D9分泌產生。

本發明還提供了抗USP2a的單克隆抗體在腫瘤組織切片免疫組織化學檢測中的應用。

本發明抗USP2a單克隆抗體的制備方法，主要步驟為：克隆重組USP2a基因，表達USP2a融合蛋白，以USP2a融合蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，用免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，采用間接酶聯免疫吸附法(ELSA)篩選產生USP2a單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞株，利用所得陽性雜交瘤細胞株進行克隆化，并采用間接酶聯免疫吸附法(ELSA)篩選克隆化后的雜交瘤細胞產生的USP2a單克隆抗體的效價，選取效價最高的雜交瘤細胞株即得到雜交瘤細胞株3D9，將所得的雜交瘤細胞株3D9腹腔注射BABL/c小鼠，收集腹水即得到USP2a單克隆抗體。

本發明對USP2a單克隆抗體制備過程中涉及到的幾個方面進行以下詳細描述：

1)USP2a具體是指在前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃癌等多種腫瘤組織中表達異常的USP2a基因，該基因在未轉變的細胞中超表達時，顯示出致癌性，并且能阻止化療因子誘導的凋亡；普通的檢測方法速度較慢、耗時較長和特異性不佳。本發明在制備USP2a單克隆抗體的方法中通過PCR擴增獲得USP2a基因，構建USP2a重組克隆，并優化表達條件使重組蛋白實現分泌型表達；分泌型表達的USP2a融合蛋白空間結構接近天然蛋白，具有很高的酶活性能夠激發免疫細胞產生特異性抗體。

實驗證明，通過本發明所述方法制備的USP2a單克隆抗體具有效價高、性質穩定和特異性強等特點。

2)重組蛋白的制備與純化過程：

按照NCBI GenBank上公布的USP2a mRNA編碼序列(GenBank ID：BC002854)進行分析，設計引物(上游引物：5’GGAATTCATGAATTCTAAGAGTGCCCAGG 3’，下游引物：5’CCGCTCGAGCTACATTCGGGAGGG 3’)，在上、下游引物上分別加入EcoRI和XhoI酶切位點，以前列腺癌細胞cDNA為模板進行PCR擴增，獲得USP2a基因，采用EcoRI和XhoI分別雙酶切PCR產物和載體pET28a(+)，之后進行連接、篩選，獲得重組質粒pET28a-USP2a，重組質粒pET28a-USP2a在大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中進行表達，優化表達條件，在30℃溫度條件下進行表達，離心收集細胞菌體，超聲破碎，離心棄沉淀，上清經過鎳離子親和層析純化收集，進一步濃縮，獲得純化的USP2a融合蛋白。

3)USP2a單克隆抗體的制備過程為：

(a)將純化得到的USP2a融合蛋白作為抗原與福氏完全佐劑充分乳化后皮下注射小鼠，再分別于3周、6周后用USP2a融合蛋白作為抗原與福氏不完全佐劑充分乳化后各免疫1次，8周后用相同劑量的USP2a融合蛋白作為抗原腹腔注射小鼠；

(b)最后一次注射3天后，取上述免疫小鼠的脾細胞進行細胞融合；骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10的比例混合在一起，在50mL離心管中用無血清1640不完全培養基洗滌1次，1200rpm離心8min，棄上清，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動；90s內加入37℃、預溫的1mL 45％聚乙二醇PEG(分子量4000)溶液(PEG的溫度為37℃)，邊加邊輕微搖動；之后在37℃水浴中作用90s；再分別加入37℃預溫的1640不完全培養基1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL以終止PEG作用，每次加入的時間間隔為2min；800rpm離心6min，棄上清，得到細胞；用含20％小牛血清HAT選擇培養基對離心所得細胞進行重懸；將重懸后的細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μL；將培養板置37℃、5％CO₂培養箱中進行培養；

(c)利用間接ELISA檢測方法，對步驟(b)中96孔板內每個孔中細胞的培養液中的抗體進行檢測，篩選出抗體陽性雜交瘤細胞。

(d)采用有限稀釋法對步驟(c)篩選出的抗體陽性雜交瘤細胞進行克隆化，先將要克隆的雜交瘤細胞計數，調整細胞濃度為3～10個細胞/mL；取頭天準備的具有飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入調整濃度后的細胞100μL；孵育于37℃、5％CO2培養箱中；在第7天換液，以后每2～3天換液1次；8～9天可見細胞克隆形成，利用間接ELISA檢測方法檢測每個孔中細胞培養液中的抗體活性，將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養；擴大培養后得到雜交瘤細胞；

