專利名稱：一種可產生包裝大片段rna病毒樣顆粒的雙質粒表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可產生包裝大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達系統，屬于生 物技術領域。
背景技術：
RNA病毒如丙型肝炎病毒(H印atitis C virus, HCV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coro瞎irus, SARS-CoV)、高致病禽流感病毒H5N1等是一類 可致人類嚴重疾病的病原體。病毒RNA檢測對于感染的早期診斷，以及抗病毒治療療 效的動態觀察，是一個必不可少的手段。從二十世紀九十年代初開始，人們逐漸采用 分子診斷方法(Molecular diagnostic assay)來檢測病毒RNA，此類技術靈敏特異 使之成為許多病毒RNA的主要檢測方式，甚至唯一的檢測方式。目前最常用的檢測方 法包括實時熒光定量PCR (real time reaverse transcription PCR, RT-PCR)、核酸 序列依賴性擴增NASBA、 branched chain DNA RT — PCR檢測法和連接酶酶促鏈式反應 (LCR)、轉錄介導的擴增(TMA)。
使用分子診斷方法檢測RNA病毒要得到可靠的結果，必須要有嚴格的質量控制措 施，很關鍵的一點就是要有特定RNA病毒的質控品。同時，要對病毒進行定量測定， 通常還須有RNA病毒標準品。目前RNA病毒擴增檢測的質控品和標準品包括裸RNA片 段、病毒顆粒以及帶盔甲的RNA (armored RNA)。裸露的RNA易于受到廣泛存在的核糖 核酸酶(RNA nuclease, ribonuclease， RNase)的降解，而且，用裸露的RNA作為 標準品的另一個缺陷是其不能夠對檢測的全過程進行監測，因為樣本中一般有RNase 的存在，直接將其加入樣本會被降解，即使將其加入裂解液中，也會使標準品受到樣 本中的RNase降解。用病毒顆粒作為標準品時，由于病毒顆粒有傳染性，而且，其制 備運輸困難，所以，盡管目前有人應用牛腹瀉病毒(BVDV)作為檢測HCV的內部標準 品，或者用HCV病毒顆粒作為檢測HCV RNA的標準品代替冊O提供的HCV標準品，或 者用HIV病毒顆粒作為通用的病毒RNA標準品。但是，這些技術無法克服病毒顆粒傳 染性、病毒顆粒制備運輸困難等問題，也就是說病毒顆粒不是理想的標準品。鑒于上述二種標準品的缺陷，需要設計一種制備簡單、定量容易、耐RNase的RNA檢測標準 品。DuBois等發明的arraored RNA技術可以滿足上述要求，制備耐RNase、無生物傳 染性的RNA。 armored RNA是MS2噬菌體樣病毒樣顆粒，是MS2噬菌體的包膜蛋白與 RNA的復合物。DuBois等用單質粒表達系統表達病毒樣顆粒，在構建質粒時，利用分 子克隆技術依次將MS2的成熟酶蛋白、包膜蛋白、包裝位點以及病毒標準品序列克隆 到表達載體的下游，經過誘導表達，包膜蛋白組裝成病毒樣顆粒并將目的RNA包裝于 包膜蛋白內。armored RNA制備運輸方便、定量容易，并且可以以內部參照物的形式 監測檢測的全過程。現如今，armored RNA已廣泛用于RT-PCR和branched chain DNA 檢測的質控品。但這種方法包裝的RNA片段的長度只有500bp左右，當RNA片段長度 超過500bp時，包裝效率顯著降低。在檢測RNA病毒時，盡管大多數RT-PCR試劑盒擴 增的片段不超過500bp，但如果上述耐RNase的病毒樣顆粒能包裝長片段的RNA，則其 在RNA病毒的臨床檢測的質量控制和標準化上具有更為廣泛的應用價值。例如，采用 bDNA技術檢測HIV，所使用的HIV RNA標準品要長至3kb左右。此時，用前述的方法 不可能得到一個內含如此長的外源RNA的可用作質控品和標準品的病毒樣顆粒；此外， 就某個特定的病毒的檢測而言，不同試劑廠家生產的RT-PCR試劑盒的擴增耙片段可能 是不同的，如果把不同廠家的目的片段構建到一條RNA鏈上，并且包裝入包膜蛋白內， 形成病毒樣顆粒，那么不同的實驗室之間就可以對結果進行直接的比較；還有如果把 不同病毒要擴增的目的片段構建在一起，形成嵌合體，并包裝入病毒樣顆粒內，這種 病毒樣顆粒就可以作為對同一個標本進行多個病毒的同時檢測時可應用的多靶核酸標 準品和質控品，既節省了成本，也減化了操作程序。
