專利名稱：新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)和檢測該系統(tǒng)的微型基因組及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是構(gòu)建新城疫病毒Italien株輔助表 達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)和檢測該系統(tǒng)的微型基因組及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一種能引起家禽呼吸道感 染等癥狀的負(fù)鏈RNA副粘病毒。ND V的RNA基因組全長約15 kb，不分節(jié)，包含6個基 因，分別編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、 基質(zhì)蛋白(matrix protein，Μ)、融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))、血凝素-神經(jīng)氨酸酶 (hemagglutinin-neuraminidase, ΗΝ)禾口 RNA 依賴的 RNA 聚合酶(large polymerase, L)。 其中，NP、P和L蛋白與病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。病毒核衣殼主要由NP蛋白構(gòu) 成，其次也包含有一定數(shù)量的P和L蛋白，在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，NP、P和L蛋白與 病毒基因組RNA —起形成核糖核酸蛋白復(fù)合物(RNP)，該復(fù)合物行使RNA依賴的RNA聚合酶 的功能，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。NDV基因組中除含有編碼6種病毒蛋白的編碼序列外，還包括位于編碼序列上下 游的啟始序列(GS)、終止序列(GE)以及位于兩者之間的中間序列(IG)。其中，GS和GE序 列分別是病毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄的起始和終止識別位點。而病毒基因組復(fù)制的調(diào)控序列和病 毒RNP復(fù)合物的結(jié)合位點則位于病毒基因組5'和3'端初始的十幾個到數(shù)十個堿基內(nèi)，在 GenBank公布的所有NDV毒株中，上述堿基尤其是初始的12個核苷酸序列高度保守。目前NDV相關(guān)的的研究工作主要體現(xiàn)在兩個方面一方面，作為一種重要的禽類 病毒，NDV可以引起家禽新城疫而對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失，因此需要研究高效廣譜的 NDV疫苗；另一方面，NDV是一種天然的溶瘤病毒，具有天然的選擇性在人體腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制并且最終殺死腫瘤細(xì)胞的特性，而對人體正常細(xì)胞和組織沒有致病性，因此NDV被認(rèn)為 是一種潛在的抗腫瘤治療制劑。人們期望可以通過對NDV進(jìn)行重組改造，獲得可以用于腫 瘤臨床治療的重組NDV。上述兩個研究方向均涉及到運用反向遺傳學(xué)技術(shù)對病毒進(jìn)行體外重組和復(fù)活。 NDV復(fù)活過程中，除需要病毒基因組本身以外，同時還需要構(gòu)成RNP復(fù)合物的三個病毒蛋白 共同作用，才能完成基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因此，構(gòu)建NP、P和L基因的輔助表達(dá)質(zhì)粒是復(fù)活 過程中所必需的。要明確NP、P和L三種基因的真核表達(dá)產(chǎn)物能否正確表達(dá)，以及能否正確組裝成 RNP復(fù)合物進(jìn)而行使正常功能，則需要構(gòu)建一個帶有標(biāo)簽蛋白的病毒微型基因組進(jìn)行功能 驗證。病毒微型基因組攜帶有病毒基因組兩端的非編碼區(qū)和調(diào)控序列，同時攜帶編碼標(biāo)簽 蛋白(如DsRed、熒光素酶等)的序列。通過檢測標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，可以驗證與病毒基因組 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的NP、P和L蛋白的功能，因此，病毒的微型基因組同時也是體外重組病毒 復(fù)活過程中所需要的。同時，病毒微型基因組也可以作為研究病毒基因組調(diào)控序列和非編碼序列在調(diào)控病毒蛋白表達(dá)中作用的一種研究工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了獲得兩種不同轉(zhuǎn)錄啟動子(CMV啟動子和T7啟動子)調(diào)控下 的新城疫病毒強(qiáng)毒株Italien的NP、P和L三個基因的6種真核表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，以及用于檢 測這三個基因表達(dá)產(chǎn)物功能的攜帶不同標(biāo)簽蛋白的NDV微型基因組及其應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計可用于擴(kuò)增NDV Italien毒株NP、P和L蛋白完整編碼 序列的引物。通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫序列比對，確認(rèn)NDV基因組3'和5'的保守區(qū)域，同時設(shè)計可用 于NDVItalien毒株基因組3'和5'兩側(cè)的非編碼區(qū)的擴(kuò)增引物。通過RT-PCR，采用上述引物擴(kuò)增相應(yīng)的片段，并且進(jìn)行測序，確認(rèn)相應(yīng)的序列。