專利名稱：：一種用農桿菌生產瓜類轉基因植物的方法
技術領域：
：本發明屬于植物轉基因領域，具體的講，就是在用農桿菌侵染瓜類作物的外植體的時候如何防止在以后培養過程中農桿菌菌株污染這些外植體的方法。
背景技術：
：用農桿菌菌株在一定條件下侵染受傷植物組織，通過改造的農桿菌菌株能把自身的T-DNA或其它外源基因插入到目標植物組織中的基因組中，從而產生新的再生植株，這項技術在植物基因工程中被大量運用。但是，川農桿菌菌株和植物組織共培養后，必然要經過一段時間的培養而分化出愈傷組織及轉基因小苗，在浸染后的抗性芽篩選培養過程中，農桿菌污染是影響植物基因轉化成功率的一個重要方面。農桿菌污染不僅影響植物組織的生長，甚至導致抗性轉基因苗的死亡，同時不斷的繼代培養也增加工作量，加劇了真菌污染的機會。本發明提供一種新的方法，可以有效防止或減少在以后農桿菌菌株和植物組織共培養中造成對植物組織的污染而使轉基因獲得成功。
發明內容為了解決現有的技術問題，本發明提供一種新的方法，可以減少農桿菌在共培養或侵染培養后的污染，從而大大提高轉化效率和成功率。本發明提供的方法包括讓農桿菌在10-3(TC下與瓜類植物外植體侵染培養5-30分鐘后再進行共培養和分化培養。在一個優選的實施方式中，農桿菌與瓜類的子葉侵染培養的溫度為10-20°C，時間為10-15分鐘。在此溫度下的讓農桿菌侵染瓜類植物的子葉可以大大降低對外植體的污染，提高轉化效率，增加成活率。較優的，侵染培養的溫度為10-15°C。在一個優選的實施方式中，植物組織為西瓜子葉，或部分子葉組織，這^子葉最好是先經過一段時間的預培養，然后再把帶有傷口的子葉與農桿菌一起進行侵染培養。較優選的，農桿菌的濃度為OD=0.5-0.8,較優的，農桿菌的濃度為OD=0.5。在一個優選的實施方式中，侵染培養的時間為10-15分鐘，農桿菌為懸浮狀溶液，與西瓜子葉或部分子葉處于運動狀態中，在進行侵染培養后，除去子葉表面附著的農桿菌菌液。除去的方法可以使用濾紙吸干表面的液體。農桿菌是產生轉基因植物有效的載體工具之一，通過增加或減少一些基因片斷構建不同功能的質粒，并把質粒轉化到農桿菌中去。一般本領域內技術人員都可以根據不同的要求來構建含有特殊基因片段的農桿菌菌株。許多構建成功的質粒己經商品化或在學術交流中無償通用。關于如何把質粒轉化到農桿菌中去以及如何構建質粒不是本發明的重點，該技術為本領域一般技術人員公知的技術。外植體是指由活植物體上切取下來以進行培養的那部分組織或器官，可以是子葉，根，花等等。有益效果本發明所提供的方法可以有效減少農桿菌對瓜類植物外植體在侵染后培養過程中的污染，從而減少外外植體在后續培養或轉化過程的死亡，增加獲得轉基因植物的機會，降低生產成本，提高轉化效率。圖1，本發明實驗所用農桿菌菌株EHA105所含雙元載體PBI121質粒的結構。具體實施方式實驗為了進一步說明本發明的效果和實施方式，現以實驗加以說明。這些具體的實施例子僅僅是在不違背本發明精神下的有限列舉，并不排除本領域的一般技術人員把現有技術和本發明結合而產生的其他具體的實施方實驗一用農桿菌侵染西瓜子葉(l(TC)一，材料培養基配方按照下表配置MS基本固體培養基(表一)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>MS基本液體培養基。與固體培養基相比，液體培養基不含有瓊脂。YEB基本培養基的準備。分別稱取牛肉浸膏(Beefextract)5g，酵母提取物(Yeastextract)lg,多聚蛋白胨(Polypeptone)5g，蔗糖5g，瓊脂5g，加水定容至1000mL，調pH至7.2，滅菌后待用。使用時再加1MMgS04'7H202mL/L。兩瓜品種早佳農桿菌菌株EHA105如圖1所示為本實驗所使用的農桿菌菌株EHA105，它含有雙元載體PBI21質粒，包含植物抗性選擇標記新霉素磷酸轉移酶基因NptII，和報fr基閔e-葡糖苷(gusA)。.:，方法1)西瓜種子消毒并培養無菌苗取籽粒飽滿的種子去殼后用70%的酒精消毒1min，用無菌水洗3次，再用20%的次氯酸鈉消毒10-15min，無菌水洗3次，然后在無菌水里25。C振蕩l一2h。消毒后的種子在MS(蔗糖的濃度為2%)培養基上25。C黑暗培養2-3天，待90%露白后，放入16/8光照/黑暗2000lx的光照培養箱培養2天左右直到子葉變成淡綠色。2)預培養(啟動培養)取出無菌苗切取其子葉，切除小部分葉頂，子葉較大時也可切除子葉葉緣，制造傷口，然后沿子葉柄縱切成兩半，用刀尖在葉片上制造適量傷口，葉背朝下放在預培養培養基(MS+6-BA1.0mg/L)上黑暗培養2天，葉片變黃綠色，柄部及傷口處膨大時，準備待用。3)農桿菌的培養.-70°。冷凍保存的農桿菌￡^105:^81121活化后，在試管中加入含有50mg/L卡那霉素(Km)，50mg/L鏈霉素的YEB培養基5ml，28'C進行少量搖菌，至OD600二0.8-1.0，然后吸取1ml菌液加入不含抗生素的YEB培養基上大量培養至OD600=0.5。取10ml的菌液1000rpm離心10min，棄上清，用液體MS培養基(除了無瓊脂外，其它配方與表一的MS配方相同，)清洗沉淀2次，再用等體積的液體MS培養基懸浮沉淀，加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度為200Ug/L。待用。