(e)取小鼠，以0.5mL/只的劑量腹腔注射液體石蠟，1周后以1×10⁶CFU/只的劑量對小鼠腹腔注射步驟(d)得到的雜交瘤細胞，而后從小鼠腹腔采集腹水，離心取上清，即得到USP2a單克隆抗體；

(f)采用Southern biotech小鼠單抗分型ELISA試劑盒測定步驟(e)得到的USP2a單克隆抗體，雜交瘤細胞株3D9產生的單抗為IgG1；利用親和層析法對產生的單抗進行純化，獲得純化的USP2a單克隆抗體；免疫印跡和免疫組化實驗顯示純化的USP2a單克隆抗體能特異性識別USP2a融合蛋白以及高表達USP2a的前列腺癌組織。

本發明USP2a抗原即USP2a融合蛋白是指由具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列編碼；所述的USP2a融合蛋白抗原，該融合蛋白由全長為605氨基酸的USP2a蛋白以及用于融合蛋白純化的六個組氨酸標簽組成，具體融合蛋白全長為序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本發明上述制備方法中采用的免疫小鼠是6～8周齡，體重18～20g的雌性BALB/c小鼠；采用的完全或者不完全培養基是1640培養基；

采用的間接ELISA檢測方法，陽性對照為免疫小鼠的血清，陰性對照為非免疫小鼠的血清。

四、附圖說明：

圖1 USP2a融合蛋白的蛋白表達SDS-PAGE電泳圖；

圖1中：1、未誘導的菌液，2、誘導后的全菌液，3、超聲破碎后的上清液，4：Marker。

圖2純化的USP2a融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖；

圖2中：1、誘導后的全菌液，2、超聲破碎的離心的上清液，3、超聲破碎的離心的沉淀，4、洗脫液1，5、洗脫液2，6、洗脫液3，7、純化的USP2蛋白，8、Marker。

圖3：純化的USP2a融合蛋白的Weston blot分析圖；

圖4：單克隆抗體USP3D9的免疫組化分析圖。

圖4中，A陰性對照圖，B前列腺癌染色結果圖。

五、具體實施方式：

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的內容不受以下實施例的限制。

下面實施例中所采用的實驗材料、實驗試劑和儀器，未經特殊說明，均為本領域中常規的材料、試劑和儀器，均可通過商業途徑獲得。

實施例1：

本發明一株雜交瘤細胞株3D9的制備方法，該制備方法的詳細步驟為：

(一)USP2a基因的克隆、表達和純化：

1、USP2a基因克?。篣SP2a按照NCBI GenBank上公布的登錄號BC002854的USP2a mRNA編碼序列的參考序列所定義的編碼區DNA序列，設計引物：(上游引物：5’GGAATTCATGAATTCTAAGAGTGCCCAGG 3’，下游引物：5’CCGCTCGAGCTACATTCGGGAGGG 3’)；在上、下游引物上分別加入EcoRI和XhoI酶切位點；以前列腺癌細胞cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增反應體系如下：采用25μl反應體系：2.5μl 10×PCR反應緩沖液，上游引物、下游引物各1μl(100ng)，dNTP1μl(50mM)，cDNA模板1μl(1ng)，Taq DNA聚合酶1μl(2.5U)，加ddH₂O 17.5μl補至總體積25μl；PCR擴增反應條件如下：第一步預變性：95℃5min；第二步循環擴增：95℃30s、58℃45s、72℃1min，25個循環；第三步延伸：72℃8min；PCR擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，即可獲得USP2a基因；將PCR擴增得到的USP2a基因與載體pET28a(+)用EcoRI和XhoI雙酶切，電泳、回收，用T4連接酶對回收片段進行連接；所得連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取平板上的克隆菌落，進行接種，提取質粒DNA，并對提取的質粒DNA進行PCR和酶切鑒定；對鑒定結果顯示陽性的克隆進行測序分析，將測序完全正確的克隆進行菌種保存；

