專利名稱：：新城疫病毒感染性克隆、疫苗及診斷分析的制作方法新城疫病毒感染性克隆、疫苗及診斷分析本申請是申請日為1999年6月17日、申請?zhí)枮?9809714.4、發(fā)明名稱為"新城疫病毒感染性克隆、疫苗及診斷分析"的發(fā)明專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及家禽的新城疫病毒感染。新城疫病毒(NDV)是變化最多的致死性禽病原體之一。在幾個不同地理區(qū)域幾乎同時發(fā)生的表觀為新疾病的新城疫以及該病在類型和嚴重性方面的極大差別導致命名上的混亂。該病曾被命名為假家禽疫、假家禽瘟疫、禽瘟、禽瘟熱和禽肺炎腦炎。該病的重要性主要是由于20世紀家禽業(yè)發(fā)展成依賴于國家間貿(mào)易的高效國際工業(yè)。通常認為新城疫的首次爆發(fā)是1926在印度尼西亞的爪哇，以及英國的Newcastle-upon-Tyne(Kraneveld,1926;Doyle,1927)。新城疫的名稱是由Doyle所取，以避免可能與其他疾病混淆的描述性名稱。后來很清楚其他嚴重程度較低的疾病是由與NDV不可區(qū)分的病毒導致。在美國，一種相對溫和的呼吸道疾病被命名為禽肺炎腦炎并已示出由NDV導致(Beach,1944)。在幾年內(nèi)世界上制備了導致雞的極溫和疾病或不致病的許多NDV分離株。下述方法牽涉疾病的傳播1)活鳥、野生鳥、狩獵鳥、賽鴿和商業(yè)家禽的運輸；2)人和設備的遷移；3)家禽產(chǎn)品的運輸；4)空氣傳播；5)污染的家禽飼料；6)污染的水；7)不完全滅活的或異源的疫苗。根據(jù)OIE，新城疫是由禽副粘病毒血清型1(APMV—l)病毒導致的家禽疾病，該病毒在1日齡雞中的腦內(nèi)致病性指數(shù)(ICPI)為0.7或更高。強毒株也可通過在F2蛋白的C末端存在多個堿性氨基酸以及在Fl蛋白的N—末端的殘基117存在F(苯丙氨酸)而證實。不能證實這個氨基酸序列將需要通過ICPI試驗鑒定。術語"家禽"是指圈養(yǎng)用來育種、生產(chǎn)肉或蛋用來消費或用來供狩獵的家禽、火雞、珍珠雞、鴨、鵝、韓、鵒、野雞、鵪鶇和平胸類鳥。根據(jù)Alexander(1988)，自從首次識別新城疫以來已發(fā)生了3次該病的流行。第一次為該病的初次爆發(fā)并似乎起于東南亞。獨立的爆發(fā)，如1926年在英國的爆發(fā)是緩慢從亞洲至歐洲移動的主流之前的偶然引入。第二次流行似乎在60年代晚期起于中東，并至1973年到達大多數(shù)國家。第二次流行的較快擴散可能由于相當?shù)膰H貿(mào)易導致的家禽業(yè)的大變革所致。第三次流行主要影響馴養(yǎng)鳥類如家鴿和野鴿(VindevogelandDuchatel,1988)。該病于70年代晚期起于中東，至1981年其已到達歐洲，然后快速傳播至世界上所有地區(qū)，這很大程度上是由于比賽和觀賞鳥之間的接觸以及這種鳥的國際貿(mào)易所致。目前，新城疫仍在亞洲、非洲、美洲和歐洲的許多國家廣泛傳播。僅有大洋洲國家似乎相對沒有這種疾病(Spradbrow,1988)。NDV屬于Mononegavirales目，副粘病毒科，副粘病毒亞科，Rubulavirus屬。除了通常稱為禽副粘病毒1型的NDV，稱為副粘病毒2—9型的8個其他血清型可在血凝集抑制試驗和血清中和試驗中基于它們的抗原相關性區(qū)分(Alexander,1993)。除了血清學分組的一致性，不同血清型病毒之間有一些交叉相關性。.NDV的基因組是單鏈負極性RNA分子，與避免病毒蛋白的信使RNA互補。該RNA基因組大小約15200nt，編碼下述基因產(chǎn)物(從基因組RNA的3'末端至5'末端列出)核衣殼蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，融合蛋白(F)，血凝素一神經(jīng)酰胺酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)(Chambers等，1986)。RNA與NP，P和L蛋白復合形成核糖核衣殼顆粒(RNP)，其被內(nèi)側排列M蛋白的包膜環(huán)繞。包膜含有參與附著并穿透宿主細胞的F和HN蛋白。NDV的復制與其他副粘病毒所用策略類似。起始步驟是病毒附著于宿主細胞受體，這由HN蛋白介導。病毒包膜與宿主細胞膜的融合依賴于HN和F蛋白的作用，并導致RNP釋放進細胞質(zhì)，在此發(fā)生病毒復制。病毒RNA依賴性RNA聚合酶(其是RNP的一部分)產(chǎn)生起mRNA作用的互補轉(zhuǎn)錄物，并被細胞翻譯機制利用而合成病毒蛋白。由于NP蛋白的積累，RNA聚合酶復合物從轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)為復制，導致合成全長基因組和反基因組RNA分子。新形成的RNP在細胞膜上經(jīng)積累在細胞質(zhì)膜中的M蛋白和F及HN蛋白的作用而包被。經(jīng)芽生機制從感染的細胞釋放新形成的病毒顆粒。NDV復制的更詳細信息參見Peeples(1988)。副粘病毒科的分子生物學的最新綜述見LambandKolakofsky(1996)。除了商業(yè)家禽(即雞、火雞、野雞、珍珠雞、鴨、鵝、鴿)之夕卜，各種俘獲鳥、半馴化鳥和野生鳥包括遷移性水禽也易感于NDV，并可是初級感染來源(KaletaandBaldauf，1988)。NDV毒株的致病性隨宿主而大大不同，最具抗性的物種似乎是水生鳥類，而最易感的是形成臨時性或永久禽群的群居鳥。雞是高度易感的，鴨和鵝可被感染但很少或不顯示臨床跡象，即使用對雞致死的毒株也是如此。新城疫很復雜，因為病毒的不同分離株和毒株可誘導差別非常大的疾病嚴重程度。BeardandHanson(1984)將NDV毒株分成與在完全易感的小雞中可見的疾病跡象相關的不同表型l)趨內(nèi)臟強毒NDV，其產(chǎn)生急性致死性感染，其中在內(nèi)臟中出血性損害占主導；向神經(jīng)性強毒NDV，其產(chǎn)生高致死性，前趨癥狀為呼吸道和神經(jīng)學癥狀，但無內(nèi)臟損害；2)中等毒力NDV，其在某些鳥中產(chǎn)生低致死性，急性呼吸道疾病和神經(jīng)癥狀；3)輕型NDV，其產(chǎn)生溫和的或不明顯的呼吸道感染或甚至無癥狀腸道NDV，其為似乎主要在腸道復制的無毒病毒。已報道與不同組相關的癥狀之間的某些重疊。病毒經(jīng)呼吸道和腸道或經(jīng)眼進入體內(nèi)。在氣管中，病毒經(jīng)纖毛作用或經(jīng)細胞至細胞傳播而擴散。最初在導入位點繁殖后，病毒在病毒血癥過程中被攜帶至脾、肝、腎和肺。某些毒株的病毒非?？焖俚氐竭_重要器官如肝和腎，從而鳥可在疾病癥狀明顯前死亡。大多數(shù)病毒在顯著量的抗體出現(xiàn)之前就經(jīng)血液到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)。推定在鸚鵡中發(fā)生的長期無癥狀攜帶者狀態(tài)對家禽業(yè)構成了潛在的威脅。輕型和強毒病毒的長期攜帶者狀態(tài)也可存在于雞中(HeuscheleandEasterday，1970)。在NDV復制過程中，需要使前體糖蛋白Fo裂解成Fl和F2才能使子代病毒變?yōu)楦腥拘缘?RottandKlenk，1988)，這一翻譯后裂解由宿主細胞蛋白酶介導。如果沒發(fā)生裂解，則產(chǎn)生非感染性病毒顆粒，病毒復制不能進行。強毒病毒的Fo蛋白可被各種蛋白酶裂解，但是在弱毒病毒中的Fo蛋白的受其敏感性限制，這些病毒在體內(nèi)僅能在某些宿主細胞類型中生長，并且通常不能體外生長。輕型病毒僅在具有類似胰蛋白酶的酶的區(qū)域如呼吸道和腸道中復制，而強毒病毒能在一系列組織和器官中復制，產(chǎn)生致命的系統(tǒng)性感染。Fo前體的氨基酸測序表明弱毒病毒具有連接F2和Fl鏈的單個精氨酸(R)，而強毒病毒毒株具有額外的堿性氨基酸，在裂解位點形成兩個配對如K/R-X-K/R-R-F。另外，強毒株的F2鏈通常以苯丙氨酸殘基起始，而無毒毒株的F2鏈通常以亮氨酸開頭。對于幾個NDV毒株，HN蛋白也作為需要裂解而具有生物學活性的前體產(chǎn)生(Garten等，1980;Millar等，1988)。除了F和HN蛋白的可裂解性之外，其他病毒因子也可能對致病性有貢獻。Madansky和Bratt(1978，1981a，1981b)已證明轉(zhuǎn)錄和翻譯中的改變可調(diào)節(jié)病毒的生長和細胞至細胞傳播和/或細胞致病性。對NDV感染的最初免疫應答是細胞介導的并可早在用活疫苗株感染后2_3天即檢測到，這推定解釋了在接種的鳥中記錄到的在可檢測的抗體應答可見之前的抗攻擊早期保護(GoughandAlexander,1973)。在感染后約1周，循環(huán)抗體可保護宿主免受再感染，在早期中涉及IgM，隨后是IgG。在約3周后滴度和保護達到峰值，并且如果沒有加強免疫則逐漸降低，這意味著對于較老的鳥，再接種是必需的。僅有通過呼吸途徑給予的活疫苗在所有粘膜表面和血清中刺激抗體。失活的疫苗，甚至當經(jīng)肌肉內(nèi)途徑施用時，即使血清抗體濃度很高，也不激發(fā)呼吸道中的局部抗性。這一點強調(diào)了能提呈病毒抗原至上呼吸道以誘導局部和系統(tǒng)免疫性的活疫苗的重要性。小滴穿透進下呼吸道，主要產(chǎn)生體液免疫應答，而大滴在上呼吸道刺激局部免疫性。因此，具有寬范圍滴大小的氣霧劑產(chǎn)生最佳整體局部和體液免疫性。但是應注意到，盡管用目前的疫苗密集接種產(chǎn)生高水平抗體滴度，但是病毒仍可從粘膜表面回收。在美國鑒定新城疫導致應用滅活疫苗(Hofstad，1953)。觀察到某些地方性動物病病毒僅產(chǎn)生溫和疾病，首先導致開發(fā)了中等毒力活疫苗株Roakin(Beaudette等，1949)，隨后開發(fā)了更溫和的HitchnerBl(HitcnerandJohnson,1948)和LaSota(Goldhaft,1980)，后二者是目前應用最廣的活疫苗。NDV活疫苗可分成兩組，輕型和中等毒力的，中等毒力毒株由于其毒力較強僅適合作鳥的二次接種。免疫應答隨活疫苗致病性的增加而增強，因此，為獲得所需水平的保護而不發(fā)生嚴重反應，目前所用接種程序涉及依次使用毒力漸進的疫苗，或者先使用活疫苗，隨后使用滅活疫苗。活疫苗的主要優(yōu)點是它們可經(jīng)非昂貴的大量施用技術給予，常用的施用方法是經(jīng)飲用水。但是，飲用水施用必需嚴格監(jiān)控，因為病毒可經(jīng)過量熱和光滅活，并經(jīng)水中殺病毒性雜質(zhì)滅活。通過噴霧和氣霧劑大量施用活疫苗也是非常普及的，因為使用這種方法可在短時間內(nèi)接種大量鳥。重要的是通過控制產(chǎn)生顆粒的條件達到正確顆粒大小。目前使用的活疫苗具有幾個缺點，根據(jù)環(huán)境條件和合并感染的存在，該疫苗仍可導致疾病跡象。因此，重要的是應用非常溫和的病毒進行初次接種，由此通常需要多次接種。另外，母體衍生的抗體可阻止用輕型活疫苗進行的成功初次接種。滅活疫苗通常從感染性尿囊液產(chǎn)生，感染性尿囊液用福爾馬林或P丙內(nèi)酯處理以滅活病毒，并與合適佐劑混合。滅活疫苗經(jīng)肌肉內(nèi)或皮下注射給予。生產(chǎn)和應用滅活疫苗很昂貴。但是，滅活油乳液疫苗不象活疫苗一樣受母體免疫性負面影響，它們可用于幾日齡雞。滅活疫苗的優(yōu)點是在接種鳥中的副反應水平較低，保護抗體水平高，保護期長。上述疫苗與野生型NDV在血清學上均不可區(qū)分。近年來，重組病毒疫苗的開發(fā)已引起家禽業(yè)的興趣。這一概念是將感興趣致病因子的關鍵免疫表位基因插入載體病毒的非必需基因中。因此用重組病毒接種導致抗載體病毒和感興趣疾病因子的免疫。已評價了作為家禽的潛在活病毒疫苗的幾種類型病毒，最為關注的兩種禽類病毒是禽痘病毒(FPV)和火雞皰疹病毒(HVT)。禽痘病毒是DNA病毒，其具有大的基因組，并因此被認為具有充足空間來攜帶外來基因。當減毒時，F(xiàn)PV不導致臨床疾病并通常用作雞的疫苗。HVT也是DNA病毒，并被分類為Marek氏病病毒(MDV)家族的血清型III，HVT對于雞是非病原性的，但仍交叉保護抗MDV，并通常用于免疫雞以抗Marek氏病。己表明抗新城疫的保護可用重組HVT或FPV疫苗誘導(Morgan等，1992，1993;Heckert等，1996;Bo腦ell等，1990;Taylor等，19卯)。但是，用表達NDVF蛋白或F和HN蛋白的重組病毒接種后，抗新城疫的保護的起始與用傳統(tǒng)活或滅活NDV疫苗接種相比顯著延遲，這可能是由于重組疫苗不提供除由重組疫苗表達的NDV蛋白上發(fā)現(xiàn)的抗原性相關NDV表位之外的足夠?qū)捗庖邔W范圍的抗原性相關NDV表位，或者不能正確提呈至免疫系統(tǒng)。另外，局部(粘膜、呼吸道或腸道)保護不能在用重組體接種的鳥中誘導。這是一個嚴重的缺點，因為用于抗呼吸道疾病的初次免疫的疫苗必須誘導局部免疫性以防止感染在野外條件詞養(yǎng)的雞的強毒病毒的感染和傳播。能保護宿主的抗NDV抗體可以在病毒中和試驗中測量，但是，由于中和應答看起來與血凝素抑制(HI)應答平行，所以后一試驗通常用于評價保護應答，特別是在接種后?？笷和HN蛋白的抗體可中和NDV，但是在體內(nèi)和體外試驗中抗F蛋白的抗體看起來比抗HN抗體誘導更強的中和(Meulemans等，1986)。在鳥血清中存在抗NDV特異抗體幾乎不給出對NDV感染株的信息，因此具有有限的診斷學價值。在多數(shù)國家中輕型NDV毒株在鳥中的遍在以及至少不能與野生型NDV血清學區(qū)分的活疫苗的幾乎全球使用，意味著僅僅證實感染不是采取控制措施的合適原因。由于野外疾病可能不是病毒真正毒力的可靠測量，需要進一步鑒定所發(fā)現(xiàn)的病毒。目前，唯一的能夠鑒定感染毒株的新城疫診斷方法是分離病毒，隨后進行致病性測試。目前有三種體內(nèi)測試用于這一目的l)在卵中的平均死亡時間(MDT);2)在1日齡雞中的大腦內(nèi)致病性指數(shù)(ICPI);3)在6周齡鳥中的靜脈內(nèi)致病性指數(shù)(IVPI)。