基于pcDNA3. 1⑴真核表達(dá)質(zhì)粒(CMV啟動子)，將NP、P和L基因分別克隆進(jìn)入 相應(yīng)位點并且進(jìn)行真核瞬時表達(dá)，質(zhì)粒分別命名為pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。其中NP 基因表達(dá)質(zhì)粒PcDNA-NP包含SEQ No 1的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 4的氨基酸序列， P基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-P包含SEQ No 2的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 5的氨基酸序列， L基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-L包含SEQ No 3的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 6的氨基酸序列， 上述質(zhì)粒在真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白。由pIRES2-EGFP上擴(kuò)增內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)序列，并且在其上游添加 T7RNA聚合酶啟動子序列，將擴(kuò)增所得的片段與NP、P和L基因片段依次連入pMD_19T載體 中，并且在可以穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的真核細(xì)胞中瞬時表達(dá)，構(gòu)成基于T7啟動子的NP、 P和L基因的表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為T7-NP、T7-P和T7-L。其中NP基因表達(dá)質(zhì)粒T7-NP包 含SEQ No 1的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 4的氨基酸序列，P基因表達(dá)質(zhì)粒T7-P包含 SEQ No 2的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 5的氨基酸序列，L基因表達(dá)質(zhì)粒T7-L包含SEQ No 3的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 6的氨基酸序列，上述質(zhì)粒在含有T7 RNA聚合酶的真 核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白。采用overlap PCR的方法依次將NDV Italien株基因組3‘和5'端非編碼序列 和標(biāo)簽蛋白完整編碼序列反向插入到噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子和丁型肝炎病毒自身催 化核酶(HDV ribozyme)序列之間并且連接入克隆質(zhì)粒，其中病毒基因組3 ‘非編碼區(qū)cDNA 序列包含SEQ No 7的序列，病毒基因組5'非編碼區(qū)cDNA序列包含SEQ No 8的序列，構(gòu)建 得到NDV Italien微型基因組。其中標(biāo)簽蛋白分別采用紅色熒光蛋白DsRed和螢火蟲熒光 素酶，相應(yīng)的質(zhì)粒命名為MG-R和MG-L。將所得到的兩種微型基因組與兩套分別基于CMV啟動子和T7啟動子的NP、P和L 表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢測標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，確認(rèn)NP、P和L表達(dá)質(zhì)粒和微型基因組的功能。最后，將所得到的兩套NP、P和L表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)與構(gòu)建的包含NDV Italien質(zhì)粒全 長基因組cDNA序列的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，成功地在體外進(jìn)行了重組病毒的復(fù)活。所述的新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)作為體外制備重組病毒或者作 為制備病毒微型基因組的應(yīng)用。所述的檢測新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組作為體外制備重組病毒或者作為新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白的制備或功能鑒定中 的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是得到分別采用真核轉(zhuǎn)錄啟動子CMV啟動子和T7啟動子啟動 的兩套NDV Italien株NP、P和L基因的輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，可以在真核細(xì)胞以及可以在表 達(dá)T7 RNA聚合酶的真核細(xì)胞中高效表達(dá)病毒蛋白。同時得到了兩種攜帶不同報告基因的 檢測新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組，可以用來檢測所構(gòu)建的三種 輔助蛋白表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的功能，同時也可以用于病毒基因組功能以及重組病毒的研究。


