專利名稱：一種干細胞體外衍生化肝細胞模型的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬發育生物學和藥理學領域，涉及一種模型的用途，具體涉及干細 胞體外衍生化肝細胞模型在肝臟發育能量代謝研究中的應用，可用于以過氧化 物酶體增殖激活受體為靶點的促細胞分化劑篩選。
背景技術：
小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES cell)體外定向分化為肝細胞體 系能模擬體內肝細胞形成和發育，富含大量肝臟發育依賴性生物信息。該系統 中肝細胞多種關鍵基因表達高于原代成熟肝細胞；具有白蛋白合成和氨降解功 能；代謝功能也比原代肝細胞強，維持時間長，因此無論結構還是功能均高度 模擬整體環境，該模型可用于肝臟發育學和組織工程研究，在藥學研究領域非 常適用于藥物調控各種基因、蛋白表達譜和與藥物代謝作用的研究。
過氧〈七物酶體增生物、激、活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)是由獨立基因編碼的一類孤兒核受體，屬于II型核受體超家族成員， 可調節眾多靶基因的轉錄過程，參與糖類、脂類代謝以及細胞增殖分化、炎癥 等多種病理生理過程。在低等脊椎動物和哺乳動物中存在3種亞型PPAR-a、 PPAR-j3 (又稱PPAR-S) 、 PPAR-y。這三個成員在表達模式，組織分布以及對 應的配體上都存在差異。PPAR-a主要在棕色脂肪組織、肝臟、腎臟、十二指 腸、心臟、骨骼肌和血管內皮細胞中表達，與控制脂蛋白代謝、脂肪酸氧化、 細胞攝入脂肪酸有關。PPAR-P組織分布廣泛，與脂質代謝和皮膚的平衡態有 關，還與動物的生殖發育，胚胎著床與發育等有關。PPAR-y在棕色和白色脂肪 組織中高度表達，與脂質代謝、血管炎癥和促成動脈粥樣硬化等有關，并在脂 肪分化和脂肪蓄積方面發揮著重要作用。上述大量研究表明調節脂質代謝和儲 存的大量相關基因都是受PPARs家族調控，除此之外，PPARs對某些細胞分 化的調節也有一定作用，如心肌細胞，神經細胞，脂肪細胞以及一些腫瘤細胞。 但對PPAR家族在肝臟生理和分化發育過程中的表達模式和作用所知甚少。
肝臟是能量需求旺盛的器官，肝細胞是線粒體數目豐富的一類細胞。隨著 肝臟組織不斷發育成熟，必然伴隨著線粒體數目上調和能量需求增加，任何干 擾線粒體形成的因素將會影響肝臟細胞的最終分化。線粒體的形成包括氧化磷酸化酶系表達，TCA循環形成以及脂肪p氧化酶系表達，而調控線粒體形成相 關基因轉錄和蛋白表達的主要是幾類核轉錄因子及其輔激活因子，其中包括 PPARs。 PPARs可以調節細胞的分化、增殖和生存。PPARs在肝臟脂質代謝功 能方面發揮重要調節作用，其功能改變與一些肝臟疾病的發生發展存在某種相 關性。小鼠ES細胞體外分化為肝細胞真實地重現了體內肝細胞分化過程，已 作為一個替代模型廣泛用于各種研究，迄今未見干細胞衍生化肝細胞模型在肝 臟發育能量代謝研究中的應用。
發明內容
本發明的一個目的是提供小鼠胚胎干細胞衍生化肝細胞模型在肝臟發育 能量代謝研究中的應用，是在利用肝臟發育能量代謝相關的PPARs家族表達譜 和功能揭示胚胎肝臟發育的生命現象本質中應用。即是利用干細胞衍生化肝細 胞模型闡明肝臟發育能量代謝相關的PPARs家族表達譜和功能，用于揭示胚胎 肝臟發育的生命現象本質。
所述應用是在篩選與評價調節肝臟能量供應的能量代謝誘導劑藥物中的 應用。可在以過氧化物酶體增殖激活受體為耙點的促細胞分化劑篩選中應用， 是用于構建以PPARs家族為靶點的高效率藥效篩選模型，進行調節肝臟能量供 應藥效初步篩選與評價，發現新一類促進干細胞分化為肝細胞的能量代謝誘導 劑。
本發明所述小鼠胚胎干細胞體外衍生肝細胞模型通過以下步驟構建采用 懸滴培養法，將ES細胞以600個細胞/30 ^滴的密度接種于培養皿蓋子內表面 上，然后翻轉蓋子，使蓋子上的小滴倒掛成懸滴，培養5天形成擬胚體 (embryoid body, EB)，再將EB轉移到放有用明膠包被的24孔板內進行貼壁 培養，此時開始用倒置顯微鏡每天觀察細胞，以捕捉肝細胞定向分化的形態變 化。同時采用免疫熒光法檢測肝細胞特異性蛋白表達，以白蛋白特異性染色確 定ES細胞分化而來的是肝細胞。
本發明在細胞層面上對干細胞衍生化肝細胞模型在肝臟發育能量代謝研 究中的應用做了論證，對其中蘊藏的大量生物學信息進行了初步探討，具體有 以下優點