這些測試有許多缺點，如動物的可利用性，差再現(xiàn)性，以及相對長的測試時間，并且這些測試不能簡單地經(jīng)血清學鑒定用疫苗接種的家禽或被野生型毒株感染的家禽。作為體內(nèi)測試的替代方法，聚合酶鏈反應(PCR)已成功地用于區(qū)分強毒和無毒分離株(Stauber等，1995;Kant等，1997)，但是，同樣血清學區(qū)分也是不可能的。目前家禽飼養(yǎng)和其產(chǎn)品的貿(mào)易呈國際化，通常由跨國公司管理。新城疫的威脅已表明是對這種貿(mào)易的極大限制。僅當所有國家均報道爆發(fā)新城疫時，其才能得到成功控制。但是，國際間協(xié)議不是很簡單的，因為在不同國家中疾病監(jiān)視程度差異巨大，某些國家不進行接種并且不希望任何形式的NDV被導入家禽，因為接種的家禽不能與被野生型NDV感染的家禽區(qū)分開。其他一些國家僅允許使用特異的活疫苗并認為其他疫苗的毒力不能被接受。還有一些國家持續(xù)存在循環(huán)的高毒力病毒，但由于明顯的疾病被接種所隱蔽而未認識到這一點。在許多國家中存在對可能發(fā)生的新城疫爆發(fā)的控制的立法，國家控制措施是防止引入和傳播。大多數(shù)國家有對家禽產(chǎn)品、蛋和活家禽貿(mào)易的限制，大多數(shù)國家已建立了進口特別是鸚鵡鳥的檢疫程序。一些國家已采取根除政策，強制性屠宰被感染的鳥、其接觸物和產(chǎn)品，其他國家甚至在不存在疾病爆發(fā)時也要求鳥的預防性接種，而一些國家采取圍繞爆發(fā)區(qū)的環(huán)形接種政策以建立緩沖區(qū)。很明顯，需要可用于控制新城疫的更好的疫苗和更好的診斷方法。由于在大量應用活疫苗過程中個體鳥接受的劑量的很大不同以及在幼雞中母體免疫性水平的差別，活疫苗的接種后反應是不可避免的，這是在強制接種的國家中農(nóng)民的一個主要關注問題。另外，許多疫苗是亞群的混合物，當克隆時，這些亞群互相在免疫原性和致病性方面可顯著不同(Hanson，1988)。但是目前所用活疫苗和滅活疫苗的最大的缺點是用目前所用的篩選技術如血凝素抑制或病毒中和試驗不能區(qū)分接種的動物和感染的動物。強毒野外病毒仍可能在接種禽類中傳播，因為疾病癥狀被接種所隱蔽。由于經(jīng)體內(nèi)技術分離病毒和鑒定毒力在大規(guī)模上是不可行的，因此非常需要新的和有效的能與野外病毒血清學區(qū)分的減毒活疫苗。這種疫苗稱為NDV標記疫苗(及所伴隨的診斷方法和試劑盒)應提供最完全免疫學范圍的可能的抗原性相關NDV表位，并且應與野生型NDV有血清學區(qū)別，這種疫苗目前尚不存在。本發(fā)明提供了一種通過基因修飾而修飾禽副粘病毒基因組的方法，提供了基因修飾的禽副粘病毒和禽副粘病毒標記疫苗?，F(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展使得可以對許多RNA病毒包括負鏈RNA病毒進行基因修飾，這一技術通常稱為"反向遺傳學"。首先提供病毒RNA的一個(全長)cDNA拷貝，隨后在易感細胞中將此DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生感染性RNA，該感染性RNA可再次復制產(chǎn)生感染性病毒顆粒。原則上，通過用標準分子生物學技術預先修飾cDNA，可以獲得基因修飾的RNA病毒，但是這對于NDV或其他禽副粘病毒從未實現(xiàn)過，甚至還不能產(chǎn)生小基因組片段或禽副粘病毒基因組片段的質(zhì)粒來研究禽副粘病毒的復制事件，由此了解如何構建感染性拷貝病毒。令人驚奇地，雖然在本說明書中已完全確認禽副粘病毒基因組是目前測序的所有副粘病毒基因組中最小的，但是特別是NDV基因組的5'末端序列比預先認為的、并且通過與其他副粘病毒科的對比所預期的要長得多。本發(fā)明首次提供了禽副粘病毒基因組的全序列并提供了這種病毒的全長或小基因組長度cDNA。本發(fā)明提供了禽副粘病毒cDNA，其至少包含相應于禽副粘病毒基因組5'末端的核酸序列，使得能產(chǎn)生禽副粘病毒的感染性拷貝，所述cDNA優(yōu)選包含全長cDNA。但是，本發(fā)明也提供了cDNA，其至少包含相應于禽副粘病毒基因組的5'末端的核酸序列，由此能產(chǎn)生復制性禽副粘病毒小基因組。這種小基因組可有利地用于從修飾的核酸序列轉(zhuǎn)錄RNA和/或表達蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了至少部分衍生于新城疫病毒的本發(fā)明的cDNA，例如，其中所述新城疫病毒是輕型病毒，優(yōu)選衍生自疫苗株，如LaSota毒株ATCCVR—699。本發(fā)明還提供了核酸中額外具有修飾如缺失、插入、突變、顛換等的本發(fā)明的cDNA。例如，提供了一種cDNA，其中所述修飾包括編碼修飾的蛋白酶裂解位點的核酸，例如其中所述裂解位點是融合(F)蛋白的蛋白酶裂解位點。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了cDNA，其中所述的修飾包括編碼雜合病毒蛋白的核酸，所述雜合病毒蛋白如雜合血凝素一神經(jīng)酰胺酶(HN)蛋白，如在本發(fā)明實驗部分所述。本發(fā)明還提供cDNA，其中所述修飾包括編碼病毒蛋白如基質(zhì)(M)蛋白的核酸的缺失。本發(fā)明還提供了額外具有編碼異源抗原的核酸的cDNA，優(yōu)選地其中所述抗原衍生自家禽病原體，如下所述。還提供了得自本發(fā)明的cDNA的RNA及其衍生的蛋白質(zhì)。近年來，已成功鑒定了一些不分節(jié)段負鏈RNA病毒，對其基因組的復制和表達的基礎研究的結果是能完全通過用所述病毒的克隆cDNA轉(zhuǎn)染細胞而產(chǎn)生感染性病毒(由Conzelmann綜述，1996)。目前，不分節(jié)段負鏈RNA病毒的感染性病毒已從例如狂犬病病毒(Schnell等，1994;Conzelmann，EP0702085A1)，水泡性口炎病毒(Lawson等，1995;Whelan等，1995)，仙臺病毒(Garcin等，1995)，麻疹病毒(Radecke等，1995;Schneider等，1997;EP0780475A1)，人呼吸合胞病毒(Collins等，1995)，牛瘟病毒(BaronandBarrett,1997)和人副流感病毒3型(HoffmanandBanerjee，1997,Conzelmann;EP0702085A1)的克隆cDNA產(chǎn)生。但是，所有上述感染性拷貝病毒均能在體內(nèi)和體外在宿主，組織或各種來源的細胞中生長，使得在合適細胞系中的cDNA轉(zhuǎn)染和復制及產(chǎn)生感染性病毒顆粒很容易。這種可能性在NDV中不存在，當然在能提供疫苗的輕型NDV毒株中也不存在。這種NDV毒株的毒力與其在各種細胞中復制的能力相關，由強毒株可容易地在體外和體內(nèi)復制而疫苗株僅能在體內(nèi)復制這一事實反映出。因此，很明顯NDV具有catch22情形，盡管從例如感染性cDNA產(chǎn)生感染性拷貝病毒的嘗試可能產(chǎn)生感染性病毒，但是這種病毒通常不適合用作疫苗，因為如此產(chǎn)生的感染性病毒毒力太強不能用作疫苗；在cDNA轉(zhuǎn)染細胞系后其可產(chǎn)生和復制這一事實表明其可容易地將Fo蛋白裂解成Fl和F2，如上述所討論的NDV毒力的特點。使用疫苗株作為cDNA的親代材料不能解決這一問題;疫苗株特別是輕型不含容易裂解的Fo蛋白，使得第一代病毒不能持續(xù)復制。用于感染的細胞不能用于支持具有不裂解Fo蛋白的疫苗型病毒的一或多輪復制。本發(fā)明提供了這一問題的解決方案，提供了感染性拷貝cDNA，例如用于疫苗中。本發(fā)明提供了產(chǎn)生感染性拷貝新城疫病毒的方法，包括用所述病毒的克隆的全長或基因組長度cDNA轉(zhuǎn)染細胞，該細胞能表達病毒NP，P和L蛋白用于與病毒RNA復合，和進一步包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞，該培養(yǎng)基中包含蛋白酶解活性，使得所述病毒的Fo蛋白被裂解。在我們的系統(tǒng)中，表達NP質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染可省略。NP可從全長cDNA表達，因為NP基因是在反基因組RNA的5'末端之后的第一個基因。由于真核mRNA通常是單順反的，因此遠端基因預期不表達。但是，可以產(chǎn)生全長cDNA，其中NDV基因的相對位置被改變。如果這種cDNA的第一個基因是P或L基因，則不需從共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達相應的基因產(chǎn)物。作為使用全長cDNA的一種替代，可使用兩或更多個亞基因組cDNA，其產(chǎn)生復制匹配亞基因組RNA，并且在一起表達禽副粘病毒蛋白質(zhì)的全互補序列。即使RNA被分別包裝，得到的類似病毒的顆?？赏ㄟ^共感染和基因功能的互補用于后續(xù)復制中。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述蛋白酶解活性衍生自一種酶如類似胰蛋白酶的酶，或衍生自包含所述蛋白酶解活性的組合物。在更優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基包含含蛋白酶解活性的尿囊液。Fo蛋白的裂解是產(chǎn)生感染性病毒所需的?？梢圆活~外添加外源蛋白酶解活性從輕型毒株產(chǎn)生感染性病毒，通過將轉(zhuǎn)染細胞的上清接種進含胚卵的尿囊腔，存在于尿囊液中的蛋白酶解活性能裂解Fo蛋白產(chǎn)生融合匹配的F1—F2復合物。具有這種活化的F蛋白的病毒粒子能感染易感細胞，在表達所需蛋白酶解活性的細胞中的復制產(chǎn)生感染性子代。作為向轉(zhuǎn)染細胞的上清提供所需的蛋白酶解活性的替代方法，例如可以使用相容NDV并己表達蛋白酶解活性的細胞。這種細胞系用于產(chǎn)生感染性輕型NDV，而不添加外源蛋白酶解活性。這種細胞系也可通過用產(chǎn)生所述活性的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系而產(chǎn)生。另外，可以產(chǎn)生表達病毒包膜中野生型F蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，由此提供能進入細胞的感染性顆粒(它們本身不具備編碼野生型F蛋白的基因組信息)。感染性輕型病毒的獲救也可通過用NDV輔助病毒感染轉(zhuǎn)染的細胞進行。這種輔助病毒的必須條件是其可通過抗例如中和抗體而選擇，這種中和抗體消除輔助病毒而不與輕型病毒反應。最后，可以構建表達一、二或全部三個必需NDV蛋白NP，P和L的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，這種細胞系僅需要共表達三個必需蛋白的亞集合，或者不需共表達即可支持產(chǎn)生感染性拷貝病毒。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中用于轉(zhuǎn)染的所述細胞衍生自雞原代或次代細胞或細胞系，例如CER或CEF細胞，其與大多數(shù)體外細胞一樣缺乏裂解NDV例如毒株LaSota的Fo蛋白所需的合適蛋白酶。但是，衍生自例如其他鳥類的細胞也可使用。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生感染性拷貝新城疫病毒的方法，包括用例如圖3所示的所述病毒的克隆的全長或基因組長度cDNA轉(zhuǎn)染細胞，在包含能裂解所述病毒的Fo蛋白的蛋白酶解活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，以及通過培養(yǎng)所述細胞并用衍生自所述培養(yǎng)的細胞的材料接種含胚卵的尿囊腔。所述材料例如包含(收獲或凍融的)細胞或細胞碎片，或從所述細胞培養(yǎng)物衍生的上清。例如，本文描述了回收感染性病毒的方法，其中將轉(zhuǎn)染的CEF單層的上清接種至含胚卵的尿囊腔，4天后收獲尿囊液，在血凝素分析中分析并在卵中進一步傳代。另外，本發(fā)明提供了一種方法，進一步包括通過收獲尿囊液并再接種含胚卵而傳代所述感染性拷貝新城疫病毒。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，提供了一種方法，其中所述病毒是輕型病毒，例如衍生自無毒野外NDV或NDV的疫苗株，如NDV的LaSota毒株。另夕卜，提供了通過基因修飾而修飾禽副粘病毒基因組的方法，所述基因修飾使得導入一或多個突變、缺失和/或插入或其他修飾。例如，提供了減毒或修飾禽副粘病毒毒力的方法，其是通過修飾例如編碼病毒蛋白如V蛋白的cDNA,并將所述修飾的cDNA克隆進全長cDNA并從所述全長cDNA產(chǎn)生感染性拷貝病毒，由此產(chǎn)生具有改善性質(zhì)的新NDV毒株或新減毒活疫苗。除了通過修飾基因產(chǎn)物減毒之外，也可以通過修飾參與轉(zhuǎn)錄和/或復制的核苷酸序列而減毒禽副粘病毒。這種修飾導致表達類似野生型的F蛋白的減毒株，該蛋白在各種細胞中在體外和體內(nèi)均可裂解，由此比經(jīng)典疫苗株更具免疫原性。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了減毒或修飾禽副粘病毒如新城疫病毒的毒力的方法，包括提供修飾編碼病毒蛋白的蛋白酶裂解位點的cDNA而修飾這種裂解位點，將所述cDNA克隆進例如新城疫病毒的基因組長度cDNA中并產(chǎn)生感染性拷貝新城疫病毒。所述裂解位點是例如新城疫病毒F或HN蛋白中的蛋白酶裂解位點。減毒通常限于毒力的降低，但是現(xiàn)在可以用相對減毒的NDV毒株并使這種毒株的子代的毒力增強，例如使其在特定細胞類型中復制的趨勢增加。因此現(xiàn)在可以賦予NDV獨特的毒力。