圖1為pcDNA-NP質(zhì)粒圖譜。圖2為pcDNA-P質(zhì)粒圖譜。圖3為pcDNA-L質(zhì)粒圖譜。圖4為pcDNA-NP轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞瞬時表達(dá)NP蛋白免疫熒光檢測結(jié)果(400X)， 一抗兔抗NDV多克隆抗體；二抗羊抗兔IgG-Cy3抗體。圖5為pcDNA-P轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞瞬時表達(dá)P蛋白免疫熒光檢測結(jié)果(400X)， 一抗兔抗NDV多克隆抗體；二抗羊抗兔IgG-Cy3抗體。圖6為T7-NP質(zhì)粒圖譜。圖7為T7-P質(zhì)粒圖譜。圖8為T7-L質(zhì)粒圖譜。圖9為T7-NP轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞瞬時表達(dá)NP蛋白免疫熒光檢測結(jié)果(200X)。 一抗兔抗NDV多克隆抗體；二抗羊抗兔IgG-FITC抗體。圖10為T7-P轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞瞬時表達(dá)P蛋白免疫熒光檢測結(jié)果(200X)，一 抗兔抗NDV多克隆抗體；二抗羊抗兔IgG-Cy3抗體。圖11為MG-R質(zhì)粒圖譜。圖 12 為 MG-R 與 pcDNA-NP、pcDNA_P 和 pcDNA-L 共轉(zhuǎn)染 BSR-T7/5 細(xì)胞后細(xì)胞裂解 液通過western blot檢測DsRed的表達(dá)結(jié)果。A 轉(zhuǎn)染微型基因組質(zhì)粒MG-R ；B 共轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒 pcDNA-NP、pcDNA-P 和 pcDNA-L ；C 共轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L與微型基因組質(zhì)粒MG-R.圖13為MG-L質(zhì)粒圖譜。圖14為MG-L與T7-NP、T7-P和T7-L共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞后細(xì)胞裂解液通過螢 火蟲熒光素酶報告系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶的表達(dá)結(jié)果。
具體實施例方式1.實驗材料1. 1病毒和細(xì)胞系_ tt NDV Italien S Volker Schirrmacher (Division of Cellular Immunology, German Cancer Research Center, Germany)饋貝曾；BSR-T7/5 MM^ Karl-Klaus Conzelmann (Ludwig-Maximilians-UnivercityMunich，Germany)饋贈；SMMC-7721細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。1. 2菌種與質(zhì)粒pIRES2-EGFP 和 pDsRedl-Nl 質(zhì)粒購自 Clontech 公司；pcDNA-3. 1 (+)質(zhì)粒購自 Invitrogen 公司；pGL3-Basic 質(zhì)粒購自 Promega 公司；pMD-19T simple vector T 載體購自 TaKaRa 公司；E.coli DH5a 實驗室自備。1. 3主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)公司)；病毒RNA/DNA快速純化試劑盒(TaKaRa公司)；PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司)；限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR HS DNA 酶、T4DNA 連接酶(TaKaRa 公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒(OMEGA公司)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司)；4%多聚甲醛固定液；0. 5% Triton 溶液;兔抗 NDV 血清由 Volker Schirrmacher (Division of Cellular Immunology, GermanCancer Research Center, Germany) ；羊抗兔IgG-Cy3單抗(Sigma公司)；無病原體雞種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。2.方法2. 1引物設(shè)計基于GenBank數(shù)據(jù)庫，選取NP、P和L蛋白編碼序列兩端設(shè)計引物，同時添加Kozak 序列和兩段相應(yīng)的酶切位點，引物序列如下表(下劃線表示酶切位點)
L-FltaatgcggccgccacggctaaacaactcacL-F2taaccatgggccaccatggcaagctccggtccL-RgcattctagatgaatccgaatacgagtcttIRES-FagtaatacgactcactatagggtctcgagctcaagcttcgIRES-Raattctagaaatccatggttacttgtacagctcgtc上述引物中，NP-Fl和 NP-R、P-Fl 和 P_R、L-Fl 和 L-R 分別擴(kuò)增 NDV Italien 株 NP,P和L基因編碼序列，分別命名為NPl、P1和Li，分別被插入pcDNA3. 1⑴相應(yīng)酶切位點中。上述引物中，NP-F2和 NP-R、P-F2 和 P_R、L-F2 和 L-R 分別擴(kuò)增 NDV Italien 株 NP、P和L基因編碼序列，分別命名為NP2，P2和L2，分別被插入只攜帶T7啟動子的表達(dá)質(zhì) 粒中。上述引物中，IRES-F和IRES-R用來從pIERS2_EGFP質(zhì)粒中擴(kuò)增IRES完整序列， 所得產(chǎn)物命名為IRES。通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫序列比對，確認(rèn)NDV基因組3'和5'的保守區(qū)域并設(shè)計引物，合 成可用于NDV Italien株基因組3'和5'兩側(cè)的保守區(qū)域的擴(kuò)增引物。引物序列如下表
