專利名稱：山羊S6K2基因cDNA編碼區核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K2蛋白的cDNA，更具體地說涉及編碼S6K2蛋白質 的cDNA編碼區477bp的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列。
背景技術：
細胞生長調控是一個受多因素影響的復雜過程，它不僅受到時間和空間的限制，還受到營養條 件和細胞內外環境條件的影響。在營養條件合適并有其它剌激生長的因子存在時，細胞通過生物大分子合 成而使得質量和形態都得到增長，此時則表現為生長。盡管目前對細胞生長和細胞周期分裂是如何協調的 機制理解的還很少，但信號蛋白T0R (target of rapamycin)在從酵母到果蠅直至哺乳動物細胞中作為細 胞生長的中心協調器的作用已為人們所認識，這一在進化上保守的協調器調節著基本的生物加工過程。最 具特色的mT0R下游效應器包括兩條信號通路，即4E-BP1 (真核細胞翻譯啟始因子4E (elF4E)結合蛋白1) 和S6Ks (核糖體蛋白S6激酶)，形成了兩條平行的調節niRNA轉譯的信號通路。
哺乳動物細胞中有兩種S6Ks蛋白，即S6K1和S6K2，它們分別由兩個基因所編碼。兩種蛋白在組成、 結構和功能等方面都是相近的。S6K2是一個屬于AGO激酶家族的Ser/Thr激酶。S6K2蛋白包含了 5個主 要的結構域，自N端始分另ij為NT (N-terminal domain), catalytic domain, the linker region, autoinhibitory domain和CT(C-terminal domain)。 S6K2有兩種形態，分別稱為S6K2卩1 (p70pl)和S6K鄰2 (p70卩2)。人 的S6K2 e 1含有495個氨基酸殘基，S6K2 P 2含有482個氨基酸殘基，二者僅在N端相差13個氨基酸并且 在S6K2Pl多出的13個氨基酸中包含了核定位信號。編碼p703和p70a的基因核苷酸序列的同源性為70%, 而氨基酸序列同源性為85%，進一步的結構分析表明，在S6K2的C端也有核定位信號，故S6K2的兩種形 態都是核型的。實驗證明S6K2在小鼠細胞生長和胚胎發育中起著重要的作用，S6K2影響著蛋白的合成和 細胞的生長。
迄今，關于S6K2在哺乳動物細胞生長與增殖中發揮調節作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳動物的細 胞中開展并取得了許多成果，但尚未見有關山羊細胞中S6K2的研究報道，也未見有山羊S6K2基因的cDNA 核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列的報道。
在各種情況下，有重要的原因研究和開發與山羊S6K2蛋白相關的基因克隆及其重組表達，因為研究 清楚山羊的S6K2基因和蛋白的功能，可以用在提高細胞培養、胚胎移植和發育及出生后新生兒的存活的 質量等方面，由重組S6K2蛋白制備的抗體可以檢測S6K2基因在不同種類的細胞、不同的細胞周期及個 體的不同發育階段的表達情況
發明內容
本發明人己經努力從山羊的不同組織細胞中分離S6K2基因。作為結果，本發明人從山羊肌肉 組織細胞分離了 S6K2基因的cDNA編碼區479bp片段，并且確定了它的核苷酸序列和由它的前477bp推斷 出的氨基酸序列。本發明人通過比對己知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的S6K2基因的核苷酸序列，找 到保守區，然后根據牛的S6K2基因(XM-582478)cDNA編碼區的序列，設計出了一對用于通過RT-PCR方 法擴增山羊S6K2基因cDNA編碼區片段的簡并引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應用這對引 物擴增出了特異性片段，測序后得到了山羊S6K2基因的cDNA編碼區479bp片段，序列分析表明與牛的序 列(XM-582478)同源性為98%(470/479),推導出的由此序列編碼的氨基酸序列與牛的相比有3個氨基酸 的差別。這一cDNA片段稱為"gS6K2"。
所以，本發明的目的是通過己知的不同物種的S6K2的核苷酸序列設計簡并引物，然后通過RT-PCR方 法克隆山羊S6K2基因的cDNA編碼區片段。對該片段測序后提供編碼山羊S6K2蛋白的基因的cDNA的編 碼區477bp的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列(序列詳見序列表)。
附圖的簡要說明
從下面給出的說明結合附圖，本發明的上面目的的特征將變的明了。其中


圖1顯示了牛S6K2基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陸號XM-582478)。