本發(fā)明提供了抗原性修飾禽副粘病毒如新城疫病毒的方法，包括修飾編碼攜帶至少一個免疫顯性表位的病毒蛋白的至少一部分的cDNA，將所述cDNA克隆進新城疫病毒的基因組長度cDNA中，并產(chǎn)生感染性拷貝新城疫病毒。例如，本發(fā)明提供了(進一步)修飾NDV的方法，例如使用一種方法以產(chǎn)生已提供的NDV(疫苗)的感染性拷貝，提供了一種重組標記NDV疫苗的方法，含有最完全的可能的或所需的免疫學范圍的抗原性相關NDV表位的標記疫苗，并且仍能與野生型NDV由血清學區(qū)分，因為一獨特的血清學相關的表位或標記己由重組技術除去。本發(fā)明提供了修飾禽副粘病毒如NDV的抗原性組成的方法，由此使得產(chǎn)生能與禽副粘病毒野外毒株血清學區(qū)分的例如活NDV標記疫苗。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了感染性拷貝NDV，其中NDV的HN蛋白已通過將編碼一部分所述HN蛋白的cDNA與編碼衍生自禽副粘病毒如2型或4型的HN蛋白的一部分的cDNA重組而修飾。所述雜合HN蛋白作為由此獲得的感染性拷貝NDV毒株的血清學標記，或者可用于改變禽副粘病毒對其他細胞和/或組織的嗜性。本發(fā)明提供的這些所謂的標記毒株使得能產(chǎn)生疫苗，這些疫苗是評價世界上商用禽類中NDV流行的無價工具。另外，大規(guī)模應用這種標記疫苗將使得通過密集篩選和消滅感染禽類的方法完全消滅NDV。另外，提供了一種方法產(chǎn)生表達來自其他病原體的一或多種抗原的感染性拷貝NDV毒株，其可用于抗多種疾病的接種。這種感染性拷貝NDV病毒例如包括編碼得自如下病毒的異源蛋白的異源cDNA,所述病毒為禽流感病毒(AI)(血凝素(H5和H7)和神經(jīng)酰胺酶)，禽白血病病毒(ALV)(env蛋白(gp85))，雞貧血病毒(CAV)(VP1+VP2)，Marek氏病病毒(MDV)(糖蛋白B(gB)，gH)，傳染性喉氣管炎病毒(ILT)(gB，gH,gD)，傳染性囊病病毒(IBDV)(VP2和VP3)，火雞鼻氣管炎病毒(TRT)(融合(F)蛋白)，禽副粘病毒2、3、6(PMV)(F蛋白，血凝素神經(jīng)酰胺酶(HN))，或其他，傳染性支氣管炎病毒(IBV)(膜粒蛋白，核蛋白)，呼腸孤病毒(sigma蛋白)，腺病毒，肺炎病毒，腸炎沙門氏菌，空腸彎曲桿菌，大腸桿菌，鳥博德特氏菌(舊稱糞產(chǎn)堿菌)，副雞嗜血菌，多殺巴斯德氏菌，鼻腔鳥桿菌，鴨瘟立默氏菌(舊稱鴨瘟巴斯德氏菌)，枝原體(雞敗血枝原體，關節(jié)液枝原體，火雞枝原體，衣阿華枝原體)或曲霉(黃曲霉，煙曲霉)。本發(fā)明提供了能用作疫苗載體來表達來自其他家禽病原體的抗原的禽副粘病毒或其衍生的毒株。幾種性質(zhì)使得NDV成為一種理想的疫苗載體用于抗呼吸道或腸道疾病接種1)NDV可在含胚卵中容易地培養(yǎng)至非常高滴度，2)在含胚卵中NDV的大量培養(yǎng)相對廉價，3)NDV疫苗相對穩(wěn)定并可通過大量應用方法方便地給藥，例如通過引用水或噴灑或形成氣霧劑，4)NDV感染的天然途徑是經(jīng)呼吸道和/或腸道，其也是許多其他家禽病原體感染的主要天然途徑，5)即使存在循環(huán)母體抗體，NDV仍可誘導局部免疫性。已表明NDV具有強抗瘤形成性和免疫刺激性(綜述見Schirrmacher等，1998)(Schirrmacher，V"Ahlert,T"Steiner，H.-H"Herold-Mender,C.,Gerhards，R.和Hagmuller,E.(1998)用病毒修飾的腫瘤細胞免疫，腫瘤學研討會25:677—696)。雖然NDV似乎不能在正常人細胞中繁殖性復制，但注意到選擇性NDV介導的對人癌細胞的殺傷。在局部NDV治療后，在裸鼠中觀察到人腫瘤異種移植物的病毒性溶解和完全消除，這導致NDV用于腫瘤治療。但是，存在的問題是這種應用可能限于局部治療。NDV感染誘導干擾素、趨化因子和其他潛在重要的基因產(chǎn)物，并將多效免疫刺激性質(zhì)引入腫瘤細胞。這一概念已用于生產(chǎn)自體腫瘤細胞疫苗，其由已用NDV感染的新鮮采集的樣本組成，這一類型的疫苗稱為自體腫瘤疫苗一NDV或ATV—NDV(Schirrmacher等，1998)。NDV感染的細胞用y-照射滅活，其組織細胞分裂但仍允許NDV在感染的細胞的細胞質(zhì)中復制。用ATV—NDV接種患者后，通過NDV誘導的趨化因子募集T細胞，這些T細胞的一些可表達T細胞受體，該T細胞受體可與來自與細胞表面的主要組織相容性復合物I類分子復合的腫瘤相關抗原的肽相互作用。這一相互作用導致誘導胞毒性T細胞應答，由此特異性殺傷自體腫瘤細胞。本發(fā)明指出由NDV感染誘導的趨化因子和免疫刺激蛋白的全部組成成分和量是受調(diào)控的。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組NDV的方法，所述重組NDV已被修飾摻入和表達一種或多種異源基因。這種重組NDV可用于修飾感染細胞中免疫刺激蛋白的全部組成成分和量。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組NDV，其摻入并表達編碼人干擾素、趨化因子或其他免疫刺激蛋白的基因。所述重組NDV用于生產(chǎn)ATV—NDV，其比傳統(tǒng)ATV—NDV更強。例如，細胞因子IFN—a，IFN—P，TNF—a,IL—1，IL—6;趨化因子RANTES，IP—10;其他基因如HSP，ACTH,內(nèi)啡肽，iNOS,EPA/TIMP，NFKB。NDV的多效免疫刺激性質(zhì)也可用作佐劑接種動物和人抗感染性疾病。在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼一或多種感染因子的一或多種相關抗原的外源基因被導入NDV基因組，感染的細胞對抗原和免疫刺激蛋白的同時表達可誘導抗所述感染因子的強免疫應答。在本發(fā)明的另一個實施方案中，NDV免疫刺^^性質(zhì)可進一步通過用同時表達抗原和特異免疫刺激蛋白的NDV重組體而增強。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明通過使用表達單獨或與免疫刺激蛋白結合的人免疫缺陷病毒(HIV)的相關抗原的NDV重組體用于產(chǎn)生AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)疫苗。NDV也可用作佐劑接種動物和人抗感染性疾病。在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼一或多種感染因子的一或多種相關抗原的異種或外源基因被導入NDV基因組，感染的細胞對抗原和免疫刺激蛋白的同時表達可誘導抗所述感染因子的強免疫應答。在本發(fā)明的另一個實施方案中，NDV免疫刺激性質(zhì)可進一步通過用同時表達抗原和特異免疫刺激蛋白的NDV重組體而增強。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明通過使用表達單獨或與免疫刺激蛋白結合的人免疫缺陷病毒(HIV)的相關抗原的NDV重組體用于產(chǎn)生AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)疫苗。另外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生條件致死NDV缺失突變體的方法，所述突變體可用作自我限制的不能傳播的(載體)疫苗。產(chǎn)生了一種NDV缺失突變體，其不能表達參與NDV在內(nèi)層細胞膜上芽生的基質(zhì)(M)蛋白。本發(fā)明提供了例如一種表型互補的NDV毒株，其不能表達M蛋白，但仍能感染細胞并能通過細胞至細胞傳播而擴散。但是突變病毒在非互補細胞中不能產(chǎn)生感染性子代，這表明表型互補的NDV缺失突變體可用作安全的自我限制的疫苗，其不會傳播進環(huán)境中。這種不能傳播的疫苗組合了活疫苗的最重要的優(yōu)勢，即效率，和滅活疫苗的最重要優(yōu)勢，即安全性。本發(fā)明提供了新城疫病毒，或其衍生的毒株，例如通過在含胚卵或合適細胞中傳代或進一步培養(yǎng)所衍生的，即衍生自通過本發(fā)明方法獲得的感染性拷貝病毒。例如，提供了這樣的NDV，其以至少一種方式修飾而產(chǎn)生減毒的、毒力修飾的、抗原性修飾的、表達異源抗原或非傳播的或其組合的感染性拷貝新城疫病毒。本發(fā)明提供了NDV疫苗，其特征在于例如攜帶獨特的毒力特征或獨特的抗原性特征，其可以用于標記疫苗用途和/或表達來自其他病原體的異源抗原，其可以是可傳播的和/或不能傳播的形式。這種疫苗可以是滅活的疫苗或活疫苗，優(yōu)選地，這種疫苗是活疫苗，但是在活疫苗不適用或很少適用的情況，例如由于貿(mào)易限制或由疾病控制當局設定的其他條件下，有利的是本發(fā)明提供的滅活疫苗。本發(fā)明也提供了診斷方法，和相應的測試試劑盒，以檢測抗所述血清學相關免疫顯性表位或標記的抗體，該試劑盒提供了在家禽中進行控制和/或消滅NDV和/或其他家禽疾病的方法的方法和手段。本發(fā)明提供了新的有效的疫苗，其可以與野外病毒和現(xiàn)有疫苗經(jīng)血清學區(qū)分。這種稱為NDV標記疫苗的新疫苗提供了最完全免疫學范圍的抗原性相關NDV表位，并仍可通過應用所附診斷方法和試劑盒與野生型NDV血清學區(qū)分。本發(fā)明提供了一種將未接種動物或用本發(fā)明的NDV疫苗接種的動物與被野生型NDV感染的動物或用未修飾的中等毒力或輕型NDV疫苗株接種的動物區(qū)分開的方法，包括從所述動物取至少一種樣品(如血清、血、蛋或眼液體)，確定所述樣品中是否存在抗由所述野生型或未修飾的NDV表達的但不被本發(fā)明的疫苗表達的免疫顯性表位或標記的抗體。本發(fā)明提供了一種方法，其中所述抗體抗NDV的HN或F蛋白，例如在本說明書實驗部分所述的雜合蛋白。本發(fā)明提供了例如一種診斷方法，其中所述動物選自由家禽組成的一組，優(yōu)選雞。本發(fā)明還提供了用于血清學區(qū)分動物的方法中的診斷試劑盒。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用一種簡便的快速的血凝集抑制(HI)試驗以區(qū)分接種的動物和感染的動物。用標記疫苗接種的動物不誘導抗NDV的HN的抗體，因而不抑制NDV病毒粒對紅細胞的血凝集作用，該疫苗中NDV的HN的完整球狀頭部被另一種血清型的HN的相應部分替換。通過在ffl試驗中應用標記疫苗毒粒，檢測到抗雜合HN蛋白的抗體，并可用作檢測接種效果的措施?；蛘?，檢測抗NDV的F蛋白的抗體的ELISA用于檢測接種效果。除了HI試驗，可使用ELISA確定抗NDV的HN的抗體的存在，在這種試驗中使用的抗原例如是由重組DNA技術表達的NDV的HN或來自NDV的HN的保守肽。也可使用封閉ELISA，在這種情況下使用抗NDV的HN的保守表位的一或多種單克隆抗體確定在來自接種的動物的樣品中是否存在競爭抗體。如果標記疫苗僅含有嵌合HN蛋白或當NDV的HN的幾個表位被替換時使用ELISA試驗是有利的。本發(fā)明進一步在本說明書的實驗部分解釋，但其不限制本發(fā)明。實驗部分材料和方法除非另有說明，均根據(jù)Sambrook等(1989)進行標準克隆程序。所有涉及由聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)生的DNA片段的構建過程均由序列分析證實。在如下給出的引物序列中，下劃線的核苷酸相應于NDV序列，并示出在NDV基因組中的位置。用于克隆的限制位點的核苷酸序列用黑體字示出。細胞和病毒CER細胞(Smith等，1976)在含5%胎牛血清和2%抗生素混合物(含1000U/ml青霉素，1000ng/ml鏈霉素，20嗎/ml兩性霉素B，500pg/ml多粘霉素B和10mg/ml卡那霉素)的GMEM/EMEM(1:1)中培養(yǎng)。QT35細胞(Moscovici等，1977;Cho，1982)在補加5%FCS和2%抗生素混合物的由GibcoBRL/LifeTechnologies供應的培養(yǎng)基(目錄號041—91536;FortDodge的專利組合物)中培養(yǎng)。QM5細胞(AntinandOrdahl，1991)在補加10%磷酸t(yī)ryptose液體，10%FCS和2%抗生素混合物的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)。NDV毒株LaSota得自ATCC(ATCCVR—699)并在含胚卵中傳代兩次。在我們開始構建和克隆cDNA之前，病毒在原代雞胚胎成纖維細胞(CEF)上經(jīng)三輪噬斑純化而純化。為此，在含5%胎牛血清、2%抗生素混合物、5%尿囊液、30mMMgCb、200昭/mlDEAE-葡聚糖(Sigma)和0.8X瓊脂Nobel(Difco)的GMEM/EMEM(1:1)中培養(yǎng)的CEF細胞上滴定病毒。將來自第三輪噬斑純化的病毒(稱為克隆E13—l)在含胚卵中培養(yǎng)，接種四天后收集尿囊液并在一70'C等份儲存。表達T7RNA聚合酶的重組禽痘病毒fj)EFLT7po1(Britton等，1996;以下稱為FPV—T7)由MichaelSkinner惠贈，并在QT35細胞上培養(yǎng)。病毒RNA的分離所有操作均在無RNase玻璃容器或塑料容器中進行，所有溶液均用無RNase水配制，所述的水用1%二乙基焦碳酸酯(DEPC)處理并高壓滅菌。在BeckmanSW40轉(zhuǎn)子中于4。C、21000rpm離心70分鐘而從尿囊液沉淀病毒，沉淀重懸于均質(zhì)緩沖液(50mMTris-HClpH7.5，50mMNaCl，5mMEDTA,0.5%SDS)中并用蛋白酶K(200pg/ml)在37。C振蕩處理卯分鐘。裂解物用等體積苯酚/氯仿(l:1)pH5.4抽提兩次，用等體積氯仿抽提一次，加入0.1體積3MNaOAcpH5.3和2.5體積100%乙醇從水相沉淀病毒RNA。離心收集沉淀，用70%乙醇洗滌，重懸于水中，并等份儲存在一7(TC。