勺轉化步驟侵染培養預培養后外植體與含有AS的農桿菌懸浮液混合，在搖床上(轉速為120r/min)l(TC振蕩培養10min，棄多余農桿菌，用無菌濾紙吸干外植體上多余菌液，共培養然后放入固體共培養培養基(MS+6陽BA1.0mg/L+AS200ug/L)，28r黑暗培養2-3天，然后轉入芽篩選培養基(MS+BA3.0mg/L-[IAAO.lmg/L+Km100mg/L)誘導抗性叢芽。植物生長調節劑6-BA(6-芐氨基嘌呤)，IAA(3-吲哚乙酸)5)抗性叢芽和生根把經過共培養的外植體放入芽篩選培養基中，25i:培養16/8光照/黑暗2000lx。培養2周后繼代培養，每繼代一次減少培養基中6-BA含量1.0mg/L，減少芽的玻璃化，并統計產生芽的個數。產生多個小芽后可轉入芽卞長培養基中(MS+BAl.Omg/L+IAAO.lmg/L+Km100mg/L)，促進芽的生長。當芽長約l-3cm時，從基部切下l-3個芽，基部插入生根培養基誘導生根(1/2MS+IAA0.4mg/L)。西瓜子葉外植體轉入抗性芽篩選培養基后l-2d開始觀察農桿菌的污染情況。污染的外植體周圍逐漸長出一圈渾濁的細菌圈。實驗二，與實驗一相比，除了轉化步驟中，搖床上培養的溫度為15°C之外，所用子葉個數不相同外，其他條件都相同。8實驗三，與實驗一相比，除了轉化步驟中，搖床上侵染培養的溫度為2(TC之外，所用子葉個數不相同外，其他條件都相同。實驗四，與實驗一相比，除了轉化步驟中，搖床上侵染培養的溫度為25X:之外，所用子葉個數不相同外，其他條件都相同。實驗五，與實驗一相比，除了轉化步驟中，搖床上侵染培養的溫度為3crc之外，所用子葉個數不相同外，其他條件都相同。實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實驗結論從上表可以看出，隨著侵染溫度的升高，污染率逐漸增高。侵染溫度從10升高到30°C，污染率從0增加到37.2%。但是轉化率卻在15'C的時候最高，同時污染率比較底。所以，在本實驗中，侵染溫度保持在10-15。C之間，可以有效防止農桿菌污染西瓜子葉，同時保持較高的轉化率。實驗六用農桿菌侵染甜瓜子葉(l(TC)。與實驗一相比，除了所用的材料為甜瓜外，所用子葉個數不相同外，其它的條件都相同。實驗七與實驗六相比，除了在侵染培養中溫度為15'C外，所用子葉個數不相同外，其它條件都相同。實驗八與實驗六相比，除了在侵染培養中溫度為2(TC外，所用子葉個數不相同外，其它條件都相同。實驗九與實驗六相比，除了在侵染培養中溫度為25-C外，所用子葉個數不相同外，其它條件都相同。實驗十與實驗六相比，除了在侵染培養中溫度為3(TC外，所用子葉個數不相同外，其它條件都相同。實驗結果侵染溫度rc)子葉個數污染個數轉化率(％)裕憤《實驗六1012520.81.6實驗七1511939.72.5實驗八20121176.214實驗九25120423.335實驗十30121551.545.4本實驗六到十所用的甜瓜種子來源于市場購買的晴網品種。實驗結論從上表可以看出，隨著侵染溫度的升高，污染率逐漸增高。侵染溫度從10升高到30°C，污染率從1.6增加到45.4%。但是轉化率卻在15-C的時候最高，同時污染率比較底。所以，在本實驗中，侵染溫度保持在10-15。C之間，可以有效防止農桿菌污染西瓜子葉，同時保持較高的轉化率。權利要求1.一種用農桿菌生產瓜類轉基因植物的方法，其特征在于，它包括讓農桿菌在10-30℃下與瓜類植物外植體浸染培養5-30分鐘。2.如權利要求1所術的方法，其特征在于，所述的瓜類植物外植體為西瓜子葉或甜瓜子葉。3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的農桿菌的濃度為OD=0.5-0.8。4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，該方法還包括侵染培養后的共培養。5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，該方法還包括在侵染培養后除去外植體表面多余的農桿菌。6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的培養溫度為l(TC、15。C或20。C。7.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的侵染培養的時間為10-15分鐘。8.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的農桿菌處于懸浮狀態，并且與所述的瓜類植物外植體處于運動狀態。9.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的西瓜或甜瓜子葉在被農桿菌侵染前先經過預培養。全文摘要本發明提供一種用農桿菌生產瓜類轉基因植物的方法，它包括讓農桿菌在10-30℃下與瓜類植物外植體侵染培養5-30分鐘。在一個優選的實施方式中，侵染溫度為10-15℃之間，培養時間為10-15分鐘。利用該方法可以有效防止在后續培養中農桿菌對植物外植體所造成的污染，縮短獲得轉基因植物的周期，提高獲得轉基因植物的幾率，降低生產成本。文檔編號C12N15/82GK101260410SQ20081006027公開日2008年9月10日申請日期2008年4月14日優先權日2008年4月14日發明者任海英,麗方,王漢榮,王連平,茹水江申請人:浙江省農業科學院