MS2是正義單鏈RNA噬菌體，基因組含有3569個核苷酸，編碼4種蛋白質分子-成熟酶蛋白、包膜蛋白、復制酶蛋白和裂解蛋白。包膜蛋白由180個化學結構一致的 亞基組成，每個亞基含有129個氨基酸殘基，形成二十面體對稱結構。在復制酶5'端 存在著一個由19個堿基(19mer)組成的莖環結構，是包膜蛋白二聚體與RNA相互作 用的部位，這種相互作用形成的復合物是噬菌體自我包裝的信號，在復合物的基礎上， 成熟酶蛋白與其它包膜蛋白分子結合并在自由能的驅動下形成相應的空間構象，完成 MS2噬菌體的組裝。19mer的莖環結構(發夾結構)主要由一個堿基配對莖、一10位 突起的腺嘌呤和4個核苷酸形成的環等三部分組成。堿基序列為5 'ACAUGAGGAUUACCCAUGU3',以復制酶起始密碼子為+1位。19mer中僅4個核苷酸的位 置對包膜蛋白的識別特別重要，在保證莖堿基配對情況下，-4、 -7和-IO位的腺嘌呤以及-5位的嘧啶與包膜蛋白相互作用[16]， 3個重要腺嘌呤(-4、 -7、 -10)以不同方 式與包膜蛋白二聚體結合。
R0WSELL等構建了四種RNA莖環結構的適配體，C-variant、 F5、 F6和F7，這些 適配體的二級結構與野生型的不同，其中，C-variant的-5位為胞噴啶，替換了野生 型的尿嘧啶，使C-variant適配體與衣殼蛋白的親和力與野生型相比提高了 6倍，甚 至是50倍。C-variant適配體與野生型莖環結構之間的重要區別是C_5的N4與_6位 上的磷酸基團的氧原子形成了分子內氫鍵。
Pickett和Peabody設計了雙質粒表達系統表達病毒樣顆粒，其中一個質粒表達 包膜蛋白，而另一個質粒表達19mer的包裝位點和其下游的3000bplacZ基因。結果發 現，表達的包膜蛋白可以包裝含有19mer莖環結構的外源性RNA，但包裝的外源性RNA 長度只有500bp，而不是預期的3000bp;另外包裝所得噬菌體樣顆粒內含有宿主核糖 體RNA(rRNA)。 Pickett和Peabody設計的雙質粒表達系統沒有包括成熟酶蛋白，但 成熟酶蛋白在病毒樣顆粒中對保證被包裝基因的完整性是重要的，沒有成熟酶蛋白的 病毒樣顆粒，其內包裝的RNA易被RNase降解。所以Pickett和Peabody的病毒樣顆 粒是有缺陷的病毒樣顆粒，即缺乏成熟特性，對RNase敏感。在Pickett和Peabody 的另一個實驗中，他們調整了包膜蛋白和外源RNA的比例，結果包裝的RNA只有目的 RNA，而沒有包裝宿主RNA，這說明包膜蛋白和外源RNA的比例協調也是非常重要的。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質 粒表達系統。
為實現上述目的，本發明釆用以下技術方案
一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達系統，由質粒PET-MC和質粒 pACYC-X組成，其中pET-MC由pET-28(b)整合噬菌體MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白cDNA 構建而成，pACYC-X為PACYCDuet-1整合噬菌體MS2的19mer包裝位點和目的RNA的 cDNA構建而成(組成)。
所述pACYC-X為pACYC-3V質粒。
所述pACYC-3V質粒表達包裝位點和3種病毒的嵌合體序列. 所述3種病毒的嵌合體序列為SARS-Cov ( SARS-CoVl 、 SARS-CoV2 、 SARS-CoV3)、 一段HCV和二段H5N1 (M300和HA30Q)。
5雙表達質粒pACYC-3V和PET-MC系統，存在于大腸桿菌菌株 pACYC-dnet-l-ET-28b中，該大腸桿菌菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微 生物中心(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保 藏日期為2008年3月31日，建議的分類名為大腸埃希氏菌^c/^a^/^co//,保藏號 為CGMCC No.2425。
所述雙表達質粒pACYC-3V和PET-MC系統，表達序列表SEQ ID No.l所述的 核苷酸序列。