反轉(zhuǎn)錄在12微升體積中將病毒RNA(1.5微克)與500納克引物混合，并在70'C保溫10分鐘，加入4微升5XRT緩沖液(250mMTris-HCl,pH8.3,375mMKC1,15mMMgCl2;GibcoBRL/LifeTechnologies),在42。C保溫混合物2分鐘。通過加入200單位反轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII;GibcoBRL/LifeTechnologies)并隨后在42"C保溫60分鐘而在終體積20微升中進行反轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(PCR)用于確定NDV基因組的3'和5'末端的所有PCR反應(參見下述)均用TaqDNA聚合酶(PerkinElmer)進行。為克隆具體的NDV基因或大的亞基因組cDNA，根據(jù)供應商(寶靈格曼海姆)的指導，使用校正DNA聚合酶Pwo或Taq和Pwo混合物(Expand高可靠性試劑盒或Expand長模板試劑盒)。所有樣品在開始指定次數(shù)PCR循環(huán)之前均在94'C保溫2分鐘。在指定次數(shù)PCR循環(huán)后，樣品在延伸溫度保溫該PCR循環(huán)的延伸時間的至少3倍長時間。用高純度PCR產(chǎn)品純化試劑盒(寶靈格曼海姆)直接純化PCR片段，或在瓊脂糖凝膠電泳后用QiaexII抽提試劑盒(Qiagen)基本上如供應商所述純化PCR片段。序列分析所有序列均用PRISM現(xiàn)成反應染料脫氧終止子循環(huán)測序試劑盒(PerkinElmer)確定。反應混合物(5微升)在一GeneAmp2400熱循環(huán)儀中進行25個線性擴增循環(huán)(94°C10秒，5(TC5秒，60°C4分鐘)，隨后用乙醇純化反應混合物，用70%乙醇洗一次，重懸于15微升TSR緩沖液(PerkinElmer)中，在上樣至AppliedBiosystemsAB310自動測序儀之前在94度加熱2分鐘。用于測序NDV毒株LaSota完整基因組的引物的核苷酸序列衍生自公布的序列或在此測序計劃中確定的序列。引物見表1所示。NDV毒株LaSota基因組的3'和5'末端的克隆和測序NDV基因組的3'和5'末端的核苷酸序列用RACE程序(cDNA末端的快速擴增)確定。在一使用衍生自NDV的L基因的公布序列(Yusoff等，1987)的引物p360(5'國GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3':nt14756-14779)的終體積20微升的反轉(zhuǎn)錄反應中應用NDVRNA。將單鏈cDNA(2.5微升RT混合物)加入8pmo1錨定引物ALG3(5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3')中，并根據(jù)Tessier等(1986)所述，在含50mMTris-HCl，pH8.0，10mMMgCl2,10嗎/mlBSA，25%PEQlmMHCC，20|iMATP和10單位T4RNA連接酶(NewEnglandBiolabs)的20微升反應混合物中于室溫連接過夜。用1微升連接反應作為PCR反應的模板，使用引物p375(5'-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3':nt14964-14983)和ALG4(5'-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3')，后一引物互補于錨定引物ALG3。PCR條件(40個循環(huán))如下94°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C2分鐘，PCR產(chǎn)物純化并克隆在T載體pBluescriptII-TSK(IchiharaandKurosawa,1993)中?；蛘撸兓腜CR產(chǎn)物用KlenowDNA聚合酶I處理產(chǎn)生平末端并克隆在質(zhì)粒pGEM4Z(Promega)的HincII位點。測序13個獨立的克隆(8個pBluescriptII-TSK和5個pGEM4Z)以確定NDV毒株LaSota基因組的5'末端的核苷酸序歹ij。3'末端的核苷酸序列由兩個獨立的方法確定，在方法I中，用T4RNA連接酶如Schutze等(1995)所述將引物ALG3連接至病毒RNA的3，末端，反應混合物(終體積10微升)含有2.5微克NDVRNA，100pmolALG3，1微升10XT4RNA連接酶緩沖液(500mMTris-HCl,pH7.8，100mMMgCl2,lOOmMDTT，10mMATP)，1微升DMSO，1微升lO^M己胺一氯化鈷，1微升RNasin(Promega)和10單位T4RNA連接酶(NewEnglandBiolabs)。混合物室溫保溫過夜，5微升連接反應用作一反轉(zhuǎn)錄反應的模板，使用ALG4作為引物。1微升RT反應用作一PCR反應的模板，使用引物ALG4和p376(5'-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3':nt137-164)，后一引物衍生自NDV的3'末端的公布序列(Ishida等，1986)，PCR條件如上述5'RACE的條件。在方法II中，病毒NDVRNA的3'和5'末端使用T4RNA連接酶，在上述方法I的相同條件下互相連接。5微升連接混合物用作一反轉(zhuǎn)錄反應的模板，使用引物p360。1微升RT反應用作一PCR反應的模板，使用引物p375和p376，PCR條件與5'RACE條件相同。PCR產(chǎn)物用KlenowDNA聚合酶I處理產(chǎn)生平末端并克隆在質(zhì)粒pGEM4Z(Promega)的HincII位點。IO個獨立的克隆(4個來自方法I，6個來自方法II)測序以確定NDV毒株LaSota基因組的3'末端的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄載體的構建用質(zhì)粒pOK12(VieiraandMessing,1991)作為基本復制子構建低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄載體。質(zhì)粒pOK12用PvuII消化，分離含有復制起點和卡那霉素抗性基因的DNA片段，這一片段與來自轉(zhuǎn)錄載體2.0(Dr.AndrewBall惠贈；Pattnaik等，1992)的Eco47III-Afl11片段(AflII位點用KlenowDNA聚合酶I平末端化)連接。從得到的質(zhì)粒缺失一Xbal-Nhel片段以消除盡可能多的單一限制位點，得到的質(zhì)粒稱為pOLTV5(圖1)。轉(zhuǎn)錄載體pOLTV5含有T7DNA依賴性RNA聚合酶啟動子，后接單一Stul和Smal限制位點，來自丁型肝炎病毒(HDV)的自催化核酶以及來自噬菌體T7的轉(zhuǎn)錄終止信號?？寺≡赟tul和Smal限制位點之間的DNA片段可用T7RNA聚合酶體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后，得到的轉(zhuǎn)錄物的5'末端含有質(zhì)粒編碼的兩個G殘基。由于HDV核酶的自催化作用，轉(zhuǎn)錄物的3'末端相應于克隆的DNA片段的確切末端核苷酸(Pattnaik等，1992)。小基因組質(zhì)粒的構建為檢查NDV復制和轉(zhuǎn)錄所需的要求，構建小基因組質(zhì)粒，其含有NDV3'和5'末端區(qū)，這兩個末端區(qū)位于置換全部NDV基因的報道基因的側翼(圖2)。相應于NDV3，和5'末端區(qū)的DNA片段用PwoDNA聚合酶經(jīng)PCR產(chǎn)生(30個循環(huán)，94""C15秒，50。C30秒，72°C30秒)，用含有3'和5'RACE片段的質(zhì)粒作為模板(見上述)。3'區(qū)用引物3UIT(5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'，ntl-27)和SEAP3(5'"rca4Z4CrGGrC4GC4rGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3'.nt102-119)產(chǎn)生，5，區(qū)(nt14973-15186)用引物SEAP5(5'-GC4rGCra4CC4G7^rC04rATTACAGTAACTGTGACT國3'，nt14973-14990)和5NDV(5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3'，nt15158-15186)產(chǎn)生。這兩個片段在一重疊PCR(重疊在上述引物序列中以斜體示出)中用引物3UIT和5NDV連接在一起。得到的DNA片段是由20個核苷酸隔開的NDV3'和5'末端的融合體，將該片段用T4多核苷酸激酶處理而磷酸化，并以兩個方向克隆在用StuI和SmaI裂解并用小牛腸磷酸酶(寶靈格曼海姆)去磷酸化的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5(圖1)中。最后，通過用Sphl和Clal消化從質(zhì)粒pSEAP-Basic(Clontech)中回收SEAP基因(編碼分泌的堿性磷酸酶)并克隆在NDV3'和5'末端之間的Sphl和Clal位點之間。得到的質(zhì)粒分別稱為pOLTV535和pOLTV553。用T7RNA聚合酶對質(zhì)粒pOLTV535進行體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反基因組RNA([+]-RNA)，而質(zhì)粒pOLTV553的轉(zhuǎn)錄得到基因組RNA([-]-RNA)。通過分別在位于pOLTV535和pOLTV553的SEAP基因和NDV5'末端之間的Clal位點插入自身互補寡核苷酸產(chǎn)生了質(zhì)粒pOLTV535N0-N5和pOLTV553N0-N5(圖2)。所用寡核苷酸為N0，5'-CGCGAGCTCG-3';Nl,5'誦CGCGAGSCTCG國3';N2,5'-CGCGAGCGCTCG國3';N3,5'國CGCGAGCWGCTCG-3';N4,5'誦CGCGAGCATGCTCG-3';N5,5'誦CGCGAGCASTGCTCG-3'(W=A或T;S-C或G)。質(zhì)粒pOLTV535和pOLTV553中T7啟動子的修飾為產(chǎn)生含NDV的真5'和3'末端的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄物，修飾質(zhì)粒pOLTV535和pOLTV553中T7啟動子，從而轉(zhuǎn)錄在NDV的3，或5'末端的第一個核苷酸開始。設計這樣的引物，其含有l(wèi))Bgll限制位點，2)T7啟動子序列(斜體示出)，其被修飾以使T7啟動子末端的兩個G殘基被一個A殘基置換，和3)NDV的3，(ntl-21)或5'末端(nt15164-15186)。用引物BGL3F2(5'國GATATGGCCATTCAGGCra^7^C04CrC4C7^rjACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3')和SEAP3(見上述)產(chǎn)生一DNA片段，其含有修飾的T7啟動子和直至pOLTV535中SEAP基因的起點的完整NDV3'末端。類似地，用引物BGL5F2(5'-GATATGGCCATTCAGGC7TA47]4Ca4CrC4Cr掘ACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3')和SEAP5產(chǎn)生含有修飾的T7啟動子和直至pOLTV553中SEAP基因的終點的完整NDV5'末端的DNA片段。得到的片段分別用Bgll和Sphl(3'末端)或Bgll和Clal(5'末端)消化，并用于置換pOLTV535中的Bgll-Sphl片段或pOLTV553中的Bgll-Clal片段，得到的質(zhì)粒分別稱為pOLTV735和pOLTV753。質(zhì)粒pOLTV735N3和pOLTV753N3是通過將一自身互補寡核苷酸(5'-CGCGAGCWGCTCG-3';W=A或T)分別插入位于pOLTV735和pOLTV753中SEAP基因和NDV5'末端之間的Clal位點中而獲得。SEAP報道基因質(zhì)粒的構建通過將來自質(zhì)粒pSEAP-Basic(Clontech)的含有SEAP基因的Xhol-Clal片段(用KlenowDNA聚合酶I將Clal位點平末端化)克隆在真核表達載體pCIneo(Promega)的Xhol和Smal位點之間而構建質(zhì)粒pCIneoSEAP，pCIneo除了噬菌體T7啟動子外還含有人巨細胞病毒(hCMV)啟動子。為了檢査和定量僅由T7啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物對SEAP的表達，構建另一個缺失hCMV啟動子的質(zhì)粒，為此通過用HindIII部分消化pCIneo并用BglII完全消化而從pCIneo中缺失hCMV啟動子。分離缺失了hCMV啟動子的DNA片段(根據(jù)Clontech的計數(shù)為nt756-5469)，用T4DNA聚合酶處理以產(chǎn)生平末端，用T4DNA連接酶再環(huán)化，得到的質(zhì)粒稱為pCIneoD。最后，從pSEAP-Basic以Mlul-Accl片段回收SEAP基因并克隆在pCIneoD的Mlul和Clal位點之間，得到的質(zhì)粒稱為pCIneoDSEAP。轉(zhuǎn)染細胞種于24孔培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)至60—80%鋪滿，并用FPV—T7以m.o丄為1在37t:感染1小時。