專利名稱：一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌及其分離方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，涉及一株產角蛋白酶的粘金黃桿菌及其分離 方法。
背景技術：
角蛋白的化學結構穩定，不溶于水，不易被生物降解，是一種抗性很強的 硬性蛋白。在自然界中，角蛋白主要以動物的毛發、羽毛、鱗片、蹄和角等形 式存在。角蛋白不能被一般的蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶) 水解，高溫高壓處理角蛋白方法成本高、營養成分破壞嚴重、水解程度不均一。 角蛋白酶可特異性地降解角蛋白，篩選角蛋白酶的高產菌株對于角蛋白廢物的 回收利用和環境保護都有著重大的意義。
角蛋白酶能夠溫和高效地水解羽毛等角蛋白廢棄物，生產飼料、肥料。該 法生產的飼料節約能源、成本低、質量好，能夠較好的被動物利用。在含有角 蛋白的飼料中，添加角蛋白酶也可以提高動物對角蛋白的吸收利用，提高經濟 效益。角蛋白能夠選擇性的水解羊毛、皮革表面的角蛋白，有望取代傳統的羊 毛剝鱗和鞣革工藝，實現傳統產業的綠色環保改造。角蛋白酶能改善化妝品、 外用藥物在皮膚中的通透性，在醫藥、化妝品等工業都有著廣泛的應用前景。 產角蛋白酶的粘金黃桿菌C力2^ Z^^7^^ Z教保藏于中國微生物菌種保藏
管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2295。

發明內容
本發明的目的是提供一株產角蛋白酶的粘金黃桿菌及其分離方法。
產角蛋白酶的粘金黃桿菌a /ywo^"eri"/z7 保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2295。
所述的粘金黃桿菌形態學特征為菌體為桿狀，不產孢子，無運動性。革 蘭氏染色呈陰性，在營養瓊脂培養基上形成黃色群落。
粘金黃桿菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列為
GTGGATAGAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCAATGATCTGCTGCCTAGGGTAAAACAGGTAACTAGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAACC 粘金黃桿菌的全細胞水解脂肪酸含量為
脂肪酸種類 含量(％)
11:0 iso 3-OH 0.11
13:0 iso 1.89
Unknown 13. 566 2. 65
14:0 0.22
14:1 co 5c 0.39
15:0 iso 47.59
15:0 iso3-0H 2.89
15:0 anteiso 0.82
16:0 0.83
16:0 3-0H 0.59
16:0 iso 3-0H 0.21
16 N alcohol 0.15
Unkown 16.580 0.89
17:0 iso 1.14
17:0 iso 3—OH 13.9117:1 iso w9c 9.5
18:1 iso co5c 0.24
16:1 w7c/15 iso 2—0H 15. 7
17:1 iso I/antei B 0.29
產角蛋白酶的粘金黃桿菌的分離方法包括如下步驟
1) 分別取不同來源的含角蛋白廢棄物的污水5 10ml加入到50 200ml富 集培養基中，20 37flC、搖床轉速100 250rpm，富集培養24 72小時；
2) 取上述富集物5 10ml加入到50 200ml液體篩選培養基中，同樣條件 下培養，重復上述篩選步驟2 5次后，取10 50ul培養液稀釋后涂到固體篩 選培養基上；
3) 挑取單菌落，再在液體篩選培養基中培養，比較并選取角蛋白酶酶活較
高的菌株。
所述的富集培養基的成份為每1000毫升中含NaC15 10克、牛肉膏5 10克，蛋白胨5 10克和水900 1000毫升。
所述的液體篩選培養基的成份為每IOOO毫升中含羽毛粉10 100克、K2P04 2 6克、NaH2P04 2H20 2 6克、MgCl2 6H20 0. 1 5克和水900 1000毫升。
所述的固體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉10 100克、K2P04 2 6克、NaH2P04 2H20 2 6克、MgCl2 6H20 0. 1 5克、水900 1000毫升 和10 20克瓊脂粉。
經與其他菌種和分離方法比較、反復試驗驗證，本發明的優點是
1) 所述的粘金黃桿菌產角蛋白酶所需的發酵周期短、角蛋白酶活高、操 作過程簡便、發酵成本低、后處理步驟簡單。
2) 所述的粘金黃桿菌角蛋白酶對羽毛降解效率高，降解后的產物營養成 份均一，氨基酸含量高，在畜牧業和飼料業應用前景好。
3) 所述的粘金黃桿菌角蛋白酶對于羊毛織物和皮革表面有明顯的降解作 用，用于毛紡工業能夠降低污染、提高產品性能、增加產品的附加值。
4) 所述的菌種產生的角蛋白酶切割活性較廣，可用于消化蛋白，在分子 生物學、細胞生物學有著廣泛的應用前景。
5) 所述的分離方法簡單有效，針對性強，假陽性結果少的優點。


附圖是粘金黃桿菌C力2yseWa"e77'鵬Z卯的16SrDNA序列系統進化分析實例示意圖。
具體實施例方式
實施例1
1) 取含有羽毛廢棄物的污水5ml，加入到50ml富集培養基中，30°C， 200rpm， 富集培養72小時；富集培養基的成份為每1000毫升中含NaCl 5克、牛肉膏 5克，蛋白胨5克和水980毫升。
2) 取上述富集培養物5ml，加入到50ml液體篩選培養基中，同樣條件下培 養，重復上述篩選步驟3次后，取10ul培養液稀釋后涂到固體篩選培養基上。 固體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉20克、K2P04 4克、 NaH2P04 2H20 2克、MgCl2 6H20 0. 2克、瓊脂粉20克和水980毫升。
3) 挑取單菌落，再在液體篩選培養基中培養，比較并選取角蛋白酶酶活較 高的菌株。液體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉20克、K2P04 4 克、NaH2P04 2H20 2克、MgCl2 6H20 0 . 2克和水980毫升。