圖2顯示了 477 bp的山羊S6K2基因的cDNA的編碼區核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )和由此推斷的氨基酸 序列(SEQ ID NO: 2)。
圖3是顯示從山羊肌肉組織分離的總RNA的RT-PCR的結果(479 bp的cDNA gS6K2)的電泳圖。 圖4是顯示以質粒PMD19-T-gS6K2為模板，以Pl、 P2為引物進行PCR鑒定的電泳圖。圖5是顯示將質粒pMD19-T-gS6K2進行酶切鑒定的電泳圖。
圖6顯示了山羊S6K2基因cDNA的編碼區核苷酸序列與牛(XM-582478)的S6K2基因cDNA的序列的比 較。
具體實施方式
為了從山羊組織細胞中分離S6K2基因，本發明人首先按照提取RNA的標準要求采集內蒙 古白絨山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat, Cspra力/rcws )的各類組織樣本。艮卩，現場宰殺內蒙古 白絨山羊后立即采取肌肉、肝、腎、淋巴結、脾及睪丸等組織塊(將組織塊大小控制在30 50ug)，放入 冷凍管后立即入液氮保存，帶回實驗室后置于-8(TC冰箱保存備用。然后利用TaKaRa的總RNA提取試劑盒 (TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取山羊肌肉組織、睪丸組織、腎組織、肝組 織、淋巴結組織及脾臟組織的總RNA，最后根據文獻報道的哺乳動物S6K2基因在各類組織中的表達情況 和總RNA提取結果，選定以肌肉組織總RNA為模板進行反轉錄操作，得到cDNA第一鏈。再以此cDNA第_ 鏈為模板，利用特異性引物P1、 P2進行PCR擴增，得到目的片段。之后將電泳后分離的目的片段切膠回 收，測定雙鏈cDNA的濃度，與pMD19-T克隆載體連接構建成質粒pMD19-T-gS6K2。
為了檢測連接反應是否成功和擴增質粒pMD19-T-gS6K2，將其轉化f co乃'DH5 a感受態細胞，然后將 此被質粒pMD19-T- gS6K2轉化了的DH5 a細胞涂在含有氨芐青霉素的選擇性平板上，并同時進行 藍、白菌落篩選。37'C培養16小時后選取白色的重組菌落再進行平板劃線培養12小時。作為結果，初步 認定白色菌落為獲得的重組菌落。
重組菌落和重組質粒pMD19-T-gS6K2的進一步鑒定則分為三個步驟進行。首先挑取劃線培養的菌落用 Kieser法提質粒，再以此質粒為模板，用特異性引物Pl、 P2進行PCR鑒定，陽性的初步認定為重組質粒， 其相應的齒落則為重組菌落。然后，再挑取初步認定為重組的菌落進行液體培養，精提質粒，再以此精提 的質粒為模板進行PCR鑒定，陽性的質粒進一步進行單酶切和￡coi I /歷wdll雙酶切鑒定。經過 了 PCR和酶切雙重鑒定的質粒確定為重組質粒pMD19-T-gS6K2。作為結果，得到了顯示陽性反應的重組質 粒和重組菌落。將含有重組質粒pMD19-T-gS6K2的ibo乃'DH5 a液體培養的樣品送上海生工生物工程有限 公司測序。作為結果，獲得了 479bp的山羊S6K2基因cDNA編碼區的核苷酸序列。
顯示上面提到的特征的本發明的特異性PCR引物Pl和P2，可以利用RT-PCR方法擴增出山羊的S6K2 基因的cDNA編碼區片段。根據本發明獲得的羊S6K2基因cDNA的核苷酸序列可進一步通過RT-PCR或雜交 的方法檢測S6K2基因的組織表達特異性，也可進一步實現羊S6K2基因全長cDNA的克隆。將本發明的 cDNA重組到表達載體上可能會表達出完整的S6K2蛋白，進而可用于抗體生產，檢測山羊各類細胞和組織、 早期胚胎、個體在不同狀態下的S6K2基因的表達情況等等。
在下面的實施例中進一步說明了本發明，但這并不限制本發明的范圍。 實施例1:山羊S6K2基因的cDNA編碼區479bp片段的克隆
為了克隆來自山羊肌肉組織細胞的S6K2基因包含479bp編碼區的cDNA，根據圖1公開的核苷酸序列 (XM-582478),首先制備允許擴增479bp的cDNA的PCR兼并引物，即上游引物P1: 5'-TATGG (C/A) AAGGTGTTCC-3';下游引物P2: 5'-GCCATGTACTC (G/A) AT (G/C) G-3'。
為了利用RT-PCR方法克隆S6K2基因的cDNA,從山羊肌肉組織分離總RNA,利用TaKaRa總RNA提取 試劑盒(TaKaRaRMiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取山羊肌肉組織總RNA，進行電泳檢測 和紫外測定RNA濃度后置于-80'C冰箱保存備用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反轉錄酶并按照使用說明書 的操作程序進行反轉錄反應，得到cDNA第一鏈。