在本發明中，我們的雙質粒系統應用的載體是質粒pET-28 (b)和pACYCDuet-l， 質粒pET-28 (b)和pACYCDuet-l都為低拷貝質粒，拷貝數分別為18-20和18-22。兩 者復制子分別為ColEl和P15A，是復制子不同的相容性質粒，并且兩者的抗性不同， 所以可以共存于同一個菌株內。兩者的啟動子同為T7，所以兩者的轉錄效率應是相同 的。基于以上兩個質粒的特點，成熟酶蛋白和包膜蛋白構建于pET-28 (b)，而19mer 的包裝位點和目的RNA的cDNA構建于pACYCDuet-1，兩質粒轉化入同一菌株進行表達， 表達的包膜蛋白和RNA的比例應是協調的。另外pACYCDuet-l為雙表達載體，有兩組 多克隆位點和兩個相同的啟動子和終止子，所以我們可以把成熟酶蛋白和包膜蛋以及 19mer的包裝位點和目的RNA的cDNA分別構建于pACYCDuet-1的兩個多克隆位點，這 樣表達的包膜蛋白和RNA的比例也應是協調的。
為了包裝含有大片段RNA的病毒樣顆粒，我們設計了應用雙質粒系統來表達病毒 樣顆粒，其中一個質粒表達成熟酶蛋白和包膜蛋白，另一個質粒表達包裝位點和外源 RNA。這樣表達的包膜蛋白只包裝外源RNA，而不包裝噬菌體的基因序列，所以理論上， 用這種方法包裝的外源RNA片段應為3500bp左右。
為了證明雙質粒表達系統的效果，我們成功構建了 PET-MC和PACYC-3V，前者表 達成熟酶蛋白和衣殼蛋白，后者表達包裝位點和2250bp的3種病毒的嵌合體序列，包 裝位點應用的是C-5變異體，并且包裝位點的位置放置在目的RNA的中間，距上游 1200bp堿基處。經過誘導成功的表達了病毒樣顆粒，表達的病毒樣顆粒包裝了全長的 2250bp。實驗證明，該病毒樣顆粒具有很好的穩定性。該含有雙表達質粒pACYC-3V 和PET-MC的大腸桿菌菌株命名為pACYC-dnet-1-ET-28b，保藏于中國微生物菌種保藏 委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏日期為2008年3月31日，建議的分類名為大腸埃希氏菌^c力eric力i3 co7i，保藏號為CGMCC No. 2425。發明的優點是本發明構建的雙質粒系統表達的病毒樣顆粒內含長片段RNA。我 們把不同病毒要擴增的目的片段構建在一起，形成嵌合體，并包裝入病毒樣顆粒內， 這種病毒樣顆粒就可以作為對同一個標本進行多個病毒的同時檢測時可應用的多靶核 酸標準品和質控品，既節省了成本，也減化了操作程序。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對本發明的限定，依 照本領域公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本發明公開內 容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。


圖1為pET-28a(+)質粒圖譜。 圖2為PACYCDuet-l質粒圖譜。 圖3為病毒樣顆粒透析后結果。 圖4為驗證VLP顆粒的結果。 圖5為提取TA克隆，電泳結果。 圖6為4。C放置的樣本10 000/ML，熒光PCR結果。 圖7為37。C放置的樣本10 000/ML，熒光PCR結果。 圖8為室溫放置的樣本10 000/ML，熒光PCR結果。
具體實施例方式
實施例中采用的質粒、菌種和試劑如下
質粒PET-28 (b)購于Novagen公司
質粒PACYCDuet—'購于Novagen公司
質粒pNCCL由Peabody惠贈。
pGEM-T Easy Vector Systems: 購于Promega公司
產品菌株BL21 (DE3)購于Tiangen公司
限制性內切酶、T4DNA連接酶購于NEB公司、RNA抽提試劑盒購于Qiagen
實施例1: pET-MC的構建
一.擴增MS2的成熟酶蛋白和衣殼蛋白序列
以pNCCL質粒為模板，PCR擴增MS2的成熟酶蛋白和衣殼蛋白序列81-1741。引物5' -CGGTGATCCTGGCTATCGCTGTAGGTAGCC-3' 81-101
5'-CCCA ， AGCTTATGGCCGGCGTCTATTAGTAG-3' 1721-1741
反應體系擴增4管各50u 1: 10*buffer 5ul ; Taq 0. 4ul; DNTP lul ; Primerl lul ; Primer2 lul ; Mgcl2 3ul ; NCCL lul; DEPC水 37.6 ul。
循環參數94°C 3分鐘；94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 30秒，重復40個循環； 72 °C 2分鐘；72 °C 10分鐘。