2、USP2a蛋白的蛋白表達：

2.1蛋白表達條件的優化：選取步驟1中保存的菌種，用接種針蘸取菌液，接種到3mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，共接種4支菌液，標記序號，37℃過夜培養，第二天擴大培養到100mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，分別采用25℃、30℃、37℃和42℃四個不同的溫度，180rpm繼續培養；檢測OD＝0.6-0.8時進行IPTG誘導，IPTG濃度為0.8mM，誘導4h后收集菌液；所得菌液在5000rpm條件下離心5min，棄上清，所得沉淀用100mmol/L的PBS緩沖液(PH＝7.4)(PBS緩沖液的配制：0.2mmol/L Na₂HPO₄溶液12.3mL和0.2mmol/LNaH₂PO₄溶液的87.7mL混合后調節PH值到7.4，加蒸餾水稀釋至200mL即可)洗滌2-3遍，然后加入10mL裂解液(裂解液的成分：50mMTris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1％Triton X-100)重懸菌體，超聲破碎(超聲破碎條件：300w，每次10s，間隔10s，共超聲10分鐘)，超聲后的菌液在12000rpm條件下離心10min，離心所得上清轉移到新的離心管中，取80μl上清加入20μl 5×SDS-PAGE上樣緩沖液(上樣緩沖液的成分：60mmol/L Tris-HCl，pH6.8、2％SDS，0.1％溴酚蘭，25％甘油，14.4mmol/Lβ-巰基乙醇)，混勻；所得沉淀用100μl裂解液(同上)重懸，取80μl加入20μl5×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻；將加入SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后的上清和沉淀一起放入100℃沸水浴中煮10min，通過SDS-PAGE電泳檢測USP2a融合蛋白的表達量與表達方式；結果顯示USP2a蛋白在30℃時主要表達方式為可溶性的分泌型表達，表達量也較高；因此，選用30℃的溫度條件，延長誘導時間，進行下一步的大量表達；

2.2蛋白的大量表達：選取步驟1中保存的菌種，用接種針蘸取菌液，接種到5mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃過夜培養；第二天擴大培養到500mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，30℃、180rpm繼續培養，檢測OD＝0.6-0.8時進行IPTG誘導，IPTG濃度為0.8mM，誘導6h后收集菌液；所得菌液在5000rpm條件下離心5min，棄上清，所得沉淀用PBS緩沖液(PBS緩沖液的配制同上)洗滌2-3遍，然后加入30mL裂解液(裂解液的成分同上)重懸菌體，超聲破碎(300w，每次10s，間隔10s，共超聲20分鐘)，超聲后的菌液在12000rpm條件下離心10min，上清轉移到新的離心管中，取80μl上清加入20μl 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻；所得沉淀用500μl裂解液重懸，取80μl加入20μl 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻；將加入SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后的上清和沉淀一起在100℃沸水條件下煮10min，SDS-PAGE電泳檢測USP2a融合蛋白的表達量與表達方式(詳見附圖1)；結果顯示USP2a融合蛋白主要表達方式為分泌型表達，表達量也較高；

3、蛋白純化：蛋白純化采用北京索萊寶生物科技有限公司生產的蛋白純化試劑盒(His-Bind Purification Kit)：

取1.5～2mL His-Beads(組氨酸珠子)用10mL去離子水清洗，10mL 1×Charge Buffer(平衡緩沖液)和10mL 1×Binding Buffer(結合緩沖液)處理以平衡層析柱，而后將步驟2中超聲破碎后離心后得到的上清液與His-Beads(組氨酸珠子)混合，置于混合器上，4℃、旋轉30min使之混勻；將上清與His-Bead的混合液加入到柱子中，并固定在三腳架上，收集穿出液標記為Flow through，之后用10mL 1×Binding Buffer洗層析柱，收集穿出液到一新管中，標記為Binding through，10mL 1×Wash Buffer(洗滌緩沖液)洗柱，同樣收集穿出液到一新管中，標記為Wash through，最后用0.5×Elute Buffer(洗脫緩沖液)洗柱，流出液即為USP2a目的蛋白；用SDS–PAGE蛋白電泳驗證純化的蛋白質量(詳見附圖2)；