引物名稱引物序列(5'到3'方向)Tailer-FgccaccacctgttcctgtagtaaaggcaatcacatattTailer-RtatctagagtaatacgactcactatagggaccaaacaaagatttggtLeader-FttcggaccgcgaggaggtggagatgccatgccgacccaccaaacagagattctgtgaLeader-RgaggagcgcaccatggtggcgtcagcagaaggctctctDsRed-FgccaccatggtgcgctcctcDsRed-RctacaggaacaggtggtggcPairA-FagtaatacgactcactatPairA-RaggcaatcacatattaaLuci-FagagccttctgctgacaaagccaccatggaagacgccLuci-RtaatatgtgattgcctttacacggcgatctttccPairB-FgtcagcagaaggctctctPairB-RttataagctaatcggccgTailer-F 和 Tailer-R、Leader_F 和 Leader-R 分別用于擴(kuò)增 NDV Italien 基因組 的3'和5'非編碼區(qū)，并且在兩端分別添加T7啟動子序列和部分HDV ribozyme序列，所 得產(chǎn)物分別命名為TS和LS。DsRed-F和DsRed-R用于從質(zhì)粒pDsRedl_Nl中擴(kuò)增DsRed的 編碼序列，所得產(chǎn)物命名為DS。PairA-F和PairA-R、PairB-F和PairB-R分別用于由微型基因組質(zhì)粒MG-R(見 2.7)中擴(kuò)增NDV Italien株基因組的3'和5'非編碼區(qū)及其兩側(cè)的T7啟動子和HDV ribozyme序列，所得產(chǎn)物分別命名為PairA和PairB。Luci-F和Luci-R用于從質(zhì)粒 pGL3-Basic中擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶的編碼序列，所得產(chǎn)物命名為Luci。2. 2病毒培養(yǎng)及純化將NDV Italien株接種于9日齡的無病原體雞胚的尿囊腔中。選48小時后死亡 的雞胚，收集尿囊液。通過低溫超速離心以獲得濃縮的病毒懸液。2. 3病毒蛋白編碼序列以及基因組兩端非編碼序列的獲得提取2. 2中所得病毒的基因組RNA，通過分段RT-PCR，采用2. 1中所設(shè)計的引物獲 得cDNA亞片段，分別是NDV Italien株NP、P和L的編碼序列以及基因組3'和5'端非編 碼序列。所得的片段均通過凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，連入T載體中進(jìn)行測序，確認(rèn)所得片 段的正確性。2. 4 IRES序列、DsRed編碼序列和螢火蟲熒光素酶編碼序列的獲得利用2. 1中所合成引物，從質(zhì)粒pIRES2-EGFP中擴(kuò)增IRES片段，從質(zhì)粒 PDsRedl-Nl中擴(kuò)增DsRed完整編碼序列，從質(zhì)粒pGL3-BasiC中擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶完整編 碼序列。所得的PCR產(chǎn)物連入T載體中進(jìn)行測序，確認(rèn)所得片段的正確性。2. 5基于CMV轉(zhuǎn)錄啟動子的病毒NP、P和L基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證將2.3中所得片段呢1、？1和1^1(命名見2.1)分別通過相應(yīng)的酶切，插入 pcDNA3. 1 (+)多克隆位點中，所構(gòu)成的質(zhì)粒經(jīng)過測序，確認(rèn)連接以及片段序列正確后，分別 命名為 pcDNA-NP (圖 1)、pcDNA-P(圖 2)和 pcDNA-L (圖 3)。將獲得的質(zhì)粒pcDNA-NP和pcDNA-P，通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染 BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36小時后，通過間接免疫熒光方法檢測NP和P蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖 4和圖5所示，均檢測到相應(yīng)病毒蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。2. 6基于T7啟動子的病毒NP、P和L基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證將2. 4中所得到的IRES序列直接連入T載體，再將2. 3中所得到的片段NP2、P2 和L2(命名見2. 1)采用酶切方式分別克隆入載體，所得的片段最后經(jīng)過測序，確定連接和 插入片段正確后，分別命名為T7-NP(圖6)、T7-P(圖7)和T7_L(圖8)。將T7-NP和T7-P分別利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 36小時后，通過間接免疫熒光方法檢測NP和P蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖9和圖10所示，均檢測到病毒蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。2. 7攜帶DsRed編碼序列的病毒微型基因組的構(gòu)建將2. 3以及2. 4中所得到的片段TS、LS和DS (命名見2. 