1. 本發明開拓了干細胞衍生化肝細胞模型的一種新用途，即能作為肝臟發 育能量代謝研究的替代模型。
2. 本發明明確了肝臟線粒體能量系統發育相關的PPARs家族表達特征, 該模型可用于以PPARs為靶點的促肝細胞能量代謝分化劑篩選。
圖1為ES細胞衍生化肝細胞形態觀察。
圖2為JC-1染色檢測ES細胞向肝細胞分化過程中線粒體膜電位變化。 圖3為RT-PCR法檢測ES細胞分化過程中PPAR家族基因的表達。 圖4為ES細胞衍生化肝細胞白蛋白和PPAR-oc的表達。 具體實例方式
本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。此外應理解，下面的優選具體 實施方案僅僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
實施例l: ES細胞體外衍生化肝細胞模型通過以下步驟構建
1. 懸滴培養
將ES細胞用胰蛋白酶消化制成細胞密度為2xl(^個/ml的單細胞懸液，以 30 pl接種于直徑為10-cm的培養皿的蓋子內表面上，培養皿內加入10ml D-Hanks液，然后小心蓋上帶有許多小滴的蓋子，使蓋子上的小滴倒掛成懸滴 (每個懸滴約含600個細胞)，置培養箱中培養5d。分化培養液為高糖DMEM， 含0.1mmol.L"p-巰基乙醇，非必需氨基酸和20 %胎牛血清，不含LIF因子。
2. 貼壁培養
在顯微鏡下用吸管將懸滴培養形成的擬胚體(embryoidbody,EB)，轉移到 放有用明膠包被的24孔板內，使其吸附貼壁后，每孔中緩慢加入lml分化培 養液，此時開始用倒置顯微鏡每天觀察細胞，以捕捉肝細胞定向分化的形態變 化。將EB轉移至24孔板內記為dO。
3. 免疫熒光法檢測肝細胞特異性蛋白表達
樣本用純冷甲醇固定15 min， PBS清洗3遍，每次10 min。再用含10 % 胎牛血清PBS封閉30 min， PBS清洗3遍，每次5 min。然后加入一抗 Monoclonal rabbit anti-Albumin， l:50稀釋，4。C孵育過夜。PBS洗3次，每次 10min，吸干多余的液體，再力卩入二抗Rodamin畫Conjugated F(ab)2 fragment of Affinity Purified goat anti-Rabbit IgG， 1:200稀釋，37。C孵育1.5 h。再用PBS 洗3次，每次lOmin，吸干多余的液體，無熒光甘油封片后用熒光顯微鏡觀察， 拍照記錄。以白蛋白特異性染色確定ES細胞分化而來的是肝細胞。參見圖l， 其中(A)低倍鏡下的肝細胞，xlOO; (B)高倍鏡下的肝細胞，x400; (C)肝 細胞特異性白蛋白呈陽性表達，箭頭所指是典型的雙核肝細胞，x400。實施例2: ES細胞體外衍生化為肝細胞線粒體膜電位變化
收集ES細胞，EB經消化成單個細胞，EB貼壁培養分化成肝細胞樣本， 加入JC-1染料孵育15分鐘，用PBS洗三次，在熒光倒置顯微鏡下觀察。
結果顯示，ES細胞幾乎都呈現綠色熒光，提示線粒體膜電位低；EB經消 化后的細胞有紅色熒光出現，而經貼壁分化培養成的肝細胞幾乎都呈現紅色熒 光，這提示隨著肝細胞分化發育成熟，細胞膜電位隨著肝細胞線粒體的成熟逐 漸增高。參見圖2，其中(A)單個ES細胞，xl00; (B) EB經消化后單個 細胞，xl00; (C) EB貼壁培養分化第12天，x50; (D) EB貼壁培養分化 第12天，xl00; (E) EB貼壁培養分化第12天，x200。
實施例3: ES細胞體外衍生化為肝細胞時PPARs家族基因的表達
分別收集ES細胞，EB，貼壁分化第6， 12， 18天的肝細胞，按照Trizol reagent 說明書提取總mRNA。引物序列與實驗條件參見表1: 表1.引物序列和PCR反應條件
基因引物序列分子量 (bp)退火溫 度(°c)循環 輪數
GAPDH5，.陽TCC ATG CCA TGA CTG CCA CTC-3'2125835
5，'-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3'PPARa5，.-GGCTGTAAGGGCTTCTTT -3' 隱CAGGTAGGCTTCGTGGAT -3'13060.540
PPARp5，'-TTG AGC CCA AGT TCG AGT TTG-3'1005930