電泳結果表明，擴增的片段長度為1700bp，符合預期。
二. MS2的成熟酶蛋白和衣殼蛋白片段的TA克隆
用常規方法回收電泳膠中的MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白片段，按照試劑盒說明書 將PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接，4"C連接過夜。取5pl連接產物，加入200pl 感受態細菌，輕輕混勻冰浴靜置30分鐘。將管放入預加溫至42。C的循環水浴中，恰恰 放置90S,不要搖動.置于冰上2分鐘。加入200ul 37'C預溫的LB培養液，37"C振蕩 (200rpm)培養1小時。將轉化產物涂于含有1004g/ml氨芐青霉素的LB培養板(含 lmol/1 IPTG 4pl， 20mg/ml X-gal 40pl)上，37 。C倒置培養過夜。結果符合預期， 培養基可見藍、白斑菌落。
三. 提取已轉化的TA克隆質粒
挑轉化后的7個白色單菌落，接種到含AMP抗生素的LB培養基中，培養基量為 4ml，于37'C、 300rpm/分振搖過夜。將振搖過夜的培養基以10， 000Xg的轉速離心5 分鐘，倒掉上清，將試管倒置于紙巾上盡量吸干培養液。按照TAKARA質粒提取說明書 操作，提取TA克隆質粒。電泳確定符合預期后，將MS2TA于一2(TC保存。
四. 構建PET-MC質粒
應用限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切MS2TA克隆和載體PET-28 (b)， 37'C酶 切四小時。反應體系BSAO. 4ul， hindIII 2ul， BamHI2ul， buffer 5ul， MS2TA41.6ul。
按照NEB說明書操作以上述酶切產物構建PET-MS2質粒。連接體系為10*buffer lul ;連接接酶lul; PET-28 (b) 5ul; MS2 3ul。 4'C連接過夜。取5pl連接產物， 加入200^1感受態細菌，輕輕混勻冰浴靜置30分鐘。將管放入預加溫至42'C的循環 水浴中，恰恰放置90秒，置于冰上2分鐘。加入200ul37。C預溫的LB培養液，37'C振 蕩(200rpm)培養1小時。將轉化產物涂于含有100化/ml kana霉素的LB培養板上， 37'C倒置培養過夜。結果平板可見細菌生長，符合預期。
五. 提取PET-MC質粒
8挑轉化后的單菌落，接種到含kana抗生素的LB培養基中，培養基量為4ml，于 37°C、 300rpm/分振搖過夜。將振搖過夜的培養基以10， 000Xg的轉速離心5分鐘， 倒掉上清，將試管倒置于紙巾上盡量吸干培養液。按照TAKARA質粒提取說明書操作， 提取PET-MC質粒。將上述提取的質粒送三博遠志生物技術公司測序，測序結果正確。
實施例2: pACYC-3V的構建
一.應用OVERLAP技術擴增六段嵌合段序列
六段序列包括三段SARS-Cov (SARS-CoVl、 SARS-CoV2、 SARS-CoV3)、 一段 HCV和二段H5N1 (M300和HA300)。 第一輪PCR首先擴增六段小序列。
SARS-CoVl的擴增模板pBSSR-V6，由協和醫科大學基礎所惠贈。擴增 SARS-CoV的15224 15618序列
引物S-SARS1: 5'TATCCAAAATGTGACAGAGCCATG3' LAP-SARS1: 5'ACGCTGAGGTGTGTAGGT GCAGGTAAGCGTAAAACTCATCCAC3'
SARS-CoV2的擴增模板pNCCL-SARS，由本室構建。擴增SARS-CoV18038 18340序列
引物A-SARS2: 5'TAACCAGTCGGTACAGCTACTAAG3，
SARS-CoV3的擴增模板pBSSR7-8由由協和醫科大學基礎所惠贈。擴增 SARS-CoV 328110 28692序列。
弓I物A-SARS35'ACTACGTGATGAGGAGCGAGAAGAG3'
HCV的擴增模板pNCCL-HCV質粒由本室構建。擴增HCV的18 310序列
HA300的擴增模板pNCCL-H5Nl質粒由本室構建。擴增H5N1的295 61 l序列。 弓l物A-HA300: 5'GAATCCGTCTTCCATCTTTCCCCCACAGTACCAAAAGATCTTC3' HA300LAP: 5'CTGATAGGGTGCTTGCGA GCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAG3，