用3微升LipofectAMINETM和OptiMem基本上根據(jù)供應商說明(GibcoBRL/LifeTechnologies)用0.5微克小基因組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞。在37X:保溫4小時(CER細胞)或16小時(QM5細胞)后，細胞用NDV(荷蘭強毒分離株152608號；200微升每孔)以m.o丄為5感染1小時或者不感染。吸出接種物并用1毫升完全培養(yǎng)基替換，進一步在37'C保溫細胞。為了共轉(zhuǎn)染，將細胞在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并如上所述用FPV—T7感染。使用8微升LipofectAMINETM或9微升FuGeneTM6(寶靈格曼海姆)，細胞用0.25微克小基因組質(zhì)粒DNA、0.4微克pCIneoNP、0.2微克pCIneoP和0.2微克pCIneoL(c)或pCIneo共轉(zhuǎn)染。為產(chǎn)生感染性病毒，小基因組質(zhì)粒用含有全長NDVcDNA的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒替換。SEAP活性的定量分泌進轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基中的SEAP量在一次性96孔板中測量，使用用于分泌的堿性磷酸酶的Phospha-LightTM化學發(fā)光報道分析試劑盒，基本上如供應商(Tropix)所述進行測量?；瘜W發(fā)光是用液閃計數(shù)器(Wallac1450microbetaPLUS)定量?？缭絅DV毒株LaSota的整個基因組的cDNA的克隆和測序為克隆和測序NDV毒株LaSota的完整基因組，通過RT—PCR產(chǎn)生大的亞基因組cDNA克隆并克隆在pGEM-T中。第一鏈cDNA合成通過用引物3UIT如上所述進行，1微升RT反應用于一PCR反應中，使用Expand長模板PCR試劑盒(寶靈格曼海姆)，PCR由5個循環(huán)的94。C10秒、58°C30秒和68°C6分鐘，10個循環(huán)的94'Cl0秒、58'C30秒和68。C6分鐘組成，其中68t延伸時間每個循環(huán)增加20秒。將PCR片段用pGEM-T克隆試劑盒基本上如供應商(Promega)所述克隆在pGEM-T中。連接混合物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌株SUREII(Stratagene)。進行兩個獨立的RT—PCR反應(A和B)，每個反應產(chǎn)生類似系列的cDNA克隆。亞基因組cDNA克隆的核苷酸序列用NDV特異性引物(表l)和側翼于插入片段的引物確定。將A和B系列克隆的核苷酸序列進行比較后，通過測序第三個獨立系列的cDNA(C系列)的相關區(qū)而解決剩余的分歧區(qū)。NDV毒株LaSota的核苷酸序列如圖3所示。NDV全長基因組cDNA克隆的構建用pOLTV535作為起始質(zhì)粒將全長NDVcDNA組裝在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5中。如圖4所示，用通用限制性內(nèi)切酶將DNA片段重疊連接在一起。在一系列克隆步驟中，構建含有由一Clal位點隔開的核苷酸1—3521和12355—15186的質(zhì)粒(稱為p535-DI)，該ClaI位點是通過將在位置3521和12355的Clal相結合而形成的。在另一系列克隆步驟中，構建含有包括核苷酸3521—12355(Clal片段)的部分NDV基因組的質(zhì)粒(稱為pGEM-B)。為促進克隆，后一ClaI片段附加有來自質(zhì)粒pACYC184(ChangandCohen，1978)的氯霉素抗性(Cm)基因，為此，用引物CAT—F(5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3')和CAT—R(5'國GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3')經(jīng)PCR而從pACYC184中回收Cm基因，PCR用Pwo聚合酶進行，由30個循環(huán)的94°C30秒、60tM5秒和72'C60秒組成。得到的PCR片段用BsiWI消化并克隆在pGEM-B的單一BsiWI位點，產(chǎn)生pGEM-B(CAT)。來自pGEM-B(CAT)的Clal片段克隆在p535-DI的單Clal位點，產(chǎn)生pNDFL(CAT)。最后，通過用BsiWI消化從這一質(zhì)粒除去Cm基因，再連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a。得到的質(zhì)粒稱為pNDFL+，含有克隆在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5中的T7啟動子和HDV核酶之間的完整NDVcDNA序列。各個NDV基因的克隆和表達含有每個NDVLaSota基因的DNA片段通過RT—PCR產(chǎn)生并克隆在pCIneo中?？寺『螅脗纫碛诓迦肫蔚囊锖突蛱禺愋砸餃y序所有片段。NP基因用引物386(5'國GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3':nt40-69)進行反轉(zhuǎn)錄，使用引物365(5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3':nt77-94)和892(5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC隱3':nt1577—1593)經(jīng)PwoDNA聚合酶進行PCR，使用下述PCR條件(30個循環(huán))95'C30秒、65°C40秒和72°C45秒。得到的DNA片段用EcoRI消化并克隆在pCIneo的EcoRI和Smal位點之間。NP的表達在如Peelers等(1992)的免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)中用單克隆抗體38(Russell等，1983)證實。P基因用引物pRTl(5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3';nt1794-1814)進行反轉(zhuǎn)錄，使用引物pRTl和p2(5'-GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3';nt3053—3071)經(jīng)PwoDNA聚合酶進行PCR，使用下述PCR條件(30個循環(huán))95'C30秒、65-C40秒和72'C60秒。得到的DNA片段用EcoRI和Xbal消化并克隆在pCIneo的EcoRI和Xbal位點之間。P的表達在IPMA中用單克隆抗體688(Russell等，1983)證實。M基因用引物3UIT(5'國ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3':nt1-27)進行反轉(zhuǎn)錄，使用引物NDV5M(5'-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGCCAA畫3':nt3268-3288)和NDV3M(5'-TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3':nt4368—4389)和Expand高可靠性試劑盒進行PCR，PCR為10個循環(huán)的95'C15秒、55'C30秒和68'C2分鐘，后接15個循環(huán)，其中68'C延伸時間每個循環(huán)增加20秒。得到的DNA片段用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平末端，用Nhel消化并克隆在pCIneo的Nhel和Smal位點之間。M蛋白的表達在IPMA中用單克隆抗體424(Russell等，1983)證實。F基因用引物3UIT(如上所述)進行反轉(zhuǎn)錄，使用引物NDV5F(5'畫ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG墨3':nt4508-4526)和NDV3F(5'國ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3':nt6212一31)和Expand高可靠性試劑盒在如上所述M基因的PCR條件下進行PCR。得到的DNA片段用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平末端，用Nhel消化并克隆在pCIneo的Nhel和Smal位點之間。F蛋白的表達在IPMA中用單克隆抗體8E12A8C3(ID—DLO,禽病毒學部)證實。HN基因用引物3UIT進行反轉(zhuǎn)錄，使用引物NDV5HN(5'-GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT國3':nt6335-6354)和NDV3HN(5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG匿3':nt8205—8227)和Expand高可靠性試劑盒在如上所述M基因的PCR條件下進行PCR。得到的DNA片段用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平末端，用Xmal消化并克隆在pCIneo的平末端的(KlenowDNA聚合酶)Nhel和Xmal位點之間。HN蛋白的表達在IPMA中用單克隆抗體86(Russell等，1983)證實。L基因L基因從cDNA克隆pGEM-L7a(圖4A)用SacII和Sail消化而回收。在用Sail消化之前，用T4DNA聚合酶處理使SacII位點平末端化，得到的片段克隆在pCIneo的平末端化的(KlenowDNA聚合酶)Nhel位點和Sail位點之間。T7啟動子和L基因的ATG起始密碼子之間的5'非翻譯區(qū)含有2個不同框ATG密碼子，其干擾L蛋白的正確表達。因此，構建一新質(zhì)粒，其中第一個ATG缺失，第二個ATG通過如下PCR誘變改變?yōu)锳AG。用質(zhì)粒pGEM-L7a(圖4)作為模板在一PCR中使用引物5LE(E)(5'畫CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAATAATACGGG-3':nt8332-8374)和3LE(B)(5'國GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGAATGC-3':nt8847-8870)，PCR用PwoDNA聚合酶進行，其由30個循環(huán)的94'C30秒、60°C45秒和72°C60秒組成。得到的DNA片段用EcoRI和Xbal消化，克隆在pCIneo的EcoRI禾nXbal位點之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pCIneoL(N)。隨后，將來自pGEM-L7a的含有L基因其余部分(nt8852-15046)的BsiWI-Sall片段克隆進pCIneoL(N)的BsiWI和Sail位點之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pCIneoL(c)。由于沒有抗L蛋白的抗體，L的表達不能用免疫化學檢查。在F基因作引入遺傳標記為毫無疑問地顯示感染性病毒可從克隆的全長cDNA產(chǎn)生，通過PCR誘變將一遺傳標記引入F基因。為此，用兩個重疊PCR片段克隆F基因，第一個PCR片段用引物NDV5F(見上述)和引物F5R(5'-AAAGCGCCGCTGTCTCCTCCCTCCAGATGTAGTCAC-3':nt4859-4894)產(chǎn)生，黑體殘基是導入到引物中的變化以使Fl和F2之間的蛋白酶解位點的氨基酸序列由NDVLaSota毒株的序列(GGRQGrIl)改變?yōu)閺姸綨DV毒株的保守裂解位點的序列(GRRQRrIf)。第二個pcr片段用引物F3F(5'-Ga4Ga4a4C4GCGGCGCr7TATAGGCGCCATTATTGG-3，:nt4875—4911)和IV09(5'-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAAC丁TTCAC-3':nt6246-6266)產(chǎn)生，這一PCR用PwoDNA聚合酶進行，由25個循環(huán)的94°C15秒、55°C30秒和72°C2分鐘組成。用引物NDV5F和IV09和相同PCR條件將兩個重疊PCR片段(重疊在引物序列中以斜體示出)在第二個PCR中連接在一起。得到的片段含有F基因的完整ORF并編碼毒力保守裂解位點，用Nhel和Sail消化該片段并克隆在pCIneo的Nhel和Sail位點之間，得到pCIneoF,來自pCIneoF^的Stul-Notl片段(nt4646-4952)用于置換質(zhì)粒p535-S中的相應片段，質(zhì)粒p535-S通過將來自pGEM-B的Clal-Scal(nt3521-10311)插入p535-DI的Clal和Seal位點之間而構建(見圖4C)。得到的質(zhì)粒稱為p535-S[F^c]。將含有來自pACYC184(見上述)的Cm抗性基因的PCR片段作為Xbal片段克隆進質(zhì)粒p535-S[F"Vl的單Xbal位點(NDV序列的第6172位)，得到質(zhì)粒p535-S[F^c]Cm。隨后，這一質(zhì)粒的Cm標記的ApaI-SpeI片段(nt2285-8094)用于置換全長cDNA克隆pNDFL+的相應片段。最后，通過用Xbal消化并用T4DNA連接酶再環(huán)化從這一質(zhì)粒除去Cm基因。