4、USP2a純化蛋白的western blot檢測(檢測結果詳見附圖3)：

A、取少量步驟3純化后所得的USP2a目的蛋白，先進行SDS–PAGE電泳；

B、電泳結束后取出凝膠制作轉膜裝置“轉膜三明治”，準備轉膜，所選用的膜為PVDF膜；

C、將做好的“轉膜三明治”放到轉膜槽中，加入轉膜緩沖液，連接轉膜儀160V恒壓，轉膜60-90min；

D、封閉：取出PVDF膜，放入到預先準備好的PBST洗滌液中(PBST洗滌液0.15mol/L pH 7；配制方法：0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，Tween-20 0.5mL，加蒸餾水至1000mL)，漂洗3次，每次5-10min，以洗去膜上的轉膜液；加入Western封閉液(含有5％脫脂奶粉的PBST緩沖液)，在搖床上緩慢搖動，4℃下封閉過夜；

E、一抗孵育：倒去封閉液，用PBST洗滌液清洗3次，每次5-10min，之后加入1:1000被稀釋好的一抗，室溫孵育1小時；

F、二抗孵育：倒去一抗，用PBST洗滌液清洗3次，每次5-10min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育30min-1h；

G、顯色：倒去二抗，用PBST洗滌液清洗5次，每次5-10min，清洗完成后，轉入暗室準備顯色，用ECL顯色液顯色；

(二)動物免疫：

1、免疫動物：選取健康的6～8周齡的BALB/c小鼠進行免疫；取實施例1制備的可溶性USP2a目的蛋白作為抗原蛋白與等量福氏完全佐劑乳化均勻后，通過背部皮下注射每只小鼠6點，劑量為50μg/每只；每3周加強免疫一次，免疫劑量同第一次；加福氏不完全佐劑，背部皮下多點注射；第三次免疫10天后取血，以間接ELISA方法檢測抗體效價；效價達到要求后進行沖刺免疫，間隔上一次免疫時間為3周后，劑量為100μg/每只，不加佐劑，腹腔注射；3天后，取脾進行細胞融合；

2、骨髓瘤細胞懸液制備：在上述步驟1細胞融合前36-48小時，將NS0骨髓瘤細胞擴大培養，按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養瓶培養的細胞進行準備；融合前一天傳代一次，使融合當天NS0骨髓瘤細胞處于對數生長期，用彎頭滴管將細胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管中，1000r/min離心5-10分鐘，棄上清，加入30ml、1640不完全培養基，同法離心洗滌一次，然后將細胞重懸于10ml、1640不完全培養基中，混勻；取骨髓瘤細胞懸液，加0.4％臺盼藍染液做活細胞計數后備用；

3、脾淋巴細胞的準備：取步驟1中3天前沖刺免疫的BALB/c鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清；頸椎脫位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分鐘，于解剖臺板上固定后，掀開左側腹部皮膚，在超凈臺中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml、1640不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，并細心剝去周圍結締組織；將洗滌后的脾臟移入另一盛有10ml、1640不完全培養基的平皿中，用注射器內芯擠壓脾臟，使脾細胞分散，用吸管吹打數次，用200目銅網過濾，制成單細胞懸液；1000r/min離心10分鐘，用1640不完全培養基離心洗滌2次，然后將細胞重懸于10ml、1640不完全培養基中，混勻，取上述懸液，加臺酚藍染液作活細胞計數后備用；

4、細胞融合：將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10的比例混合在一起，在50ml離心管中用1640無血清不完全培養基洗1次，1200rpm離心8min，棄上清，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動；在90s內加入37℃預溫的1ml 45％聚乙二醇PEG(分子量4000)溶液，邊加邊輕微搖動；之后在37℃水浴中作用90s；作用后分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml 37℃預溫的1640不完全培養基以終止PEG作用，加入的時間間隔為每2min加一次；全部加完后800rpm離心6min，棄上清，所得沉底用含20％小牛血清的HAT選擇培養基重懸；將重懸后的細胞加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl細胞懸液；將培養板置于37℃、5％CO₂培養箱中培養；