以上面得到的cDNA第一鏈為模板，Pl、 P2為引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶進行PCR反應。PCR 反應體系為10Hl: 模板cDNA lri， 10XPCR buffer( Mg2* plus) M， d證(各2. 5mM) l,6l4， Pl (10pmol/ul) 0, 5W， P2(10pmolA4)0.514， LA Taq酶(5醇1) 0. 1W， ddH20 5.3W。反應循環為94°C 4 分鐘；94。C 30秒，53'C 30秒，72°C， 30秒，35個循環；72'C 10分鐘。PCR反應結束后，取PCR產物10 nl進行O. 7%瓊脂糖凝膠電泳(0. 5%TAE，電壓8v/cm， 1. 5 h)。電泳結束，0. 5Hg/ml的EB染色液中 染色20分鐘，再清水浸泡10分鐘后置于凝膠成像儀觀察照相。作為結果，得到了 479bp的特異性目的片 段(參見圖3)。
為了將獲得的479bp的cDNA特異性目的片段連接到pMD19-T克隆載體上，首先將電泳分離的479 bp的cDNA特異性目的片段進行切膠，然后利用膠回收試劑盒回收目的片段，紫外測定濃度后按照pMD19-T 克隆載體說明書操作程序完成連接。為了檢測連接反應是否成功和進一步擴增質粒pMD19-T-gS6K2，將 其轉化fco7i DH5 a感受態細胞，然后將此被質粒pMD19-T-gS6K2轉化了的fi^h' DH5 a細胞涂在含有氨 芐青霉素和X-gal的選擇性平板上，并同時涂上IPTG進行誘導，實現藍、白菌落篩選。涂布的平板37'C 培養16小時后選取白色的重組菌落再進行平板劃線培養12小時。作為結果，得到了白色的重組菌落。
進一步的工作是對重組菌落和重組質粒進行鑒定(理論上將只有含有重組質粒的菌落才是真正的重組 菌落)。首先將白色的重組菌落進行劃線培養12小時，然后挑取菌落，用Kieser法提質粒。再以此質粒 為模板，用特異性引物P1、 P2進行PCR鑒定。對陽性的菌落進行搖床振蕩液體培養12小時，精提質粒， 紫外檢測濃度并進行1%瓊脂糖凝膠電泳(0.5% TAE，電壓8v/cm， 1.5 h)檢測，作為結果，得到了與預 期結果大小相符的質粒。最后一步是對精提的質粒利用PCR反應和酶切反應進行二次鑒定。PCR反應以質 粒為模板，以P1、 P2為引物，反應體系為質粒模板1W， 10XPCR buffer( Mg2+plus) 1W， dNTP (各2. 5mM) 1. 6^1， PI (lOpmol/ri) 0. 5叱P2(10pmo1/(4)0. 5W, LATaq酶(5醇1)0. 1W， ddH20 5.3W。 反應循環為94。C 4分鐘；94。C 30秒，53°C 30秒，72°C， 30秒，35個循環72。C 10分鐘。PCR反應結束 后，取PCR產物10ul進行0. 7%瓊脂糖凝膠電泳(0.5%TAE，電壓8v/cm, 1.5h)。電泳結束，0. 5Pg/ml 的EB染色液中染色20分鐘，再清水浸泡10分鐘后置于凝膠成像儀觀察照像。作為結果，得到了 479 bp 的特異性目的片段(參見圖4)。酶切鑒定采用TaKaRa I單酶切和￡coi I ////"』11雙酶切，作為
結果，質粒的單酶切得到了與預期結果大小相符的片段(參見圖5)。
經過兩次鑒定的重組質粒，與其相應的菌落即是重組菌落。將液體培養的重組菌落樣品lml送往上海 生工生物工程有限公司用測序。作為結果，獲得了山羊S6K2基因的cDNA編碼區479 bp片段的克隆。
實施例2:山羊S6K2基因的cDNA的核苷酸序列
圖2顯示了實施例1中獲得的479bp的cDNA克隆的前477bp的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )，和由 此推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2 )。在圖2中，顯示的序列是S6K2基因的核苷酸序列，它包括了 cDNA編碼區的477bp的核苷酸序列，編碼形成分子量推斷的17. 5KDa的成熟蛋白質的159個氨基酸。
圖6顯示了山羊S6K2基因cDNA的核苷酸序列與牛(XM-582478)的S6K2基因cDNA的核苷酸序列 的比較。表明1)山羊S6K2基因cDNA的核苷酸序列與牛的S6K2基因cDNA的核苷酸序列有98W的同 源性。由山羊的這段核苷酸序列的前477bp推導出的氨基酸序列與牛的S6K2蛋白相同位置片段的氨基酸 序列相比(XP—582478)有3個氨基酸的差別，同源性98. 1 %(156/159)。
正如清楚說明的和如上說明，本發明提供利用RT-PCR法克隆山羊S6K2基因cDNA編碼區的引物和 編碼山羊的S6K2蛋白質的包括479bp的cDNA的核苷酸序列和由它的前477bp推斷的氨基酸序列。此 cDNA包括的477bp的核苷酸序列，它編碼含有159個氨基酸殘基的蛋白質，經過進一步的改造后它可以 亞克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表達載體上進行表達。重組的cDNA片段可能會表達出完整的 S6K2蛋白，進而可用于抗體生產，檢測山羊各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態下的S6K2基因 的表達情況等等。