得到的質(zhì)粒含有遺傳標記的全長NDVcDNA，被稱為pNDFL+[F，。產(chǎn)生表達各個NDV基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞系和Pacl消化、T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平末端并再環(huán)化而從pCIneo107除去。得到的質(zhì)粒稱為pCIneo007。T7RNA聚合酶的表達通過用pCIneo007和pPRh01共轉(zhuǎn)染細胞而證實，后一質(zhì)粒含有克隆在T7啟動子之后的含有內(nèi)部核糖體進入位點的經(jīng)典豬瘟病毒的E2蛋白質(zhì)(RenevanGennip，個人通訊)。E2的表達在一IPMA中用單克隆抗體V4(Wensvoort等，1986)測定。如上所述產(chǎn)生并分離表達T7RNA聚合酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的CER細胞系，不同之處是使用10cm培養(yǎng)皿，且細胞用5微克pCIneo007DNA和25微升LipofectAmine轉(zhuǎn)染。為檢查表達T7RNA聚合酶的個體細胞系，用質(zhì)粒pPRh01轉(zhuǎn)染這些細胞系并在一IPMA中用單克隆抗體V4檢查E2的表達(其依賴于T7RNA聚合酶)。鑒定了表達T7RNA聚合酶的幾個細胞系，其中一個細胞系，稱為CER—C9，用于以下實驗。HN基因和雜合HN基因的克隆和表達如上所述用引物3UIT合成NDV和禽副粘病毒血清型2和4(APMV2和APMV4)的單鏈cDNA，所有后續(xù)的PCR反應均為25個循環(huán)的94-C15秒、55"30秒和72'C2分鐘。APMV2的HN基因的完整編碼區(qū)用引物IV03(5'-GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3')和IV05(5'-GATCCCCGGGI￡TTAAACCAGGCTTCGCAATG-3')經(jīng)PCR回收，所述引物衍生自APMV2的HN基因序列(GenBank登錄號D14030)。APMV4的HN基因的完整編碼區(qū)用引物IV06(5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3')和訓8(5'畫ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCA質(zhì)粒pCIneoNP,pCIneoP,pCIneoM，pCIneoF，pCIneoF"和pCIneoHN用于產(chǎn)生分別表達這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞系。在轉(zhuǎn)染前一天，將CER細胞種于6cm培養(yǎng)皿中，并保溫過夜以達到60一80%鋪滿。用12微升LipofectAmine和OptiMem基本上如供應商所述(GibcoBRL/LifeTechnologies)用2微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞。48小時后胰酶化細胞并將在含500微克/毫升G418(寶靈格曼海姆)的培養(yǎng)基中的稀釋液種于10cm培養(yǎng)皿中。每3天用含增加(100微克/毫升逐步增加)量的G418的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，直至達到800微克/毫升G418。細胞保持在含800微克/毫升G418的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染后3周，挑取各個集落并轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)皿中。用如上所述瞬時表達研究的IPMA檢査克隆的細胞系對各個NDV基因的表達。組成型表達NP，P，M或F的細胞系可鑒別并分離，但是我們不能產(chǎn)生表達HN蛋白的細胞系，也許HN的組成型表達對細胞是有毒性的。產(chǎn)生表達T7RNA聚合酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞系通過用EcoRI和Sail消化從質(zhì)粒pRT7NT(RenevanGennip,ID-DLO，哺乳動物病毒學部)回收編碼T7RNA聚合酶的基因。得到的片段含有位于桿狀病毒p10啟動子后面的T7RNA聚合酶基因。將該DNA片段克隆在質(zhì)粒pCIneo0的EcoRI和Sail位點之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pCIneo107。質(zhì)粒pCIneo0不含T7啟動子并通過用Nhel裂解、隨后用Seal部分裂解、用KlenowDNA聚合酶填充粘末端并用T4DNA連接酶再環(huán)化而衍生自pCIneo。桿狀病毒序列通過用EcoRIGGATCTCAG-3')經(jīng)PCR回收，所述引物衍生自APMV4的HN基因序列(GenBank登錄號D14031)。得到的PCR片段用EcoRI和Xmal消化(直接消化或在亞克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRI和Xmal位點之間，得到的質(zhì)粒分別稱為pCIneoHN2和pCIneoHN4。NDV毒株LaSota的HN基因和APMV2和APMV4的HN基因之間的雜合體用如下重疊PCR構建。NDV毒株LaSota的HN基因的N—末端部分(氨基酸1—141)用引物IV01B(5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3';nt6325-6354)和IV10(5'國A4ra4G7TCmUCC7M7TCCCCC畫3';nt6811—6834)。APMV2的HN基因的C一末端部分(氨基酸142—580)用引物IV11B(5'隱GGGGGG掘GGC^4G^4CrC47TCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3')和IV05經(jīng)PwoDNA聚合酶擴增。在一重疊PCR中(重疊以斜體示出)用引物IV01B和IV05以及Expand高可靠性酶混合物將得到的片段連接在一起。得到的PCR片段用EcoRI和Xmal消化(直接消化或在亞克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRI和Xmal位點之間。得到的質(zhì)粒含有雜合HN基因，由NDV的氨基酸1一141和APMV2的氨基酸142—580組成，該質(zhì)粒稱為pCIneoHN1/2141。APMV4的HN基因的C一末端部分(氨基酸143—569)用引物IV14B(5'-GGGGGa4面GC4X4GA4CrC47TGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3')和IV08擴增。在一重疊PCR中用引物IV01B和IV08將這一片段與NDV的HN基因的N—末端部分(見上述)連接在一起。得到的PCR片段用EcoRI和Xmal消化(直接消化或在亞克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRI和XmaI位點之間。得到的質(zhì)粒含有雜合HN基因，由NDV的氨基酸1—141和APMV4的氨基酸143—569組成，該質(zhì)粒稱為pCIneoHN1/4141。與上述構建過程類似，構建雜合HN基因，其由NDV的氨基酸1一143和APMV2的氨基酸144—580組成，或由NDV的氨基酸1一143和APMV4的氨基酸145—569組成。對于這些構建過程，用下述引物對獲得PCR片段NDV氨基酸1—143，引物IV01B和IV13(5'"7CT4CX4ra4G7TC77TGCCT4rC-3';nt6816-6840);APMV2氨基酸144—580,引物IV14B(5'-GGGGG04L4GGC4^40^4CrC47TG薦^7X3ATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3')和IV05;APMV4氨基酸145—569，引物IV15B(5'-GGGGG047^GGC4^4G^CrCMTTGT^G^TlCAAACAGCTGACTACACAGCAG^)和訓8。得到的PCR片段用EcoRI和Xmal消化(直接消化或在亞克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRI和Xmal位點之間。得到的質(zhì)粒分別稱為pCIneoHN1/2143和pCIneoHN1/4143。為檢查HN蛋白的表達，CER細胞或QM5細胞用FPV—T7以m.o丄為1感染1小時，用質(zhì)粒pCIneoHN，pCIneoHN2，pCIneoHN4，pCIneoHN1/2141，pCIneoHN1/2143，pCIneoHN1/4141和pCIneoHN1/4143轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后24小時，細胞單層上覆蓋在PBS中的1X雞紅血細胞懸液，置于室溫45分鐘。隨后，用PBS小心洗細胞單層，顯微鏡檢查紅血細胞與轉(zhuǎn)染細胞的粘附。為檢査HN和F蛋白共表達后的細胞融合的誘導，CER細胞或QM5細胞用pCIneoF^與下述質(zhì)粒之一共轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒為pCIneo-HNl,pCIneoHN2，pCIneoHN4，pCIneoHN1/2141，pCIneoHNl/4"，pCIneoHNl/2"3或pCIneoHN1/4143。保溫2—3天后，用PBS洗細胞單層，用Giemsa溶液(在水中1:30稀釋)染色15分鐘，顯微鏡檢査。雜合HN基因克隆在全長基因組NDVcDNA中用寡核苷酸HN12a(5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3')和HN12b(5'-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3')將一稱為HN12的合成接頭插入pGEM-T(Promega)的Notl和Spel位點之間。用寡核苷酸HN14a(5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3')和HN14b(5'-CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3')將一稱為HN14的合成接頭插入pGEM-T的Notl和Spel位點之間。得到的質(zhì)粒分別稱為pGEM-HN12和pGEM-HN14，這兩個質(zhì)粒用Notl和Xbal消化并用于克隆來自質(zhì)粒p535-S[F^c]Cm的Notl-Spel片段(nt3390-7488)。得到的質(zhì)粒分別稱為pGEM-HNl/2NS和pGEM-HNl/4NS，這兩個質(zhì)粒的HN基因分別被來自質(zhì)粒pCIneoHN1/2143和pCIneoHN1/4143(見"HN基因和雜合HN基因的克隆和表達"一段)的雜合HN基因置換。為此，用Nhel和Smal消化pCIneoHNl/2"s和pCIneoHN1/4143，得到的片段(含有雜合HN1/2143和雜合HNl/4"s基因)克隆在質(zhì)粒pGEM-HNl/2NS和pGEM-HNl/4NS的Nhel和Hpal位點，分別得到pGEM+HN12和pGEM+HN14。后兩個質(zhì)粒用于將雜合HN基因?qū)隢DV的全長基因組cDNA克隆。為此，用Notl和Spel消化質(zhì)粒pGEM+HN12禾QpGEM+HN14，用含有HN12或HN14基因的片段置換pNDFL+中的相應片段，分別得到pNDFL+HNl/2143Cm和pNDFL+HNl/4143Cm。通過用Xbal消化隨后用T4DNA連接酶再環(huán)化從這些質(zhì)粒中除去Cm基因。為符合"六核苷酸規(guī)則"(ruleofsix)，用自身互補的寡核苷酸將一合成接頭插入這些質(zhì)粒的單Spel位點中，接頭H2(5'-CTAGCGAGCGCTCG-3')插入質(zhì)粒pNDFL+HNl/2"3中，接頭H3(5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3')插入質(zhì)粒pNDFL+HN1/4143中，分別得到質(zhì)粒pNDFL+HNl/2"3(H2)和pNDFL+HNl/4143(H3)。消除NDVLaSota的HN蛋白中的一特異性表位由單克隆抗體4D6(Long等，1986;Meulemans等，1986)識別的NDVLaSota的HN蛋白中的一特異性表位即氨基酸346—354(PDEQDYQIR)通過用APMV—2的HN蛋白的相應序列(NRTDIQQTI)或APMV—4的HN蛋白的相應序列(PDPLQDQIL)置換這一序列而被消除。為此，質(zhì)粒pCIneoHN(見"各個NDV基因的克隆和表達"一段)用作模板產(chǎn)生重疊PCR片段。對于APMV—2序列，用引物IVOl(5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT畫3')和引物3HN2(5'-GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3')產(chǎn)生第一個PCR片段，用引物5HN2(5'-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3')和NDV3—HN(5'畫CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3')產(chǎn)生第二個PCR片段。