實施例2
1) 取含有羊毛廢棄物的污水10ml，加入到100ml富集培養基中，30°C， 200rpm，富集培養48小時；富集培養基的成份為每1000毫升中含NaCl 10 克、牛肉膏6克，蛋白胨6克和水980毫升。
2) 取上述富集培養物10ml，加入到100ml液體篩選培養基中，同樣條件下 培養，重復上述篩選步驟5次后，取20u 1培養液稀釋后涂到固體篩選培養基 上。固體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉40克、K2P04 5克、 NaH2P04 2H20 2克、MgCl2 6H20 0. 3克、瓊脂粉15克和水980毫升。
3) 挑取單菌落，再在液體篩選培養基中培養，比較并選取角蛋白酶酶活較 高的菌株。液體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉40克、K2P04 5 克、M2P04 2H20 2克、MgCl2 6H20 0. 3克和水980毫升。
實施例3
1) 取含有頭發廢水5ml,加入到100ml富集培養基中，25eC， 200rpm,富 集培養72小時；富集培養基的成份為每1000毫升中含NaC110克、牛肉膏5 克，蛋白胨5克和水980毫升。
2) 取上述富集培養物10ml，加入到100ml液體篩選培養基中，同樣條件下 培養，重復上述篩選步驟4次后，取30U 1培養液稀釋后涂到固體篩選培養基 上。固體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉30克、K2P04 4克、 NaH2P04 2H20 2克、MgCl2 6H20 0. 5克、瓊脂粉20克和水980毫升。3)挑取單菌落，再在液體篩選培養基中培養，比較并選取角蛋白酶酶活較
高的菌株。液體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉300克、K2P044 克、NaH2P04 2H20 2克、MgCl2 6H20 0 . 5克和水980毫升。
實施例4:粘金黃桿菌6y /yseo力a"eri鵬Z卯，CGMCC No. 2295與其他粘金黃 桿菌形態及理化特征的比較鑒定如下
菌禾中名禾爾1， CArj^eo^acteriw/z 2， C 歷e/ i/^09(9/7tic"727 (n二49) ; 3， C 6fe/7〃^z7; 4， C G^e^/e/ 5161 5， G 附y j'〃e/zse; 6， C z^'ra/ 67Lse;括號中的 數字表示發現的菌株數目。+，陽性；W，弱陽性；-，陰性；NA，未知.
Characteristic Growth on/at:
MacConkey agar
5°C
37°C
42 °C
Nitrate reduction Nitrite reduction Hydrolysis of:
Aesculin
Starch Production of:
Hydrogen sulphide
Indole Acid production from:
L一Arabinose
D-Cellobiose
D-Glucose
D—Lactose
D-Maltose
Sucros6
D-Mannitol
1 2 3 4 5 6
+ + — — w NA
一 一 一 一 + +
+ + + + + +
—— + — 一 +
—— —— —NA
一 + + — NA —
+ 47/49 + NA NA NA
—一 + + + +
w — - NA NA -
—24/49 + — — +
—1/49 — w — +
w 4/49 w + - +
+ + + + + —
-27/49 - NA - NA
+ 46/49 + + ——
—— —— —NA
一 31/49 — NA - NAD-Trehalose + 42/49 + ++ -
D-Xylose — 3/49— w — NA
實施例5:粘金黃桿菌OLTj^eoZ^cz^n'^ CGMCC No. 2295與其他粘金黃
桿菌的全細胞脂肪酸比較分析如下
菌禾中名稱禾口編號1， CA rseo力3"erj'"http://7乙P9; 2, C /z7e/^/7^0sepz^c〃y27; 3， C tai脂/ e/ se; 4， Bergeyella zoohelcum; 5， C. wanjuense; 6， C. defluvii ， tr，微量(<1 %) ; ND，未檢出
FATTY ACID123456
13:0 iso1.91. 41.0±0. 11. 5tr2.8
Unknown 13. 566*2. 71. 52. 6±0. 11.82.9tr
14:0trNDNDNDNDND
14:1 w5ctrNDNDNDNDND
15:0 iso47.641. 243.2±0. 747.840.058.5
15:0 iso 3-0H2.93.53.84.03.72.6
15:0 anteisotr2.21.0±0. 1NDtr3,2
16:0trtr1.4±0. 1trtr1.3
16:0 3-OHtr2.2trNDNDtr
16:0 iso 3-OHtrtrND1.2trtr
16 N alcoholtrNDNDNDNDND
Unkown 16.580tr1. 70.8±0.21.4NDtr
17:0 2-OHNDtrtrNDND0,3
17:0 iso1. 1tr1.3±0. 1ND2.92.0
17:0 iso 3-OH13.916.316.6±1. 113.521.914. 1
17:1 iso w9c9.57.017. 5±0, 219,511.74.8
18:1 iso co5ctrtrNDNDNDND
Summed feature 3t15. 718.07.9±0. 19.011.08.4
Summed feature 4ttrtrND1.5NDND
*未知脂肪酸
t Summed feature 4包括15 : 0 iso 2-OH and/or 16 : lv7c/t. Summed feature 5包括17 : 1 iso I and/or 17 : 1 anteiso B.
