專利名稱：一種新的細胞懸浮培養生產重組人促紅細胞生成素的方法
技術領域：
本發明涉及重組人促紅細胞生成素生產過程中的細胞培養方法， 尤其是馴化生產細胞株適應無血清培養，用一次性袋式激流反應器對 細胞進行懸浮培養，提高細胞生長密度，縮短生產周期，降低生產成 本，減少污染，從而高效生產重組人促紅細胞生成素。
技術背景紅細胞生成素是一種糖蛋白激素，分子量約34kD。血漿中存在的 促紅細胞生成素由165個氨基酸組成，糖基化程度很高，糖基成分主 要是唾液酸。根據碳水化合物含量不同，天然存在的促紅細胞生成素 分為兩種類型，a型含34%的碳水化合物，3型含26%的碳水化合物。 兩種類型在生物學特性、抗原性及臨床應用效果上均相同。人類促紅 細胞生成素基因位于7號染色體長22區，1985年其cDNA被成功克隆。紅細胞生成素主要由腎小管內皮細胞合成，也可由肝細胞和巨噬細胞 產生。促紅細胞生成素是一種強效的造血生成因子，在0.05 lU/ml 時即呈劑量依賴效應。促紅細胞生成素活性單一，只作用于骨髓巨核 前體細胞，可刺激紅祖細胞及早幼紅細胞形成成熟的紅細胞集落；對 紅細胞造血過程的調節需其他細胞因子(如IL-3、 GM-CSF和IL-l等) 的協同作用才能完成。促紅細胞生成素的產生受機體內血容量和氧分 壓的調節，在失血或低氧的刺激下，促紅細胞生成素水平迅速上升。 在某些腫瘤患者，可也現促紅細胞生成素異常增高；骨髓造血反應不 良的貧血患者，其促紅細胞生成素也升高。重組人促紅細胞生成素是 通過基因工程克隆人的重組人促紅細胞生成素基因，由CHO細胞發酵表達的有生物學活性的蛋白，其具有與人體內源性促紅細胞生成素相 似的生物學功能。目前，在培養基應用方面，重組人促紅細胞生成素生產細胞株主 要在含有8 10%牛血清的培養基中進行擴增培養，細胞擴增到一定量 后換為無血清培養基進行培養。其中，血清有很多不足的地方，比如1. 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及 其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂 類等尚未充分認識，這給純化工作帶來許多困難。2. 血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期 只有一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使生產的標準化和連續性受到限制。3. 動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其 成分不能保持一致。4. 取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能 導致生產失敗或生產結果不可靠性。5.大規模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養的生產成本的主要部分之一。無血清培養基質量相對更加穩定，可提高細胞培養和實驗結果的 重復性。避免了血清源性污染。可提高產品的表達水平并使細胞產品 易于純化，目前市面上有很多無血清培養基可供選擇。當細胞在有血清培養基中貼壁生長時細胞必須貼附在基質的表 面上才能生長， 一但細胞長成單層，因為細胞間的接觸抑制，細胞不 再增殖。這樣細胞貼壁生長時的細胞密度取決于貼附基質表面積的大小，每平方厘米表面積可以容納1 5X1()5個細胞，因此，在方瓶和 轉瓶培養中，細胞密度一般只能在l 5Xl(f細胞/毫升之間。在采用 了微載體或片狀載體的生物反應器中，細胞密度可達1 2乂107細胞/然而，在無血清培養基中，細胞經馴化可以進行懸浮培養，細胞 密度主要取決于培養基的營養程度，因此，理論上講，只要有足夠的 營養，細胞密度可以無限大。目前，對于不同的無血清培養基，細胞密度可以達到O. 5 1 X 108細胞/毫升之間。I i l旨，重組人促紅細胞生成素生產主要使用的是NBS生物反應器 (或轉瓶)，在罐體中加入微載體進行貼壁灌流培養，培養周期在2 個月左右，重組人促紅細胞生成素表達量為10mg/L，這種培養方式由 于罐體體積小，微載體量有限，細胞密度較低，重組人促紅細胞生成 素表達量低，培養周期較長，生產成本高。 發明內容本發明中所述的一次性袋式激流反應器是指哈爾濱安普科技發展有限公司申請的專利《 一 種細胞懸浮培養罐》(申請號200710130135. X)所述相關產品。本發明的目的是提供一種細胞密度高，容易放大，生產周期短， 表達量高的重組人促紅細胞生成素生產方法。本發明通過馴化重組人 重組人促紅細胞生成素表達細胞株，使之能在無血清培養基中懸浮生 長，從而改變了細胞培養的方式，達到高密度培養細胞，大規模生產 重組人促紅細胞生成素。本發明提供了細胞懸浮培養生產重組人促紅細胞生成素的方法，該方法包括如下步驟a) 重組人促紅細胞生成素表達細胞株在較小的搖瓶中無血清培 養；b) 當細胞生長到一定密度時，接種到較大的搖瓶或激流反應器的 袋子中無血清培養；C)使細胞增殖，表達；d)純化收獲重組人促紅細胞生成素。本生產方法沒有使用血清，培養基質量穩定，能夠提高產品產量。 由于用一次性袋式激流反應器懸浮培養，細胞生長不受貼附表面積的 限制，細胞密度遠遠高于貼壁生長(5 10倍)，重組人促紅細胞生成 素表達量高，容易放大，降低了生產成本，避免了血清的污染。