M300的擴增模板pNCCL-H5Nl質粒由本室構建。擴增H5N1的17 373序列。 M300-S， 5' TTGGCCGG丄CC GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG3'M+SLAP15\
第二輪PCR擴增SARS-CoVl十SARS-CoV2 and HCV + HA300 SARS-C0VI+ SARS-CoV2的擴增模板為上述的小片段SARS-CoVl和 SARS-CoV2的膠回收產物。
引物S國SARS1: 5'TATCCAAAATGTGACAGAGCCATG3'
LAP-S ARS2+: 5' ATC AGAC ATTTTAATTTGT TAACC AGTCGGTAC AGCTACTAAG3'
HCV + HA300的擴增模板為上述的小片段HCV禾B HA300的膠回收產物。 弓I物FIVELAP2: 5' CGCTCCTCATCACGTAGT ACATGAGGATCACCCATGTGGC 3' OverlapA， 5 'CCTTAAT 4 TAA CCCACAGTACCAAAAGATCTTCTTG' 第三輪？011擴增8八1^-(30￥1+ SARS-CoV2+ SARS-CoV3
SARS-CoVl+ SARS-CoV2+ SARS-CoV3的擴增應用模板為SARS-CoVK SARS-CoV2和SARS-CoV3的膠回收產物。 弓l物M+SLAP2:
FIVELAP1: 5 ， CATGGGTGATCCTCATGT ACTACGTGATGAGGAGCGAGAAGAG3' 第四輪PCR擴增S ARS-CoV 1 + S ARS-CoV2+S ARS-CoV3 +HC V+H A3 00 SARS-CoVl+ SARS-CoV2+SARS-CoV3+HCV+HA300的擴增應用模板為上述的
SARS-CoVl+SARS-CoV2+SARS-CoV3和HCV+HA300的膠回收產物。
引物M+SLAP2，
OverlapA， 5 'CCTTAAT I TAA CCCACAGTACCAAAAGATCTTCTTG'
第五輪PCR擴增M300+SARS-CoVl + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV + HA300
M300+SARS-CoVl + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV + HA300的擴增應用模
板為上述的SARS-CoVl + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV + HA300和M300的膠回
收產物。
引物M300-S， 5' TTGGCCGG丄CC GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG3， OverlapA， 5 'CCTTAAT I TAA CCCACAGTACCAAAAGATCTTCTTG'
二.六段嵌合體序列的TA克隆
用常規方法回收電泳膠中的六段嵌合體片段，按照試劑盒說明書將PCR產物與
10pGEM-T Easy Vector連接，4。C連接過夜。取5^il連接產物，加入200^1感受態細菌， 輕輕混勻冰浴靜置30分鐘。將管放入預加溫至42'C的循環水浴中，恰恰放置90S,不要 搖動，置于冰上2分鐘。加入200ul 37。C預溫的LB培養液，37。C振蕩(200rpm)培 養l小時。將轉化產物涂于含有100^g/ml氨芐青霉素的LB培養板(含lmo1/1 IPTG4pl， 20mg/ml X-gal 40M1)上，37 。C倒置培養過夜。結果符合預期，培養基可見藍、白 斑菌落。
三. 提取已轉化的TA克隆質粒
挑轉化后的白色單菌落，接種到含AMP抗生素的LB培養基中，培養基量為4ml， 于37°C、 300rpm/分振搖過夜。將振搖過夜的培養基以10， OOOXg的轉速離心5分鐘， 倒掉上清，將試管倒置于紙巾上盡量吸干培養液。按照TAKARA質粒提取說明書操作， 提取TA克隆質粒。電泳確定符合預期后，將3VTA于一2(TC保存。
四. 構建pACYC-3V質粒