實施例5:粘金黃桿菌C力zyseoZ s"eW證Z卯，CGMCC No. 2295的16SrDNA序列的系統進化分析實例見附圖1:
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本
發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。
本發明n」用其他的不違背本發明的精神和主要特征的具體形式來概述。因
此，無論從哪一點來看，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明 而不能限制本發明，權利要求書指出了本發明的范圍，而上述的說明并未指出 本發明的范圍，因此，在與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改 變，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。
權利要求
1. 一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌Chryseobacterium L99，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2295。
2. 根據權利要求1所述的一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌，其特征在于所述 的粘金黃桿菌形態學特征為菌體桿狀，不產孢子，無運動性。革蘭氏染色呈 陰性，在營養瓊脂培養基上形成黃色群落。
3. 根據權利要求1所述的一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌，其特征在于所述 的粘金黃桿菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列為GCTGCCTAGGGTAAAACAGGTAACTAGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAACC
4.根據權利要求1所述的一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌，其特征在于所述的 粘金黃桿菌的全細胞水解脂肪酸組成為4.脂肪酸種類含量(％)11:0 iso 3-OH0. 1113:0 iso1. 89Unknown 13.5662.6514:00. 2214:1 w5c0. 3915:0 iso47, 5915:0 iso3-OH2.8915:0 anteiso0.8216:00.8316:0 3-OH0. 5916:0 iso 3-OH0. 2116 N alcohol0. 15Unkown 16.5800.8917:0 iso1. 1417:0 iso 3-OH13.9117:1 iso w9c9.518:1 iso "5c0. 2416:lw7c/15 iso 2-OH15.717:1 iso I/antei B0.29
5. —種產角蛋白酶的粘金黃桿菌的分離方法，其特征在于包括如下步驟1) 分別取不同來源的含角蛋白廢棄物的污水5 10ml加入到50 200ml富 集培養基中，20 37°C、搖床轉速100 250rpm、富集培養24 72小時；2) 取上述富集培養物5 10ml加入到50 200ml液體篩選培養基中，同樣 條件下培養，重復上述篩選步驟2 5次后，取10 50ul培養液稀釋后涂到固 體篩選培養基上；3) 挑取單菌落，再在液體篩選培養基中培養，比較并選取角蛋白酶酶活較高的菌株。
6. 根據權利要求5所述的一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌的分離方法，其特 征在于所述的富集培養基的成份為:每1000毫升中含NaCl 5 10克、牛肉膏5 10克，蛋白胨5 10克和水900 1000毫升。
7. 根據權利要求5所述的一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌的分離方法，其特征在于所述的液體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉10 100克、K2P04 2 6克、NaH2P04 2H20 2 6克、MgCl2 6H20 0. 1 5克和水900 1000
8.根據權利要求5所述的一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌的分離方法，其特 征在于所述的固體篩選培養基的成份為每1000毫升中含羽毛粉10 100克、 K2P04 2 6克、NaH2P04 2H20 2 6克、MgCl2 6H20 0. 1 5克、水900 1000毫升和瓊脂粉10 20克。
全文摘要
本發明公開了一種產角蛋白酶的粘金黃桿菌及其分離方法。所述粘金黃桿菌拉丁名為Chryseobacterium L99，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2295。本發明公開了該菌的形態學特征為菌體桿狀，不產孢子，無運動性，革蘭氏染色呈陰性。本發明公開了該菌的全細胞脂肪酸主要成份為十三甲基十四酸47.59％，二羥基-13-甲基十四酸和(或)Ω-7-順式-13甲基-十五酸15.72％，三羥基-15-甲基十六酸13.91％，Ω-9-順式-14甲基棕櫚酸9.48％。本發明還公開了該菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列。本發明公開的分離方法包括三個步驟普通營養培養基富集培養，以角蛋白為唯一碳氮源固體培養基初篩，以角蛋白為唯一碳氮源液體培養基的復篩。該方法快捷有效，所得菌種產酶能力強。
文檔編號C12N1/20GK101298602SQ20081006063
公開日2008年11月5日 申請日期2008年4月15日 優先權日2008年4月15日
發明者呂龍賢, 宏 周, 李永泉, 杰 閔 申請人:浙江大學