5，'-CGG TCT CCA CAC AGA ATG ATG國3'PPARy5，-AAT CAG CTC TGT GGA CCT CTC-3'4126135
5，-CTC CAA GAA TAC CAA AGT GCG A-3'PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察及拍照分析。
參見圖3，實驗結果顯示，PPAR-a,PPAR-(3和PPAR-Y基因在ES細胞向肝 臟細胞分化過程中均有表達，且均有一定程度的上調趨勢。
實施例4:免疫熒光實驗檢測ES細胞衍生化肝細胞中PPAR-ot的表達 收集貼壁分化d 18的ES細胞衍生化肝細胞樣本，用純冷甲醇固定10 min， 再用牛血清封閉處理30min，然后加入一抗(l)肝細胞特異性蛋白polyclonal goat anti-albumin, 1:50稀釋，(2) polyclonal rabbit anti-PPAR-oc， 1:50稀釋，4°C 孵育過夜。第二天加入二抗FITC- Conjugated mouse anti-goat IgG或 Rhodamine- Conjugated goat anti-Rabbit IgG， 1:200稀釋，37。C孵育1.5 h。無熒 光甘油封片后用熒光顯微鏡觀察，拍照記錄。參見圖4，結果顯示，ES細胞衍生化肝細胞白蛋白呈陽性表達區域PPAR-a 也呈陽性表達。圖4中(A)細胞核DAPI染色，x200; (B)肝細胞特異性白蛋白 (ALBUMIN)染色，陽性表達呈紅色熒光，x200; (C)過氧化物酶體增生物激活受 體alpha(PPAR alpha)染色，陽性表達呈綠色熒光，x200; (D) B圖和C圖的疊加， x200 。
實施例5:實時熒光定量PCR檢測PPARa激動劑對ES細胞體外衍生化 為肝細胞的影響
分別收集貼壁分化第12， 18天的肝細胞(溶劑對照組和PPAR(x激動劑 WY14643 1(^mol/L誘導組)，常規提取RNA，然后在0.2 ml PCR管中配制反 應溶液總RNA 3嗎，Oligo-dT (15 pg/^il) 0.5^1， dNTP mix (10 mmol/L) 1 jxl， 雙蒸水(DEPC) 10 pl，將反應管置于PCR儀中，65。C預變性5min。變性反 應結束后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應體系，將PCR管子置于PCR 儀中進行42。C保溫50min后，70。C變性15 min (滅活反轉錄酶)，4。C放置。 將cDNA稀釋100倍作為模板,加入引物和SYBR Green進行PCR擴增和熒光 標記反應。反應條件為50。C孵育2min，然后95°C 2 min;接著進行40個循 環，95°C， 15 s; 63°C， lmin。引物序列與實驗條件參見表2:
表2.引物序列和PCR反應條件
基因引物序列分子量 (bp)退火溫 度(°c)循環 輪數
GAPDH5，'-TCC ATG CCA TGA CTG CCA CTC-352205835
5，'-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3'PPARa;::-GGCTGTAAGGGCTTCTTT -3' -CAGGTAGGCTTCGTGGAT -3，13060.540
Albumin5，-GACTTTGCACAGTTCCTGGATACA -3' -TTGTGGTTGTGATGTTTAGGCTA -3'1255835
PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察及拍照分析。
目的基因表達值的計算法通過一系列的參數設定分析，得到不同樣本目
的基因的Ct值。Ct值的含義為每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經 歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線 性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。因為比較的是目的基因轉錄水平的差異， 所以通過檢測每個樣品的內參照基因，將目的基因歸一化。PCR產物的增長形 式為211， n就是循環數。先得到ACt (AC^目的基因Ct-內參照基因Ct)，再轉換為原始模板濃度Rati(^2 'Aa。