1. 山羊S6K2 cDNA的編碼區片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述。
2. 由cDNA編碼區的核苷酸序列推斷出的山羊S6K2蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所述。山羊S6K2基因cDNA編碼區核苷酸序列.ST25 SEQUENCE LISTING
<110>
<120> 山羊S6K2基因cDNA編碼區核苷酸序列
<130> N0
<140> N0
<141〉 2008-01-22
<160> 2
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 477
<212〉 腿
<213〉 C叩ra hircus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(477)
<400〉 1
tat ggc aag gtg ttc cag gtg cga aag gtg cag ggc agc aat ctg ggc 48 Tyr Gly Lys Val Phe Gin Val Arg Lys Val Gin Gly Ser Asn Leu Gly 15 10 15
aaa ata tat gcc atg aaa gtc ctg agg aag gcc aaa att gtg cgc aac 96 Lys lie Tyr Ala Met Lys Val Leu Arg Lys Ala Lys lie Val Arg Asn 20 25 30
gcc aag gac acg gca cac acg egg get gag egg aac att ctg gag teg 144 Ala Lys Asp Thr Ala His Thr Arg Ala Glu Arg Asn lie Leu Glu Ser 35 40 45
gtg aag cac cct ttc att gtg gaa ctg gcc tat gtc ttc cag act ggc 192 Val Lys His Pro Phe lie Val Glu Leu Ala Tyr Val Phe Gin Thr Gly 50 55 60
ggc aaa ctt tac etc ate etc gag tgc etc age ggt ggt gag ctt ttc 240 Gly Lys Leu Tyr Leu lie Leu Glu Cys Leu Ser Gly Gly Glu Leu Phe 65 70 75 80
acg cac ctg gag cga gaa ggc ate ttc eta gaa gac acg gcc tgt ttc 288 Thr His Leu Glu Arg Glu Gly lie Phe Leu Glu Asp Thr Ala Cys Phe 85 90 95
tac ctg tea gag a/tc aca ctg gcc ctg ggc cat etc cac ttc caa ggc 336 Tyr Leu Ser Glu lie Thr Leu Ala Leu Gly His Leu His Phe Gin Gly 100 105 110
ate ate tac egg gac etc aaa cct gaa aac ate atg etc aac age cag 384 lie lie Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn lie Met Leu Asn Ser Gin 115 120 125
ggc cac ate aaa ctg acg gac ttt ggc etc tgc aag gag teg ate cac 432 Gly His lie Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Ser lie His 130 135 140
gag ggc get gtg acc cac acc ttc tgc ggc acc a/tc gag tac atg 477 Glu Gly Ala Val Thr His Thr Phe Cys Gly Thr lie Glu Tyr Met 145 150 155
〈210〉 2
<211〉 159
〈212〉 PRT
〈213> Capra hircus
<■> 2
鋼軍干