應用限制性內切酶FSEI和PACI雙酶切3VTA克隆和載體PACYCDuet-1 ， 37'C酶切 過夜。反應體系BSA0.4ul， FSEI2ul， PACI 2ul， buffer 5ul， 3VTA (PACYCDuet-l) 41. 6ul。
按照NEB說明書操作以上述酶切產物構建pACYC-3V質粒。連接體系為10*buffer lul ;連接接酶lul; PACYCDuet-1 5ul; 3V 3ul。 4'C連接過夜。取5jxl連接產物， 加入200^1感受態細菌，輕輕混勻冰浴靜置30分鐘。將管放入預加溫至42。C的循環 水浴中，恰恰放置90秒，置于冰上2分鐘。加入200ul37'C預溫的LB培養液，37。C振 蕩(200rpm)培養1小時。將轉化產物涂于含有lOOPg/ml氯霉素的LB培養板上，37 'C倒置培養過夜。結果平板可見細菌生長，符合預期。
五. 提取pACYC-3V質粒
挑轉化后的單菌落，接種到含氯霉素抗生素的LB培養基中，培養基量為4ml，于 37°C、 300rpm/分振搖過夜。將振搖過夜的培養基以10， OOOXg的轉速離心5分鐘， 倒掉上清，將試管倒置于紙巾上盡量吸干培養液。按照TAKARA質粒提取說明書操作， 提取pACYC-3V質粒。將上述提取的質粒送三博遠志生物技術公司測序，測序結果正確。
實施例3:雙表達質粒pACYC-3V和PET-MC轉化入大腸桿菌BL21
一.共轉染
雙質粒等體積混合共lOul， lOul質粒加入到裝有200ul感受態細胞的管中，輕輕旋轉幾次混勻內容物，放冰中30分鐘。將管放入預加溫至42t:的循環水浴中，放置90S， 不要搖動。快速將管移到冰浴中，使細胞冷卻2分鐘。加入無抗性的LB培養基200ul。 在37'C振蕩培養1小時。然后涂板于含氯霉素和KANA霉素的平板中。將平板置于室 溫至液體吸收。倒置平皿，于37'C培養16小時。結果，培養基可見菌落生長，符合預 期結果。
二. 提取質粒
挑轉化后的單菌落，接種到含氯霉素和KANA霉素的LB培養基中，培養基量為 10ml，于37'C、 300rpm/分振搖過夜。將振搖過夜的培養基以10, OOOXg的轉速離心 5分鐘，倒掉上清，將試管倒置于紙巾上盡量吸干培養液。加入250ul細胞重懸液， 劇烈振蕩，使細胞完全懸浮。加入250ul細胞裂解液，顛倒混勻4次，室溫孵育大約 5分鐘。加入10ul堿性蛋白酶，顛倒混勻4次，室溫孵育大約5分鐘。加入350ul 中和液，立即顛倒混勻4次。以12， OOOXg的轉速離心15分鐘。以12， OOOXg的轉 速離心15分鐘。將液體移入提取柱中，避免混入白色的沉淀物。在室溫下，以最大轉 速離心1分鐘，從收集管中取出提取柱，倒掉濾出液。將提取柱重新插入收集管中。 加入700ul洗柱液(事先己用95%ethonal溶解)到柱中。在室溫下，以最大轉速離心 1分鐘，從收集管中取出提取柱，倒掉濾出液。將提取柱重新插入收集管中。再次加 入700ul洗柱液，重復以上洗步驟。在室溫下，以最大轉速離心2分鐘。將提取柱移 入到一個新的，無菌的1.5ml離心管中，小心不帶入洗柱液。加入50ul無內切酶的水 于柱中，洗脫質粒，在室溫下，以最大轉速離心1分鐘。DNA洗脫后，取出提取柱。 放入一2(TC保存。電泳結果顯示，符合預期。
三. 已轉化質粒的誘導和表達；超聲碎菌提取病毒樣顆粒
取1個單菌落接種到含氯霉素和KANA抗生素的LB液體培養基中，培養基量為4ml， 于37。C、 300rpm/分振搖過夜。取過夜培養的菌液40UL于10ML的液體培養基中，振 搖培養2小時40分鐘，測OD值為0. 6時加入IPTG至終濃度為lmmol/ml 。37。C 、300rpm/ 分振搖培養16小時。取3ml菌液于4'C， 14000rpm，離心2分鐘。用PBS液洗滌3次， 然后加入超聲處理液250UL懸浮。應用超聲進行碎菌。4'C， 14000rpm，離心10分鐘。 分別取上清20UL分別加入DNase和RNase5UL,放入37°C1小時。電泳結果顯示，符合 預期結果。
四. 對雙質粒表達病毒樣顆粒進行超離和透析
將表達產物懸液稱重量，按1 g表達產物加0. 6g Cscl2的比例，將Cscl2加入到懸
12液中，應用TI90離心轉頭2rC56300rmp離心20個小時.超離后，從液面開始慢慢將液 體吸出，lml裝1管，然后時行電泳.將有條帶的管混合，用超聲處理液透析過夜。雙質 粒表達病毒樣顆粒超離后結果，集中中在2， 3， 4管。見圖3。 五.驗證VLP顆粒，RT-PCR.
