專利名稱：放射線劑量的生物檢測用報告質粒及其構建方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種基因質粒及其構建方法，即放射線劑量的生物檢測 用報告質粒及其構建方法。
背景技術：
電離輻射對健康的危害和輻射安全評估，各種條件下的急、慢性輻射損傷的分類、診斷 和治療等都需要了解和確定受照射的劑量。放射線劑量的生物檢測是利用生物材料如組織、 細胞、DNA、蛋白質等在電離輻射后發生的、與輻射劑量存在的一定量一效關系的某個方面 的改變，利用這種可測、可記錄和分析的生物改變來度量輻射劑量的一類生物標記物及分析 方法。與物理檢測相比，利用生物進行劑量檢測的最大優勢是直接和忠實代表性。
目前進行放射線劑量的生物檢測的方法很多，常用的有放射線照射后DNA損傷而形 成的彗星尾與未受損的細胞表現的彗星核心之間的關系來研究預測放射線劑量的單細胞凝膠 電泳(慧星試驗)法(Berwick and Vineins, 2000):也有通過調查射線照射后的細胞所引起 的染色體的雙著絲粒、交換或易位等損傷指標來估算放射線劑量的染色體畸變分析法 (Ballarini and Ottolenghi, 2003; Duran W W,， 2002; Camparoto " a〖.，2003 )，但這些方法的共 同缺點是存在操作復雜、檢測的成本較高、損傷觀察時人為因素較多、很難準確定量等缺點； 雖通過計算機等輔助手段的利用可以適當提高其度量的精度，但這些方法只能對低劑量的放 射線進行檢測和度量，對于高劑量放射線的生物檢測和度量的方法目前還沒有。迫切需要有 一種使用方便、精確度高，同時又能對高劑量的放射線進行生物檢測的方法。

發明內容
本發明的目的是公開一種放射線劑量的生物檢測用報告質粒以及這種生物測定用報告 質粒的構建方法。以及這種放射線劑量的生物檢測用報告質粒的應用。
本發明的這種放射線劑量的生物檢測用報告質粒是以抗輻射菌一大腸桿菌間的穿梭載 體為基礎，與具有北美產螢火蟲(P/zorim^ ;^rafc)的寄主DNA由來的熒光素酶基因lux領 域的DNA片段重組，構建成具有熒光素酶基因的抗輻射菌一大腸桿菌間穿梭載體報告質粒。
具體構建方法為以下步驟 (1)穿梭載體質粒的構建
用QIAfilter Plasmid kit (德國QIAGEN)從抗輻射菌De/"ococc^ rad/o/wg"a/M中提取質 粒pUE30并進行Sphl酶切，用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復制開始領域、大腸桿
菌中有活性的Amp抗性基因、抗輻射菌Z)e!力ococow ra&o^ra朋中有活性的氯霉素抗性基因 的質粒pKatCAT，再與上述pUE30的Sphl消化物混合，用DNA連接酶連接，采用電穿孔法 將上述連接物轉化大腸桿菌JM109株，從抗Amp的轉化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連 接的質粒的株，獲得穿梭載體質粒。 (2)報告質粒的構建
在上述穿梭載體質粒的Mfe I酶切位點插入熒光蛋白酶基因丄wc+，構建成質粒；設計包 含限制性內切酶A^e I位點的DNA損傷修復基因wc A的啟動子的引物，PCR增幅DNA損 傷修復基因wcA的啟動子，將上述PCR產物順向插入上述質粒的熒光蛋白基因丄wcf上游的 iV&I部位，由此形成測定用的報告質粒。
所述DNA損傷修復基因A的啟動子的引物序列為
SEQ ID NO 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat
SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga
本發明放射線劑量的生物檢測用報告質粒的應用
將上述測定用的報告質粒轉化抗輻射菌的野生型Rl中，獲轉化體抗輻射菌，供Y-射線 照射。將轉化體抗輻射菌培養到穩定期，用Y-射線進行照射，照射后再進行培養，以性狀轉 化體的發光量為依據，測定不同劑量Y-射線照射后的發光量。不同劑量射線照射后得到不同 的發光量。
本發明的優點
本發明能解決現有技術放射線劑量生物檢測法的各種問題。如能夠提高劑量檢測的精 確度，已有的單細胞凝膠電泳(慧星試驗)法及染色體畸變分析法的操作復雜、檢測時人為 因素較多、很難準確定量；而本發明的報告質粒根據熒光量的有無及熒光量的多少就能正確
進行定性和定量。其次，單細胞凝膠電泳(慧星試驗)法及染色體畸變分析法等只能對低劑
量的放射線進行定量，不能對高劑量的放射線進行定量；而本發明的報告質粒除能對低劑量 的放射線進行定量外，對于高劑量的放射線也能進行定量。同時，本發明的報告質粒在抗輻 射菌中具有高熒光素酶活性，可實時監控重組轉化子的生育狀況等。 本發明的應用前景
本發明的報告質粒可作為高、低放射線劑量的生物檢測，可以廣泛應用于核發電站等核 設施、醫院等放射線照射設施及其他具有放射源場所的檢測，也可應用于環境中放射性物質 的污染檢測，同時可作為一個生物感應器來感應多種DNA損傷劑。本發明的報告質粒具有 熒光素酶基因，在實時監控重組轉化子的生育、分布及對環境的影響等方面也非常有用。
具體實施例方式
以下根據實施例詳細介紹本發明，本發明沒有限定這些實施例。 (1)穿梭載體質粒的構建
從抗輻射菌(De/"ococcus racfo; wg"a"ce ATCC19172)中提取質粒pUE30并進行Sphl酶 切；接著用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復制開始領域、大腸桿菌中有活性的Amp 抗性基因、抗輻射菌rat//o^/raM Rl中有活性的氯霉素抗性基因的質粒pKatCAT (Funayama等，Mutat. Res,, 435: 151-161, 1999)，再與上述pUE30的Sphl消化物混合，用 DNA連接酶連接。采用電穿孔法將上述連接物轉化大腸桿菌JM109株。從抗Amp的轉化株 中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的質粒的株，得到穿梭載體質粒。
(2) 報告質粒的構建