(三)雜交瘤細胞篩選：

1、陽性雜交瘤細胞的篩選：HAT選擇培養基培養7～10天后，換用HT培養基，培養2周，然后使用1640培養基培養；在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，采用間接ELISA方法進行抗體檢測，以P/N≥2.1作為陽性判斷的標準，免疫小鼠的血清為陽性對照，非免疫小鼠的血清做為陰性對照，篩選出陽性雜交瘤細胞；

2、雜交瘤細胞的克隆化：采用有限稀釋法對步驟1中篩選出的陽性雜交瘤細胞進行克隆化，克隆前1天制備飼養細胞層，將要克隆的步驟1中篩選出的陽性雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹起，計數，調整細胞濃度為3～10個細胞/ml；取頭天準備的有飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入調整濃度后的細胞100μl；孵育于37℃、5％CO₂培養箱中；在第7天換液，以后每2～3天換液1次，采用的培養液為1640培養基；8～9天可見細胞克隆形成，及時檢測細胞克隆產生的抗體活性，將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養，并及時凍存；

(四)USP2a單克隆抗體效價檢測：

取上述步驟得到的在24孔板中擴大培養的雜交瘤細胞，取24孔板中細胞的培養液進行梯度稀釋，采用間接ELISA的方法測定OD450值，同時設立陽性和陰性對照，以P/N≥2.1作為陽性判斷的標準；經測定獲得一株陽性雜交瘤細胞，命名為雜交瘤細胞株3D9(雜交瘤細胞的培養液抗體效價見表1；由表1可知，篩選出的這株雜交瘤細胞的培養液中抗體效價較高為1:3200)。

表1雜交瘤細胞株上清效價表

實施例2：

本發明USP2a的單克隆抗體制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：

(一)腹水的制備：

腹腔注射0.5ml液體石蠟于BALB/c小鼠，1周后腹腔注射含1×10⁶個/ml實施例1所制備的雜交瘤細胞株3D9 1ml，7天后開始收集腹水；

(二)采用Southern biotech小鼠單抗分型ELISA試劑盒測定收集的腹水中的USP2a單克隆抗體的亞型，雜交瘤細胞株3D9產生的單抗為IgG1；利用親和層析法對產生的單抗進行純化，獲得純化的USP2a單克隆抗體。

實施例3：USP2a單克隆抗體的應用實施：

USP2a單克隆抗體的免疫組化應用檢測：

(1)選取成人前列腺癌組織放入福爾馬林液中固定12-24h；

(2)將固定好的人前列腺癌組織塊進行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm；

(3)脫蠟與水化：將組織切片在室溫中放置60分鐘，于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；無水乙醇中浸泡5分鐘，更換無水乙醇再浸泡5分鐘；95％乙醇中浸泡5分鐘；70％乙醇中浸泡5分鐘；

(4)抗原修復：電爐水浴加熱0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右，放入組織切片加熱10-15分鐘，取出標本，自然冷卻至室溫，去離子水浸泡5min，重復3次；

(5)PBS緩沖液洗滌3次，每次5min；

(6)封閉：PBS+5％脫脂奶粉，室溫20min，甩去多余液體；

(7)滴加USP2a單克隆抗體50μl，37℃1小時；

(8)PBS洗3次，每次5分鐘；

(9)滴加Ⅱ抗(兔抗鼠)50μl，37℃1小時；

(10)PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘；

(11)DAB顯色5～10分鐘，自來水沖洗10分鐘；

(12)蘇木精復染2分鐘，1％鹽酸酒精分化，自來水沖洗10分鐘；

(13)脫水、透明、封片、鏡檢(詳見附圖4)。

SEQUENCE LISTING

<110> 新鄉學院

<120> 抗USP2a蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的抗USP2a單克隆抗體和應用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 1