1. 實驗設計上游引物M300RT-S:5， GGATTTGTATTCACGCTCACC3''
下游引物Overlap-A-2: 5， TCCCTGGTATGGACATGCTGAGCTC3，； Overl鄰-A-1 5， TGTTGGGTATGCATCGTTCTTTTTG3'
2. 逆轉錄首先95。C5分鐘裂解病毒樣顆粒，釋放RNA，應用引物Overlap-A-l 進行逆轉錄。逆轉錄體系MM-LV-Buffer 5ul， MM-LV lul， dNTP lul， 3V-SIXRNA 5ul， Overlap-A-l 1 ul， DEPC水 13ul，總i十25ul， 42。C水浴一小時。
3. PCR擴增
上游引物M300RT-S:5， GGATTTGTATTCACGCTCACC3，， 下游引物Overl鄰-A-2: 5， TCCCTGGTATGGACATGCTGAGCTC3， 循環參數94°C 3min; 94°C 30s， 53-63°C 30s， 72°C lmin (35個循環)；72°C 10min。結果見圖4。結果分析l為陰性對照，2、 3為病毒樣顆粒未裂解，3， 4為病 毒樣顆粒裂解但未RT。 6、 7、 8、 9、 IO為為病毒樣顆粒裂解并RT-PCR后。
4. 將PCR產物克隆到pGEM-T easy載體上
按說明書操作將PCR產物與pGEM-T Vector連接。4° C連接過夜。取5jxl連接產 物，加入10(VLtoplO感受態細菌，輕輕混勻冰浴靜置30分鐘。將管放入預加溫至42 'C的循環水浴中，恰恰放置90S，不要搖動.置于冰上2分鐘。加入200ul37。 C預溫的 LB培養液，37° C振蕩(200rpra)培養1小時。將轉化產物涂于含有100化/ml氨芐青 霉素的LB培養板(含lmol/1 IPTG 4^1， 20mg/ml X-gal 上，37° C倒置培養
過夜。結果見到藍白斑生長。
5. 提取TA克隆，電泳結果見圖5，符合預期結果。將上述質粒4， 5送三博公司 測序。測序結果(SEQ ID No. 1):
GAGGCTTCATGATTGGACCAAGAACTTTTGGGGATGATCTGAATAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGC
菌種保藏信息本發明實施例3構建的含有雙表達質粒pACYC-3V和PET-MC的大 腸桿菌菌株命名為pACYC-dnet-1-ET-28b,保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微 生物中心(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保 藏日期為2008年3月31日，建議的分類名為大腸埃希氏菌^sc力en'c力^ coh'，保藏 號為CGMCC No. 2425。實施例4:病毒樣顆粒穩定性實驗
試劑上海科華丙型肝炎病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒
儀器lightcycle
樣本用20%新生牛血清將病毒樣顆粒稀釋至含量約10 000/ML、 100 000/MU 1 000 000/ML，每個濃度的制備量為10ml。按0. 1%的終濃度加入硫柳汞。然后進行分裝，每 管分裝量為100ul。
不同含量樣本穩定性檢測放置條件_
放置條件_放置時間_
37°C，相對濕度60 80% 3天
2周 4周
_^_
室溫(20 25°C，相對濕度20 25%) 3天
2周 4周
_^_
2 8°C 3天
2周 4周
_^_
70°C (對照) 長期保存
按上表放置，每種條件下放置3支，在規定的時間點將其放置在 7(TC，實驗結 束后一同上機檢測。以 7(TC凍存樣本做對照。 PCR結果見圖6-圖8，結果穩定。序歹lj表
<110>衛生部北京醫院
〈120〉 一種可產生包裝大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達系統
〈130〉
〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3.3
〈210> 1
<211> 2145
<212> 畫
〈213〉 人工合成
〈400〉 1
cccccacagt3cc3a^g3tcttcttggttggtattattgtagctcctctttattgttgg60
gtatgcactgttctttttgataagccataccacatttctga犯aaggaggacttcccatt120
gtatggacatgctgagctcacccctgatgaggcttcatgattggacc犯gaacttttggg180
g3tg已tctgsattttctcaaaatggtttattctgctcagtQggtgtttcagttcttcata240
gtcgttg3aatcccctgggtaacag3ggtcattggctggsttggccttctccactatgta細
agaccattccgccatgctttacatgcttaggataatggcctctcttgttc360
ttgctcgcaaacataacacttgctgtaacttatcgcaccgtttctacaggttagctaacg420