具體實施例方式在很多情況下，細胞是在有血清中保存的，需要對細胞進行馴化， 使其適應在無血清中懸浮生長，馴化是本領域很常規的技術，具體步驟如下先用含有血清(胎牛血清)的培養基(DMEM培養基)傳代細 胞幾次，然后取處于對數生長期的細胞制成懸液，接到無菌搖瓶中， 適宜的接種密度為1 5乂105細胞/毫升，搖床的速度為100-400rmp， 適宜的速度為200-300rmp，當細胞密度達到1 5X 106細胞/毫升時， 進行細胞傳代。最佳傳代密度為2 3X106，按l: 3傳代，當細胞在 無血清中生長速度，與含有血清中生長速度接近時，就實現了細胞的 馴化。本發明對設備，試劑沒有特殊要求。下面通過實施例進一步說明本發明，對本發明不夠成限制。 實施例l從細胞庫中復蘇一支重組人促紅細胞生成素細胞株，用DMEM培養 基加10%胎牛血清傳代兩次，當細胞處在對數生長期時，用胰蛋白酶 消化，加血清終止消化，1000rmp ， 5分鐘，離心，去上清，加入無 血清培養基(哈爾濱安普科技發展有限公司提供)，把細胞制成懸液， 接種到無菌搖瓶中，每瓶培養基體積為50毫升，接種細胞密度為3X 10，胞/毫升，搖床速度為200r即，當細胞密度達到2 3X1()6細胞/ 毫升，按l: 3傳代，傳代5 6次時，當細胞在無血清中生長速度，與 含有血清中生長速度接近，凍存細胞。建立種子細胞庫。 實施例2從細胞庫中復蘇一支重組人促紅細胞生成素細胞株，用DMEM培養 基加10%胎牛血清傳代兩次，當細胞處在對數生長期時，用胰蛋白酶 消化，加血清終止消化，1000r即，5分鐘，離心，去上清，加入無血 清培養基(GIBCO公司CHO無血清懸浮培養基)，把細胞制成懸液，接 種到無菌搖瓶中，每瓶培養基體積為50毫升，接種細胞密度為3X105 細胞/毫升，搖床速度為200rmp，當細胞密度達到2 3X 106細胞/毫 升，按l: 3傳代，傳代5 6次時，當細胞在無血清中生長速度，與含 有血清中生長速度接近，凍存細胞。建立種子細胞庫。 實施例3從細胞庫中復蘇一支重組人促紅細胞生成素細胞株，用DMEM培養 基加10%胎牛血清傳代兩次，當細胞處在對數生長期時，用胰蛋白酶 消化，加血清終止消化，1000rmp， 5分鐘，離心，去上清，加入無血 清培養基(SAFCBioscience公司的無血清懸浮培養基)，把細胞制成 懸液，接種到無菌搖瓶中，每瓶培養基體積為50毫升，接種細胞密度為3Xl(f細胞/毫升，搖床速度為200rmp，當細胞密度達到2 3X 106 細胞/毫升，按l: 3傳代，傳代5 6次時，當細胞在無血清中生長速 度，與含有血清中生長速度接近，凍存細胞。建立種子細胞庫。 實施例4本實施例中所用培養基為哈爾濱安普科技發展有限公司提供，對 袋子(20L)進行咖嗎射線消毒，加入培養基為哈爾濱安普科技發展 有限公司提供無血清培養基10L，并接種實施例l中所得的種子細胞， 接種密度為4乂105細胞/毫升，在37度，轉速為200r即下進行培養， 流加濃縮培養基(哈爾濱安普科技發展有限公司提供無血清培養基)， 每天測糖，保證糖含量在0.5 lg/L，以保細胞營養充足。培養5 8天后，細胞密度可以達到3 8Xl()7細胞/毫升，繼續培 養2 3天收獲上清，進行純化，重組人促紅細胞生成素表達量達到 25000IU/ml，而貼壁培養為5000 10000IU/ml，其他指標都有提高。 實施例5本實施例中所用培養基為哈爾濱安普科技發展有限公司提供，對 袋子(40L)進行咖嗎射線消毒，加入培養基為哈爾濱安普科技發展 有限公司提供無血清培養基20L，并接種實施例l中所得的種子細胞， 接種密度為4Xl(f細胞/毫升，在37度，轉速為200rmp下進行培養， 流加濃縮培養基(哈爾濱安普科技發展有限公司提供無血清培養基)， 每天測糖，保證糖含量在0.5 lg/L，以保細胞營養充足。培養5 8 天后，細胞密度可以達至1」3 8乂107細胞/毫升，繼續培養2 3天收獲 上清，進行純化，重組人促紅細胞生成素表達量達到25000IU/ml，而 貼壁培養為5000 10000IU/ml，其他指標都有提高。
權利要求
1、細胞懸浮培養法生產重組人促紅細胞生成素。
2、 根據權利要求1，其特征在于培養基使用的是無血清懸浮培養基。
3、 根據權利要求l，其特征在于使用一次性袋式激流反應器。
全文摘要
本發明涉及重組人促紅細胞生成素生產過程中的細胞培養，尤其是馴化重組人促紅細胞生成素生產細胞株適應無血清培養，使用一次性袋式激流反應器對細胞進行大規模懸浮培養，提高細胞生長密度，從而高效生產重組人促紅細胞生成素。本方法可提高批生產量，縮短生產周期，減少成本，降低污染。
文檔編號C12N5/10GK101597633SQ20081006465
公開日2009年12月9日 申請日期2008年6月3日 優先權日2008年6月3日
發明者冷國慶, 李會成, 李鄭武, 棟 楊, 趙華南, 剛 陸, 陳玉軍 申請人:哈藥集團生物工程有限公司