atgaattcta agagtgccca gggtctggct ggtcttcgaa accttgggaa cacgtgcttc 60

atgaactcaa ttctgcagtg cctgagcaac actcgggagt tgagagatta ctgcctccag 120

aggctctaca tgcgggacct gcaccacggc agcaatgcac acacagccct cgtggaagag 180

tttgcaaaac taattcagac catatggact tcatccccca atgatgtggt gagcccatct 240

gagttcaaga cccagatcca gagatatgca ccgcgctttg ttggctataa tcagcaggat 300

gctcaggagt tccttcgctt tcttctggat gggctccata acgaggtgaa ccgagtgaca 360

ctgagaccta agtccaaccc tgagaacctc gatcatcttc ctgatgacga gaaaggccga 420

cagatgtgga gaaaatatct agaacgggaa gacagtagga tcggggatct ctttgttggg 480

cagctaaaga gctcgctgac gtgtacagat tgtggttact gttctacggt cttcgacccc 540

ttctgggacc tctcactgcc cattgctaag cgaggttatc ctgaggtgac attaatggac 600

tgcatgaggc tcttcaccaa agaggatgtg cttgatggag atgaaaagcc aacatgctgt 660

cgctgccgag gcagaaaacg gtgtataaag aagttctcca tccagaggtt cccaaagatc 720

ttggtgctcc atctgaagcg gttctcagaa tccaggatcc gaaccagcaa gctcacaaca 780

tttgtgaact tccccctaag agacctggac ttaagagaat ttgcctcaga aaacaccaac 840

catgctgttt acaacctgta cgctgtgtcc aatcactccg gaaccaccat gggtggccac 900

tatacagcct actgtcgcag tccagggaca ggagaatggc acactttcaa cgactccagc 960

gtcactccca tgtcctccag ccaagtgcgc accagcgacg cctacctgct cttctacgaa 1020

ctggccagcc cgccctcccg aatgtag 1047

<210> 2

<211> 348

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 2

Met Asn Ser Lys Ser Ala Gln Gly Leu Ala Gly Leu Arg Asn Leu Gly

1 5 10 15

Asn Thr Cys Phe Met Asn Ser Ile Leu Gln Cys Leu Ser Asn Thr Arg

20 25 30

Glu Leu Arg Asp Tyr Cys Leu Gln Arg Leu Tyr Met Arg Asp Leu His

35 40 45

His Gly Ser Asn Ala His Thr Ala Leu Val Glu Glu Phe Ala Lys Leu

50 55 60

Ile Gln Thr Ile Trp Thr Ser Ser Pro Asn Asp Val Val Ser Pro Ser

65 70 75 80

Glu Phe Lys Thr Gln Ile Gln Arg Tyr Ala Pro Arg Phe Val Gly Tyr

85 90 95

Asn Gln Gln Asp Ala Gln Glu Phe Leu Arg Phe Leu Leu Asp Gly Leu

100 105 110

His Asn Glu Val Asn Arg Val Thr Leu Arg Pro Lys Ser Asn Pro Glu

115 120 125

Asn Leu Asp His Leu Pro Asp Asp Glu Lys Gly Arg Gln Met Trp Arg

130 135 140

Lys Tyr Leu Glu Arg Glu Asp Ser Arg Ile Gly Asp Leu Phe Val Gly

145 150 155 160

Gln Leu Lys Ser Ser Leu Thr Cys Thr Asp Cys Gly Tyr Cys Ser Thr

165 170 175

Val Phe Asp Pro Phe Trp Asp Leu Ser Leu Pro Ile Ala Lys Arg Gly

180 185 190

Tyr Pro Glu Val Thr Leu Met Asp Cys Met Arg Leu Phe Thr Lys Glu

195 200 205

Asp Val Leu Asp Gly Asp Glu Lys Pro Thr Cys Cys Arg Cys Arg Gly

210 215 220

Arg Lys Arg Cys Ile Lys Lys Phe Ser Ile Gln Arg Phe Pro Lys Ile

225 230 235 240

Leu Val Leu His Leu Lys Arg Phe Ser Glu Ser Arg Ile Arg Thr Ser

245 250 255

Lys Leu Thr Thr Phe Val Asn Phe Pro Leu Arg Asp Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Glu Phe Ala Ser Glu Asn Thr Asn His Ala Val Tyr Asn Leu Tyr Ala

275 280 285

Val Ser Asn His Ser Gly Thr Thr Met Gly Gly His Tyr Thr Ala Tyr

290 295 300

Cys Arg Ser Pro Gly Thr Gly Glu Trp His Thr Phe Asn Asp Ser Ser

305 310 315 320

Val Thr Pro Met Ser Ser Ser Gln Val Arg Thr Ser Asp Ala Tyr Leu

325 330 335

Leu Phe Tyr Glu Leu Ala Ser Pro Pro Ser Arg Met

340 345