agtgtgcgcaagtatt已已gtg柳tggtcatgtgtggcggctcactatatgttaaaccag480
gtggaacatcatccggtgatgctacaactgcttacgctaatagtgtcgttaacatttgtc540
gagctgttacagccaatgtsaatgcgcttctttcaactgeitggtaat犯gatagctgaca600
agtatgtccgcaat c t acaacacaggctctatgagtgtct3gggstgUg660
atcatgaattcgtggatgaattttacgcttacctgcacct3C3cacctcagcgttgatat720
犯已gttc犯gactgsaggattatgtgttgacataccaggcalacc已a已gga_c3tg￡iccta780
ccgtagactc￡LtCtCt8tg￡Ltgggtttcaa已atgaatt已ccsagtc犯tggttaccctaa840
tatgtttatcacccgcgaagaagctattcgtcacgttcgtgcgtggattggctttgatgt900<formula>formula see original document page 17</formula>
權利要求
1. 一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達系統，其特征在于由質粒PET-MC和質粒pACYC-X組成，其中pET-MC由pET-28(b)整合噬菌體MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白cDNA構建而成，pACYC-X由PACYCDuet-1整合噬菌體MS2的19mer包裝位點和目的RNA的cDNA組成。
2. 根據權利要求1所述的一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達 系統，其特征在于所述pACYC-X為pACYC-3V質粒。
3. 根據權利要求2所述的一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達 系統，其特征在于所述pACYC-3V質粒表達包裝位點和3種病毒的嵌合體序列。
4. 根據權利要求3所述的一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達 系統，其特征在于所述3種病毒的嵌合體序列為SARS-Cov(SARS-CoVl、SARS-CoV2、 SARS-CoV3)、 一段HCV和二段H5N1 (M300和HA300)。
5. 雙表達質粒pACYC-3V和PET-MC系統，其特征在于存在于大腸桿菌菌株 pACYC-dnet-l-ET-28b中，該大腸桿菌菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微 生物中心(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保 藏日期為2008年3月31日，建議的分類名為大腸埃希氏菌^c/zen'cWa co仏保藏號 為CGMCCNo,2425。
6. 根據權利要求5所述的雙表達質粒pACYC-3V和PET-MC系統，其特征在于 表達序列表SEQ IDNo.l所述的核苷酸序列。
7. 大腸桿菌菌株pACYC-dnet-l-ET-28b，其特征在于含有雙表達質粒 pACYC-3V和PET-MC系統，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地 址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為2008 年3月31日，建議的分類名為大腸埃希氏菌五w/^n'c/n'a co//，保藏號為CGMCC No.2425。
全文摘要
本發明涉及一種可產生包裝大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達系統，屬于生物技術領域。一種可表達含大片段RNA病毒樣顆粒的雙質粒表達系統，由質粒PET-MC和質粒pACYC-X組成，其中pET-MC由pET-28(b)整合噬菌體MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白cDNA構建而成，pACYC-X為PACYCDuet-1整合噬菌體MS2的19mer包裝位點和目的RNA的cDNA構建而成。發明的優點是本發明構建的雙質粒系統表達的病毒樣顆粒內含長片段RNA。我們把不同病毒要擴增的目的片段構建在一起，形成嵌合體，并包裝入病毒樣顆粒內，這種病毒樣顆粒就可以作為對同一個標本進行多個病毒的同時檢測時可應用的多靶核酸標準品和質控品，既節省了成本，也減化了操作程序。
文檔編號C12N15/62GK101503700SQ20081008969
公開日2009年8月12日 申請日期2008年4月14日 優先權日2007年11月30日
發明者瑞 張, 李金明, 楊昌梅, 王露楠, 巍 鄧, 魏玉香, 魏葆珺 申請人:衛生部北京醫院