實驗結果顯示，根據上述公式計算出貼壁分化12天時溶劑組和PPARa激動 劑組的PPARa表達值分別為0.26士0.04, 0.43±0.09， Albumin表達值分別為 0.36±0.07， 0.58士0.09;而貼壁分化18天各樣本的PPARa表達值分別為0.30士0.10, 0.53±0.04， Albumin表達值分別為0.46士0.12， 0.66±0.03。 PPARa激動劑WY14643 誘導組的表達值比溶劑對照組明顯上調(尸<0.05)(參見表3)。以目的基因 和內參照基因濃度為橫坐標，以Ct值為縱坐標，繪制目的基因和內參照基因 PCR擴增標準曲線，標準曲線相關性良好。
表3經GAPDH校正過的目的基因相對表達值(；士s)_
分化時間 S3 組別 ^ Z^i
29.36±0.15~~1.92±0.10~~0.26±0.04~ 22.11±0.131.23±0.09 0.43±0.09* 24.09±0.111.48±0.09 0.36±0.07
16.76±0.090.79±0.14 0.58+0.09*
26.08±0.15 1.73±0.12 0.30±0.10
18.09±0.05 0.93±0.06 0.53±0.04*
21.01±0.12 1.12±0.13 0.46±0.12
15.08士0.1Q 0.59士0.10 0.66士0.03*
*尸<0.05 vs溶劑組
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最 大限度地應用本發明。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考， 就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的 上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等 價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
貼壁培養12天
貼壁培養18天
PPARa Albumin
PPARa Albumin
溶劑對照 PPARa激動劑 溶劑對照 PPARa激動劑
溶劑對照 PPARa激動劑 溶劑對照 PPARa激動劑
權利要求
1. 一種小鼠胚胎干細胞體外衍生化肝細胞模型的應用，所述小鼠胚胎干細胞體外定向分化為肝細胞模型通過以下步驟構建采用懸滴培養法，將小鼠胚胎干細胞以600個細胞/30μl滴的密度接種于培養皿蓋子內表面上，然后翻轉蓋子，使蓋子上的小滴倒掛成懸滴，培養5天形成擬胚體，再將擬胚體轉移到放有用明膠包被的24孔板內進行常規貼壁培養，用倒置顯微鏡每天觀察細胞，以捕捉肝細胞定向分化的形態變化，同時采用免疫熒光法檢測肝細胞特異性蛋白表達，以白蛋白特異性染色確定小鼠胚胎干細胞分化而來的是肝細胞。
2. 根據權利要求1所述的一種小鼠胚胎干細胞體外衍生化肝細胞模型的 應用，其特征是在利用肝臟發育能量代謝相關的過氧化物酶體增生物激活受體 家族表達譜和功能揭示胚胎肝臟發育的生命現象本質中應用。
3. 根據權利要求1所述的一種小鼠胚胎干細胞體外衍生化肝細胞模型的 應用，其特征是在篩選與評價調節肝臟能量供應的能量代謝誘導劑藥物中的應 用。
全文摘要
本發明提供一種小鼠胚胎干細胞體外衍生化肝細胞模型的應用，主要用于以過氧化物酶體增殖激活受體為靶點的促細胞分化劑篩選。也可利用干細胞衍生化肝細胞模型闡明肝臟發育能量代謝相關的PPARs家族表達譜和功能，揭示胚胎肝臟發育的生命現象本質。也可利用干細胞衍生化肝細胞模型，構建以PPARs家族為靶點的高效率藥效篩選模型，進行調節肝臟能量供應藥效初步篩選與評價，發現新一類促進干細胞分化為肝細胞的能量代謝誘導劑。本發明開拓了干細胞衍生化肝細胞模型的一種新用途，即能作為肝臟發育能量代謝研究的替代模型，明確肝臟線粒體能量系統發育相關的PPARs家族表達特征，可用于以PPARs為靶點的促肝細胞能量代謝分化劑篩選。
文檔編號C12N5/06GK101285051SQ20081006077
公開日2008年10月15日 申請日期2008年4月18日 優先權日2008年4月18日
發明者嚴潔萍, 吳佳瑩, 朱丹雁, 樓宜嘉, 沃燕波 申請人:浙江大學