合并得到的片段并用作第三個PCR的模板，所用引物為引物IV01B(5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3')和引物NDV3—HN。對于APMV—4序列，用引物IV01和引物3HN4(5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3')產(chǎn)生第一個PCR片段，用引物5HN4(5'-CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3')和NDV3—HN產(chǎn)生第二個PCR片段。合并得到的片段并用作第三個PCR的模板，所用引物為IV01B和NDV3—HN。引物3HN2/5HN2和3HN4/5HN4部分互補并分別含有編碼HN2序列(NRTDIQQTI)禾QHN4序歹!j(PDPLQDQIL)的遺傳密碼。PCR反應用Expand長模板PCR試劑盒(寶靈格曼海姆)進行，PCR條件為30個循環(huán)的94°C10秒、58°C30秒和68°C2分鐘，然后1個循環(huán)的68°C4分鐘。用EcoNI和Bsu361消化PCR片段，并克隆在pCIneoHN的EcoM和Bsu36I位點之間。得到的質(zhì)粒分別稱為pCIneoHNl(HN2e)和pCIneoHNl(HN4e)。瞬時表達研究表明修飾的HN蛋白被正確表達并轉(zhuǎn)運到細胞表面，正如用雞紅血細胞進行的血細胞吸附研究判斷的。另外，針對NDV的HN的一線性表位并由氨基酸346—354組成(或至少包括氨基酸346_354)的單克隆抗體6D4不與修飾的HN蛋白反應。用Narl和Spel消化質(zhì)粒pCIneoHNl(HN2e)和pCIneoHNl(HN4e)，含有修飾的HN基因的片段分別克隆在pGEM-HNl/2NS和pGEM-HNl/4NS的Narl和Spel位點之間。得到的質(zhì)粒稱為pGEM-HNl(HN2e)和pGEM-HNl(HN4e)，用Notl和Spel消化，用于置換pNDFL+中的Notl-Spel片段。得到的質(zhì)粒分別稱為pNDFL-HN(HN2e)Cm和pNDFL-HN(HN4e)Cm。通過用Xbal消化并再連接去除Cm基因。得到的質(zhì)粒分別稱為pNDFL-HN(HN2e)和pNDFL-HN(HN4e)。結果NDV毒株LaSota基因組的3'和5'末端的核苷酸序列NDV基因組的潛在的3'末端序列已公開(Ishida等，1986)，但公開的是另一種NDV毒株(D26)而不是本發(fā)明所用毒株(LaSota)。Yusoff等(1987)公開了NDV毒株BeaudetteC.的L基因和L基因之后相對較大的非編碼區(qū)的序列。但是如本文所示，這一序列不包括病毒基因組的全部5'末端，因而不能產(chǎn)生感染性拷貝NDV。負鏈RNA病毒基因組的3'和5'末端在復制和轉(zhuǎn)錄中起重要作用(LambandKolakofsky，1996)，因此，為了產(chǎn)生能用于通過反向遺傳學(Conzelmann，1996)產(chǎn)生感染性病毒的全長NDVcDNA，必需包括病毒基因組的正確3'和5'末端。因此，我們用3'和5'RACE程序(cDNA末端的快速擴增)確定了NDV毒株LaSota的基因組RNA的3'和5'末端的精確核苷酸序列。在將一單鏈錨定引物(ALG3)與通過基因組RNA的5'末端的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈cDNA連接后經(jīng)PCR回收5'末端。用與錨定引物互補的引物(ALG4)和NDV特異性引物，產(chǎn)生含有5'末端的PCR產(chǎn)物。為了克隆NDV的3'末端，用T4RNA連接酶將單鏈錨定引物ALG3與病毒RNA的3'末端連接，并用引物ALG4和NDV特異性引物經(jīng)PCR擴增(方法I)。或者，用T4RNA連接酶將NDVRNA的3，和5，末端相互連接，得到的多聯(lián)RNA用于RT—PCR，使用側翼于連接點的NDV特異性引物(方法11)。將3'和5'RACE產(chǎn)物克隆在T載體pBluescriptl1—TSK(IchiharaandKurosawa,1993)或pGEM4Z中，分離并測序幾個獨立的克隆，結果見表2。為了直接對比3，和5，末端，以DNA的形式顯示序列并且基因組鏈的3'末端以反基因組鏈的5'末端表示。在基因組RNA水平，3'末端序列為3'-UGGUUUGUCUCUUAG，而5'末端序列為UUUAGAAACAAACCA—5'。3'末端序列幾乎與公布的NDV毒株D26的3'末端序列(Ishida等，1986)相似，但是5'末端序列顯示NDV毒株LaSota含有與公布的NDV毒株BeaudetteC的L基因的序列(Yusoff等，1987)相比額外的64個核苷酸。(圖6)輔助病毒對NDV小基因組的復制為確定NDV的3'和5'末端是否在復制和轉(zhuǎn)錄中起作用，構建小基因組，其由NDV的3'末端(nt1-119)、編碼分泌的堿性磷酸酶(SEAP)的報道基因以及NDV的5'末端(nt14973-15186)組成(圖2)。這些小基因組以雙向克隆在轉(zhuǎn)錄載體pOLTV5中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pOLTV535和pOLTV553(構建細節(jié)見材料和方法)。質(zhì)粒pOLTV5(圖1)含有T7RNA聚合酶啟動子，后接單Stul和Smal限制位點，來自丁型肝炎病毒(HDV)的自催化核酶以及來自噬菌體T7的轉(zhuǎn)錄終止信號(Pattnaik等，1992)。用T7RNA聚合酶進行質(zhì)粒pOLTV535的體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反基因組RNA(或稱[+]-RNA)，而質(zhì)粒pOLTV553的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生基因組RNA(或稱[-]-RNA)(圖5)。為檢查由質(zhì)粒pOLTV535和pOLTV553產(chǎn)生的小基因組RNA是否可用NDV作為輔助病毒而復制和表達，我們使用CER細胞，其組成型表達T7RNA聚合酶(CER-C9細胞，見材料和方法)，或用表達T7RNA聚合酶的禽痘病毒重組體f^)EFLT7po1(Britton等，1995;以下稱為FPV—T7)感染后表達T7RNA聚合酶。用小基因組質(zhì)粒pOLTV535或pOLTV553轉(zhuǎn)染CER—C9細胞和FPV—T7感染的CER細胞，在37'C培養(yǎng)3小時后，細胞用NDV感染1小時或不感染。轉(zhuǎn)染后約24小時，從培養(yǎng)基取樣并分析SEAP活性。結果顯示在FPV—T7感染的細胞中SEAP表達非常高。這不令人驚奇，因為T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反基因組[+]-RNA，其被禽痘病毒酶加帽，并被宿主細胞有效地翻譯。在用pOLTV553轉(zhuǎn)染的細胞中，T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生基因組[-]-RNA，其必須被輔助病毒轉(zhuǎn)化成[+]-RNA以翻譯成SEAP蛋白(參見圖5)。在兩種情況下，與未感染的細胞相比NDV感染的細胞中未觀察到SEAP表達的增加。相反，NDV感染的細胞中SEAP表達始終比未感染的細胞中SEAP表達低約2倍(結果未示出)。對于pOLTV535轉(zhuǎn)染的細胞，這可通過由T7RNA聚合酶產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的非常高的SEAP表達水平來解釋。但是在pOLTV553轉(zhuǎn)染的細胞中，該細胞中的SEAP有效表達依賴于由病毒聚合酶復合物將基因組[-]-RNA轉(zhuǎn)變成反基因組[+]-RNA或mRNA，我們原來預期在NDV感染后SEAP表達應增加。關于小基因組不能被NDV表達和復制的原因，我們認為有兩種，首先，小基因組RNA的大小不符合所謂的"六核苷酸規(guī)則"(CalainandRoux，1993;Kolakofsky等，1998)，根據(jù)這一規(guī)則，副粘病毒基因組僅當它們的長度是6個核苷酸的倍數(shù)時才能有效復制。其次，在小基因組RNA的5'末端存在的兩個額外G殘基可能干擾由病毒聚合酶復合物進行的正確復制和/或轉(zhuǎn)錄。為確定基因組的復制是否依賴于六核苷酸規(guī)則，我們將一系列大小依次增加1個核苷酸的短自身互補寡核苷酸插入質(zhì)粒pOLTV535和pOLTV553的單Clal位點(圖2)，得到的質(zhì)粒(pOLTV535N0-N5和pOLTV553N0-N5)的大小差異為1—6個核苷酸，因此它們中的一個應產(chǎn)生符合六核苷酸規(guī)則的小基因組RNA。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染如上所述的CER細胞或FPV—T7感染的CER—C9細胞，結果顯示僅質(zhì)粒pOLTV535N3和pOLTV553N3在NDV感染后產(chǎn)生增強的SEAP活性，由T7RNA聚合酶從這些質(zhì)粒產(chǎn)生的小基因組RNA的長度計算為6n+2。由于在小基因組RNA的5'末端存在兩個額外G殘基，這些結果提示僅僅位于小基因組RNA的真3'和5'末端之間的RNA序列的大小相關于六核苷酸規(guī)則。這一點通過構建如下小基因組質(zhì)粒而證實，該質(zhì)粒中T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起點被改變從而摻入RNA的第一個核苷酸為NDV的3，或5'末端的第一個核苷酸(見材料和方法)。這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染示出僅有由質(zhì)粒pOLTV735N3和pOLTV753N3產(chǎn)生的小基因組RNA被輔助病毒復制(結果未示出)。這些發(fā)現(xiàn)再一次指示NDV的復制嚴格依賴于六核苷酸規(guī)則，另外，這些發(fā)現(xiàn)還指示小基因組RNA的5'末端存在兩個額外G殘基不干擾正確復制。用來自其他副粘病毒的小基因組質(zhì)粒(或DI質(zhì)粒)獲得類似的結果(Pattnaik等，1992;HartyandPalese,1995)。輔助病毒對NDV小基因組的包裝為確定小基因組RNA能否被NDV輔助病毒包裝，將轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新鮮的細胞單層，吸附1小時后，用PBS洗單層3次，并在完全培養(yǎng)基中進一步保溫。保溫24小時后，測定培養(yǎng)基中的SEAP活性。結果顯示僅在用來自小基因組質(zhì)粒pOLTV553N3轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)基處理的細胞中存在SEAP活性(表4)。這一發(fā)現(xiàn)指示小基因組RNA可被包裝進NDV包膜中，并且這些顆粒能感染細胞。另外，這些結果顯示包裝依賴于輔助，指示僅有與病毒NP、P和L蛋白復合的RNA分子被包裝成病毒樣顆粒。由表達NP、P和L蛋白的質(zhì)粒對NDV小基因組的復制為確定小基因組RNA是否也能被編碼必需的NP、P和L蛋白的質(zhì)粒復制，我們在用FPV—T7感染的細胞中進行了共轉(zhuǎn)染實驗。細胞用由小基因組質(zhì)粒和質(zhì)粒pCIneoNP，pCIneoP或pCIneoL(c)組成的質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染細胞，作為陰性對照，編碼必需的L蛋白的pCIneoL(c)被載體質(zhì)粒pCIneo替換。結果(表5)示出編碼NP，P和L的質(zhì)粒確實能復制小基因組RNA，結果還顯示與由輔助病毒對小基因組的復制類似，由NP、P和L蛋白進行的復制也依賴于六核苷酸規(guī)則。NDV毒株LaSota的完整基因組核苷酸序列通過RT—PCR構建跨越完整NDV基因組的亞基因組cDNA片段(圖4)。為使PCR錯誤率最低，使用校正酶混合物(ExpandLongTemplate;寶靈格曼海姆)和有限的PCR循環(huán)次數(shù)(15個循環(huán))?；パa于NDVRNA的3'末端的引物3UIT用于反轉(zhuǎn)錄，基因特異性引物用于PCR。為鑒定可能的PCR錯誤，進行3個獨立的RT反應，并用于產(chǎn)生3個獨立系列的亞基因組cDNA，將大小約為4一7kb的cDNA克隆在pGEM-T中。用從公布的NDV序列推導的引物或從在這一測序計劃中推導的NDV序列衍生的引物(表1)確定兩個序系列的cDNA的核苷酸序列，剩余的歧義通過測序第三個系列的cDNA克隆的相關區(qū)域而解決。NDV毒株LaSota的基因組由15186個核苷酸組成(圖3)，其是目前完整序列已確定的所有副粘病毒基因組中最小的(Kolakofsky等，1998)。在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5中構建全長NDVcDNA克隆為構建NDV毒株LaSota的全長cDNA克隆，根據(jù)圖4所示策略，在共享的限制位點連接跨越完整NDV基因組的重疊cDNA克隆。在衍生自轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5的小基因組質(zhì)粒pOLTV535(見上述)中組裝完整NDVcDNA。如圖4B所示，完整NDVcDNA的組裝的最后一步是將來自pGEM-B的約8.8kbClal(nt3521-12355)片段克隆進含有側翼于Clal位點任一側的NDV序列(即分別為nt1-3521和12355-15186)的p535-DI中。