志東曰Tyr Gly 1Lys Val Phe Gin Val 5山羊S6K2基因cDNA編碼區核苷酸序列.ST25Arg Lys Val Gin 10Gly Ser Asn Leu Gly 15Lys lie Tyr Ala Met Lys Val Leu Arg Lys Ala Lys lie Val Arg Asn 20 '25 30Ala Lys Asp Thr Ala His Thr Arg Ala Glu Arg Asn lie Leu Glu Ser 35 40 45Val Lys His Pro Phe lie Val Glu Leu Ala Tyr Val Phe Gin Thr Gly 50 55 60Gly Lys Leu Tyr Leu lie Leu Glu Cys Leu Ser Gly Gly GLu Leu Phe65707580Thr His Leu Glu Arg Glu Gly lie Phe Leu Glu Asp Thr Ala Cys Phe 85 90 95Tyr Leu Ser Glu lie Thr Leu Ala Leu Gly His Leu His Phe Gin Gly 100 105 110lie lie Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn lie Met Leu Asn Ser Gin 115 120 125Gly His lie Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Ser lie His 130 135 140Glu Gly Ala Val Thr His Thr Phe Cys Gly Thr lie Glu Tyr Met 145 150 15權利要求
1、獨立權利要求本發明涉及一段從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K2蛋白的cDNA，更具體地說涉及編碼S6K2蛋白質的cDNA編碼區核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列。目前應用RT-PCR方法克隆基因并獲得相應的核苷酸序列是獲得基因(cDNA)核苷酸序列的常用方法。本項發明設計了一對引物并應用這對引物通過RT-PCR方法擴增出了山羊S6K2基因cDNA的編碼區特異性片段，經過測序后得到這一片段的479bp的核苷酸序列，其特征是在還沒有羊S6K2基因核苷酸序列的情況下，通過比較已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的S6K2基因的核苷酸序列，找到保守區，然后根據牛S6K2基因cDNA序列設計PCR引物，進而通過RT-PCR方法擴增出了山羊S6K2基因cDNA的編碼區片段，測序后得到了479bp的核苷酸序列和與它的前477bp對應的氨基酸序列，這一山羊S6K2基因cDNA編碼區片段的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列在國內外是首次獲得?；谏鲜稣f明的本發明的技術特征，本發明的獨立權利要求表述為一種自山羊分離的多核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列，是下列序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的477bp的cDNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO1的cDNA序列對應的標注為SEQ ID NO2的氨基酸序列。
全文摘要
本發明涉及從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K2蛋白的cDNA的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列。本發明通過比對已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的S6K2基因cDNA的核苷酸序列，找到保守區，然后根據牛S6K2基因cDNA序列(GenBank登陸號XM-582478)設計出了一對用于RT-PCR擴增羊S6K2基因cDNA編碼區片段的引物并用這對引物通過RT-PCR方法擴增出了特異性片段，測序后得到了羊S6K2基因cDNA的編碼區的479bp的核苷酸序列和與它的前477bp對應的氨基酸序列。獲得的這477bp的核苷酸序列可進一步用于羊S6K2基因全長cDNA的克隆及用于通過RT-PCR或雜交的方法檢測S6K2基因的組織表達特異性，也可用于重組表達得到蛋白后制備檢測S6K2的抗體。
文檔編號C12N15/54GK101503695SQ20081008050
公開日2009年8月12日 申請日期2008年2月5日 優先權日2008年2月5日
發明者劉東軍, 旭日干, 王志鋼 申請人:王志鋼;劉東軍;旭日干