以抗輻射菌Z)e/wococa^ ra^'o^ra似的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示的堿基序列(根據Meima等的論文自行設計，J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001)合成 的DNA為引物，用Pfo Turbo DNA polymerase (Stratagene)進行PCR反應，增幅Meima 等(J. Bacteriol. 183: 3169-3175， 2001)記載的在抗輻射菌De/"ococciw rado血rara中具有活 性的已知的groEL啟動子領域。然后用Ncol內切酶消化含有熒光素酶基因的質粒pSP-lux+ (Promega)，用T4 DNA polymerase (Takara)進行DNA斷片末端的平滑化。最后，將上述 的PCR產物與平滑化的pSP-lux+連接，得到pGroE-lux。
用HindIII消化上述質粒，進行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV進行消化，得到 含有groEL啟動子和熒光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA片斷插入步驟1所獲穿梭載體 質粒的EcoRV部位，構建具有熒光素酶基因的質粒，用構建的熒光素酶基因質粒轉化 Z)e&ococrasgram;fe，得到具有熒光素酶基因的菌株。
(3) 熒光素酶活性的測定
將上述得到的重組轉化子在TGY培養基中3(TC培養，然后進行不同劑量Y-射線照射， 再繼續培養，24 hr后將培養液10 |aL與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution (Promega) 混合，1分鐘后用Lumi Imager (Roche Molecular Biochemicals)測定1分鐘間的化學發光活性。 由測定得知，不同劑量射線照射后菌體的發光量不同，照射劑量與發光量之間的相關系數達 0.892 (達極顯著水平)。 使用方法及其效果
將含有放射線劑量生物檢測用報告質粒的抗輻射菌培養于玻璃容器內，將該容器放在需 要測定的地方，被曝一定時間后取回容器，再在30。C條件下繼續培養24hr。取培養液10nL 與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution(Promega)混合，1分鐘后用Lumi Imager (Roche MolecularBiochemicals)測定1分鐘間的化學發光活性。根據發光量的多少就可以估算被測地 的放射性劑量。
根據研究結果，在使用的0-2000 Gy的劑量范圍內，不同劑量gamma-射線照射后菌體的 發光量與照射劑量之間的相關系數為0.892，達極顯著水平。
序列表
<110>浙江大學
<120>放射線劑量的生物檢測用報告質粒及其構建方法 <160> 2
<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA損傷修復基因rec A的啟動子的引物序列 <400> 1
ttgtcagctt cggtcagttg acat 24
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA損傷修復基因rec A的啟動子的引物序列 <400> 2
tggggtcctc ctgtgagtga 20
權利要求
1、放射線劑量的生物檢測用報告質粒，其特征在于以抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體為基礎，與具有北美產螢火蟲(Photinuspyralis)的寄主DNA由來的熒光素酶基因luc領域的DNA片段重組，構建成具有熒光素酶基因活性的抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體的報告質粒。
2、 如權利要求1所述放射線劑量的生物檢測用報告質粒的構建方法，其特征在于以下步驟:(1) 構建穿梭載體質粒用QIAfilter Plasmid kit從抗輻射菌De/"ococc附ra&opwg加ra中提取質粒pUE30并進行 Sphl酶切，用SpM分別消化包含有大腸桿菌載體pUC19復制開始領域、大腸桿菌中有活性 的Amp抗性基因、抗輻射菌D""ococc^ ra&o^rara中有活性的氯霉素抗性基因的質粒 pKatCAT，再與上述pUE30的SphI消化物混合，用DNA連接酶連接，采用電穿孔法將上述 連接物轉化大腸桿菌JM109株，從抗Amp的轉化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的 質粒的株，獲得穿梭載體質粒；(2) 構建報告質粒在上述穿梭載體質粒的A^el酶切位點插入熒光蛋白酶基因Z"c+，構建成質粒；設計包 含限制性內切酶AWe I位點的DNA損傷修復基因mc A的啟動子的引物，PCR增幅DNA損 傷修復基因wcA的啟動子，將上述PCR產物順向插入上述質粒的熒光蛋白基因i:恥+上游的 iV&I部位，由此形成測定用的報告質粒。
3、 如權利要求2所述放射線劑量的生物檢測用報告質粒的構建方法，其特征在于所述DNA 損傷修復基因wc A的啟動子的引物序列為SEQ ID NO 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga 。
全文摘要
放射線劑量的生物檢測用報告質粒及其制備方法，以抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體為基礎，與具有北美產螢火蟲的寄主DNA由來的熒光素酶基因lux領域的DNA片段重組，構建成具有熒光素酶基因活性的抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體的報告質粒。將報告質粒轉化抗輻射菌的野生型R1中，獲轉化體抗輻射菌，供γ-射線照射。將轉化體抗輻射菌培養到穩定期，用γ-射線照射后再培養，以性狀轉化體的發光量為依據，測定不同劑量γ-射線照射后的不同發光量。研究結果，在使用的0-2000Gy的劑量范圍內，不同劑量γ-射線照射后菌體的發光量與照射劑量之間的相關系數為0.892，達極顯著水平。
文檔編號C12Q1/02GK101348822SQ20081006191
公開日2009年1月21日 申請日期2008年5月27日 優先權日2008年5月27日
發明者屠振力 申請人:浙江大學