1)通過overlap PCR的 方法，利用引物之間的重疊互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行連接，再將所得到的連接片段連入T載體中，隨后 將所得的質(zhì)粒測序，確認(rèn)連接以及片段序列正確后，將所得的質(zhì)粒命名為MG-R(圖11)。2. 8攜帶DsRed編碼序列的的病毒微型基因組以及基于CMV啟動子的病毒NP、P和 L基因真核表達(dá)質(zhì)粒功能的檢測將2. 7中所構(gòu)建的MG-R與2. 5中所構(gòu)建的pcDNA_NP、pcDNA_P和pcDNA-L質(zhì)粒通 過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，24小時后裂解細(xì)胞，western blot 方法檢測DsRed表達(dá)，結(jié)果如圖12所示，表明DsRed成功地進(jìn)行了表達(dá)。同時也驗證了本 發(fā)明所構(gòu)建的pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)并且具有組裝RNP 復(fù)合物的功能。2. 9攜帶螢火蟲熒光素酶的病毒微型基因組的構(gòu)建將2. 3和2. 4中所得到的片段PairA、PairB和Luci (命名見2. 1)通過overlap PCR的方法，利用引物之間的重疊互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行連接，將所得到的連接片段連入T載體中， 隨后將所得的質(zhì)粒測序，確認(rèn)連接以及片段序列正確后，將所得的質(zhì)粒命名為MG-L(圖 13)。2. 10攜帶螢火蟲熒光素酶的病毒微型基因組以及基于T7啟動子的病毒NP、P和L 基因表達(dá)質(zhì)粒功能的檢測將2. 9所得到的MG-L通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000,與2. 6中所得到的質(zhì)粒 T7-NP、T7-P和T7-L共同轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后，裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液加入 螢火蟲熒光素酶反應(yīng)底物，檢測熒光表達(dá)強(qiáng)度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果如圖14所示， 表明MG-L中螢火蟲熒光素酶成功表達(dá)。同時也驗證了本發(fā)明所構(gòu)建的T7-NP、T7-P和T7-L 質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)并且具有組裝成RNP復(fù)合物的功能。2. 11 T7-NP、T7-P和T7-L質(zhì)粒在制備NDV Italien重組病毒中的應(yīng)用將2. 6中構(gòu)建的T7-NP、T7_P和T7_L表達(dá)質(zhì)粒與本發(fā)明人以往構(gòu)建的包含 NDVItalien全長基因組cDNA序列的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染7天后，觀察到病毒 導(dǎo)致的細(xì)胞病變，而在對照組沒有觀察到此現(xiàn)象。通過反復(fù)凍融實驗組細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解 液，將裂解液再次感染BSR-T7/5細(xì)胞以擴(kuò)增重組病毒，通過RT-PCR方法檢測重組病毒基因 組特定片段并測序，測序結(jié)果表明在病毒基因組HN和F基因之間插入了一段特征性的外源 基因片段，確認(rèn)了所得到的病毒為體外構(gòu)建的重組病毒，表明體外復(fù)活重組病毒成功。該實 驗同時表明，T7-NP、T7-P和T7-L表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)能夠在體外與包含病毒基因組質(zhì)粒共同作 用而制備重組病毒。
10
權(quán)利要求
新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，包括基于pcDNA3.1(+)質(zhì)粒構(gòu)建的新城疫病毒Italien株的NP基因、P基因和L基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA NP、pcDNA P和pcDNA L，其中NP基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA NP包含SEQ No 1的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 4的氨基酸序列，P基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA P包含SEQ No 2的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 5的氨基酸序列，L基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA L包含SEQ No 3的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 6的氨基酸序列，上述質(zhì)粒在真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白。
2.新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，包括新城疫病毒Italien株的NP基因、 P基因和L基因的表達(dá)質(zhì)粒T7-NP、T7-P和T7-L，所述的質(zhì)粒只存在T7RNA聚合酶啟動子， 并且在下游依次插入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)序列和新城疫病毒Italien株的NP、P和 L蛋白編碼序列，其中NP基因表達(dá)質(zhì)粒T7-NP包含SEQ No 1的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 4的氨基酸序列，P基因表達(dá)質(zhì)粒T7-P包含SEQ No2的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 5 的氨基酸序列，L基因表達(dá)質(zhì)粒T7-L包含SEQ No3的序列，其表達(dá)產(chǎn)物包含SEQ No 6的氨 基酸序列，上述質(zhì)粒在含有T7 RNA聚合酶的真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒Italien株NP 蛋白、P蛋白和L蛋白。
3.檢測如權(quán)利要求1所述的新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組， 其特征在于在T7RNA聚合酶啟動子序列和丁型肝炎病毒自身催化核酶(HDVribozyme)序 列之間，反向插入新城疫病毒Italien株基因組3'非編碼區(qū)cDNA序列、標(biāo)簽蛋白編碼序列 以及新城疫病毒Italien株基因組5 ‘非編碼區(qū)cDNA序列，其中新城疫病毒Italen株基因 組3'非編碼區(qū)cDNA序列包含SEQ No 7的序列，新城疫病毒Italien株基因組5'非編碼 區(qū)cDNA序列包含SEQ No 8的序列，所述的微型基因組由T7RNA聚合酶引導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物在同時存在新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白時，在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 其攜帶的標(biāo)簽蛋白。
4.檢測如權(quán)利要求2所述的新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組， 其特征在于在T7RNA聚合酶啟動子序列和丁型肝炎病毒自身催化核酶(HDVribozyme)序 列之間，反向插入新城疫病毒Italien株基因組3'非編碼區(qū)cDNA序列、標(biāo)簽蛋白編碼序 列以及新城疫病毒Italien株基因組5'非編碼區(qū)cDNA序列，其中新城疫病毒Italien株 基因組3'非編碼區(qū)cDNA序列包含SEQ No 7的序列，新城疫病毒Italien株基因組5'非 編碼區(qū)cDNA序列包含SEQ No 8的序列，所述的微型基因組由T7 RNA聚合酶引導(dǎo)基因的轉(zhuǎn) 錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在同時存在新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白時，在真核細(xì)胞內(nèi) 表達(dá)其攜帶的標(biāo)簽蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)作為體外制備重組病 毒或者作為制備病毒微型基因組的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求2所述的新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)作為體外制備重組病 毒或者作為制備病毒微型基因組的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求3所述的檢測新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組作 為體外制備重組病毒或者作為制備新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白或功能 鑒定中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求4所述的檢測新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組作為體外制備重組病毒或者作為制備新城疫病毒Italien株NP蛋白、P蛋白和L蛋白或功能 鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于不同轉(zhuǎn)錄啟動子的新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)和檢測該系統(tǒng)的微型基因組及其應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是得到分別采用真核轉(zhuǎn)錄啟動子CMV啟動子和T7啟動子啟動的兩套NDV Italien株NP、P和L基因的輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，可以在真核細(xì)胞以及可以在表達(dá)T7RNA聚合酶的真核細(xì)胞中高效表達(dá)病毒蛋白。同時得到了攜帶不同標(biāo)簽蛋白的檢測新城疫病毒Italien株輔助表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的微型基因組，可以用來檢測所構(gòu)建的三種輔助蛋白表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的功能，同時也可以用于病毒基因組功能以及重組病毒制備的研究。
文檔編號C12N15/63GK101928727SQ20101017988
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月22日
發(fā)明者馮浩, 南剛, 尉丁, 邊惠潔, 陳志南 申請人:陳志南