這一步被證明是非常困難的，因為我們產(chǎn)生正確克隆的嘗試多次失敗。因此，將pGEM-B的Clal片段用來自質(zhì)粒pACYC184的氯霉素抗性(Cm)基因標記。分離攜帶Cm基因的Clal片段并克隆在p535-DI的Clal位點中，用抗氯霉素和卡那霉素抗性選擇轉(zhuǎn)化子。由于轉(zhuǎn)化子生長較差，將抗生素選擇降至15微克/毫升Cm和10微克/毫升Km，培養(yǎng)溫度由37。C降至32°C。最后，用BsiWI消化隨后用T4DNA連接酶再環(huán)化而從這一質(zhì)粒去除Cm基因。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過篩選卡那霉素抗性而氯霉素敏感性而經(jīng)表型鑒定攜帶所需質(zhì)粒的細胞。得到的質(zhì)粒稱為pNDFL+，其由克隆在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5的Smal和Stul位點之間的全長NDVcDNA組成。從全長cDNA產(chǎn)生感染性NDV為產(chǎn)生完全來自克隆的cDNA的感染性NDV，在一共轉(zhuǎn)染實驗中，如以上針對小基因組質(zhì)粒所述一樣將質(zhì)粒pNDFL+和質(zhì)粒pCIneoNP,pCIneoP或pCIneoL(c)—起應用。用小基因組質(zhì)粒pOLTV553N3并測量SEAP表達監(jiān)測CER和CEF細胞的轉(zhuǎn)染。作為陰性對照，用pCIneo代替pCIneoL(c)。共轉(zhuǎn)染后，細胞在含5%尿囊液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3—6天，加入尿囊液是必需的，因為CER或CEF細胞缺少裂解NDV毒株LaSota的F蛋白所需的合適蛋白酶。F蛋白的裂解對于細胞至細胞傳播和感染性病毒的產(chǎn)生是絕對必需的。培養(yǎng)3天后，我們用抗F蛋白的單克隆抗體進行了固定的單層細胞的免疫學染色。結果顯示被抗體染色的細胞僅存在于用pNDFL(+)，pCIneoNP，pCIneoP和pCIneoL(c)共轉(zhuǎn)染的細胞單層中，這些結果表明在這些細胞中發(fā)生了基因組復制和表達。當在共轉(zhuǎn)染實驗中用pCIneo代替pCIneoL(c)時沒有觀察到染色的細胞。為回收感染性病毒，將轉(zhuǎn)染的CEF單層的上清注射進含胚卵的尿囊腔中，4天后收集尿囊液，在血細胞凝集分析中分析，并在卵中進一步傳代。結果表明僅用pNDFL+禾tlpCIneoNP，pCIneoP和pCIneoL(c)的組合轉(zhuǎn)染的細胞的上清在血細胞凝集分析中呈陽性反應。顯示陽性血細胞凝集反應的尿囊液隨后在一血凝抑制分析中用單克隆抗體7B7，8C11，5A1，7D4和4D6(Long等，1986)進行分析，這些單克隆抗體可用于區(qū)分NDV各毒株。這一分析的結果表明從接種的卵中回收的NDV毒株顯示與原始LaSota毒株相同的反應性。從接種的卵中回收的病毒被稱為NDFL，以將其與原始LaSota毒株區(qū)分。從全長cDNA產(chǎn)生基因修飾的NDV為毫無疑問地顯示共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可用于從考慮的全長NDVcDNA回收感染性病毒，將一遺傳標記導入質(zhì)粒pNDFL(+)。為此，通過PCR誘變(詳見材料和方法)將Fo蛋白中的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列從LaSota毒株的序列(GGRQGrJl)改變?yōu)閺姸綨DV毒株的共有序列(GRRQRrIf)。得到的質(zhì)粒pNDFL+[F^]使用上述共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生病毒。從已用共轉(zhuǎn)染的CEF細胞的培養(yǎng)基接種的含胚卵的尿囊液中回收稱為NDFL[F,的感染性病毒。在ffl試驗中，特異于LaSota毒株的所有單克隆抗體包括7D4均顯示與新產(chǎn)生的病毒的反應性相同于與原始LaSota毒株的反應性。通過RT—PCR確定編碼F蛋白的蛋白酶裂解位點的區(qū)域的核苷酸序列，結果顯示該核苷酸序列含有精確的在用于修飾原始LaSota序列的誘變引物中導入的核苷酸變化。這一發(fā)現(xiàn)表明病毒衍生自質(zhì)粒pNDFL+[F，且證實(基因修飾的)NDV可完全從克隆的全長NDVcDNA產(chǎn)生。NDV的Fo蛋白的蛋白酶裂解位點是毒力的關鍵決定簇通常認為Fo蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列是不同NDV毒株的毒力的關鍵決定簇，產(chǎn)生這樣的基因修飾的LaSota毒株，其中蛋白酶裂解位點的氨基酸序列從輕型(無毒)NDV毒株的序列變?yōu)閺姸綨DV毒株的序列，提供了測試這一觀點的獨特機會。因此，我們測定了新產(chǎn)生的病毒NDFL[F，的腦內(nèi)致病性指數(shù)(ICPI)，并將其與NDFL毒株和原始LaSota毒株(克隆E13—1)的ICPI進行比較。結果顯示毒株NDFL[F^的ICPI是1.3，其比毒株NDFL(ICPI=0.0)和克隆E13—1(ICPI=0.3)的值高得多，這些結果表明如所預期的，NDV的毒力很大程度上由Fo蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列決定。血清學標記的導入NDV的包膜糖蛋白F和HN是該病毒最重要的免疫原性蛋白。在感染后，F(xiàn)和HN蛋白均激發(fā)強中和抗體應答。誘導這種中和抗體應答是用無毒NDV毒株(如廣泛使用的LaSota毒株)成功接種的基礎。但是抗NDV疫苗株的抗體應答不能與抗強毒NDV野外毒株的抗體應答相區(qū)別，因此，強毒野外病毒的感染不能用血清學方法追蹤。這一情形是不希望的，因為野外病毒感染被接種所掩蓋，由野外毒株導致的臨床跡象可被忽視或者甚至被歸因于疫苗。由于成功區(qū)分接種和感染對于消滅NDV是很重要的，所以我們立志開發(fā)基因修飾的NDV毒株，這種毒株可用于接種并可與NDV野外毒株進行血清學區(qū)分(所謂的標記疫苗)。為了開發(fā)NDV標記疫苗，對病毒進行基因修飾，從而(主要)抗原之一的一或幾個免疫顯性表位被缺失或修飾。缺失一個重要蛋白的一個或幾個部分可導致該蛋白生物學功能的喪失，因此，我們所選擇的修飾NDV的一個免疫顯性包膜蛋白的方式是保持該蛋白的生物學功能，而抗該修飾的蛋白的全部抗體組分不同于抗原始蛋白的全部抗體組分?？紤]到如下所述的原因，我們選擇本發(fā)明的一個實施方案是修飾NDV的HN蛋白。NDV的感染通過毒粒包膜與宿主細胞的質(zhì)膜的融合而起始，這一過程需要F蛋白和HN蛋白。己示出F和HN蛋白物理相互作用，這一相互作用是膜融合所需的(Deng等，1995)。另外，已表明這一相互作用是類型特異性的，即F和HN蛋白必須衍生自同一病毒才能顯示融合活性。NDV的HN蛋白的相互作用結構域已被定位于該蛋白的所謂的柄或莖區(qū)，其包含HN蛋白的胞外域的前92個氨基酸殘基(Deng等，1995)。由NDV的氨基酸1—141和人副流感病毒3型(hPIV3)的氨基酸141—572組成的雜合HN蛋白已顯示當與NDVF蛋白共表達時保留融合活性。這些發(fā)現(xiàn)提示攜帶由NDV的莖區(qū)和后接的不同禽副粘病毒血清型的HN蛋白的球狀頭部組成的雜合HN蛋白的基因修飾的NDV毒株可以是活的。另外，這種毒株可激發(fā)與NDV所激發(fā)的不同的抗HN抗體應答。由于抗F蛋白的中和抗體應答就足以產(chǎn)生抗攻擊病毒感染的有效保護，因此這種基因修飾的NDV毒株滿足標記疫苗的兩個必需條件，即抗病保護及血清學區(qū)分性。構建這樣的雜合HN基因，其由NDV的氨基酸1一141和禽副粘病毒血清型2(APMV2)的氨基酸142—580的融合體組成(稱為HN1/2141)，或由NDV的氨基酸1一143和APMV2的氨基酸144—580的融合體組成(稱為HN1/2143)。類似地，構建這樣的雜合HN基因，其由NDV的氨基酸1—141和APMV4的氨基酸143—569的融合體組成(稱為HN1/4141)，或由NDV的氨基酸1一143和APMV4的氨基酸145—569的融合體組成(稱為HNl/4"3)。這些雜合基因克隆在真核表達載體pCIneo中，并與攜帶NDVF蛋白的質(zhì)粒用于共轉(zhuǎn)染實驗。為此，修飾F蛋白從而F2和F1之間的蛋白酶解位點的氨基酸序列從LaSota序列變?yōu)閺姸綨DV毒株的共有序列(F,見材料和方法)。在CER細胞和QM5細胞中的共轉(zhuǎn)染實驗表明HNl/2^和HNl/2^及HNl/4'"和HN1/4143當與F^蛋白共表達時均誘導細胞融合。這些結果表明，雜合HN蛋白和F蛋白的復合物是生物學活性的。用雜合HN蛋白HNl/2"s和HN1/V"代替全長cDNA克隆pNDFL+中的原始HN基因，產(chǎn)生pNDFL-HNl/2"s和pNDFL-HN1/4143，這兩個質(zhì)粒隨后用于經(jīng)上述共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生感染性病毒?？蓮囊延棉D(zhuǎn)染的單層細胞的上清接種的含胚卵的尿囊液中分離活重組病毒(稱為NDFL-HN1/2143和NDFL-HN1/4143)。在兩種重組體的每種中均存在雜合HN基因通過RT—PCR證實。血凝抑制試驗顯示抗NDV的單克隆抗體和多價抗血清不能抑制重組病毒NDFL-HN1/2143和NDFL-HN1/4143對雞紅血細胞的凝集。這些結果表明毒株NDFL-HN1/2143和NDFL-HN1/4143可用作能與傳統(tǒng)NDV疫苗血清學區(qū)分的疫苗。從重組NDV表達異源蛋白為檢査外源基因能否被插入NDV基因組，我們構建了攜帶SEAP報道基因的重組病毒，SEAP基因衍生自質(zhì)粒pOLTV535并被修飾以包括典型的NDV轉(zhuǎn)錄終止和起始盒。將含有后接轉(zhuǎn)錄終止和起始盒的SEAP基因的DNA片段插入質(zhì)粒pNDFL+[F，的Xmnl位點(nt109)，通過共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生感染性病毒，稱為NDFL—AP，經(jīng)RT—PCR證實SEAP基因的存在。用毒株NDFL—AP感染的細胞表達非常高水平的SEAP蛋白。用SEAP蛋白的比活性，我們計算出SEAP蛋白占在用NDFL—AP感染的細胞中表達的蛋白的x。％。這些結果顯示異源基因可從重組NDV以非常高的水平表達。在反式互補細胞系中產(chǎn)生NDV缺失突變體為了廢除NDV的M蛋白的表達，通過用BsaAI(nt3087)消化pNDFL+[F,，隨后用HindIII(nt4252)部分消化而缺失M基因的一大部分。用KlenowDNA聚合酶填充HindIII末端后，用T4DNA連接酶重新環(huán)化該片段，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。得到的質(zhì)粒稱為pNDFL+[F^]dM，用該質(zhì)粒經(jīng)共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在表達NDVM蛋白的反式互補CER—M細胞中產(chǎn)生病毒。轉(zhuǎn)染的單層的上清在CER—M細胞上傳代3次，分析病毒的存在。第三次傳代的培養(yǎng)物上清在血細胞凝集(HA)和血凝抑制(HI)試驗中呈陽性結果說明獲得了病毒，該病毒被稱為NDFL—dM。當用NDFL—dM感染CEF細胞的單層時，病毒仍能經(jīng)細胞至細胞傳播而擴散，如在IPMA中用抗F蛋白的單克隆抗體所示。如所預期的，M蛋白的表達不能在IPMA中用抗M蛋白的單克隆抗體而證實。當用上清感染CEF細胞或CER—M細胞時，通過IPMA我們不能顯示在這些單層中存在復制病毒。這一發(fā)現(xiàn)表明在非互補CEF細胞中不能產(chǎn)生感染性病毒，這一發(fā)現(xiàn)由在HA或HI試驗中觀察到用來自感染的CEF細胞的上清接種含胚卵不產(chǎn)生子代病毒而證實。對更好的NDV疫苗特別是NDV標記疫苗的需求促使我們開發(fā)反向基因系統(tǒng)，其可對NDV進行基因修飾。在本說明書中我們描述了完全從克隆的全長cDNA產(chǎn)生感染性NDV的方法，我們證明NDV的毒力可通過僅僅修飾決定F蛋白的蛋白酶裂解位點的特異性的3個核苷酸而大大改變。在這種情況下，蛋白酶裂解位點從LaSota毒株的裂解位點改變?yōu)閺姸綨DV毒株的共有裂解位點。通過產(chǎn)生這種基因修飾的NDV毒株，我們進行了正式的證實，即F蛋白的可裂解性是NDV毒力的關鍵決定簇(但不是唯一的決定簇)。通過使用相同的反向遺傳學途徑，可依照需要將裂解位點修飾成任何氨基酸序列，這可導致產(chǎn)生一系列展示各種毒力水平的NDV毒株。他如上所述，已表明除了F和HN蛋白的可裂解性之外，其他的病毒因子也可與致病性相關。轉(zhuǎn)錄和翻譯的改變可調(diào)控病毒的生長和細胞至細胞的傳播和/或致細胞病變作用。NDV的感染性cDNA的可得性使得可系統(tǒng)修飾參與轉(zhuǎn)錄和復制的序列，這可導致設計具有最佳免疫原性并完全無毒的新NDV疫苗。安全性是活疫苗的最重要的性質(zhì)之一，但是對于許多活疫苗包括NDV，免疫原性通常與毒力反相關。因此，進一步減毒活疫苗而不喪失免疫原性是最希望的變化之一，對此可使用基因修飾。在這一方面，值得提到的是已表明消除仙臺病毒V蛋白的表達導致對小鼠的體內(nèi)致病性的顯著降低(Kato等，1997)。與仙臺病毒類似，NDV也通過RNA編輯的機制產(chǎn)生V蛋白(Steward等，1993)，因此可預期消除NDV的V蛋白的表達也可產(chǎn)生體內(nèi)減毒表型。除了改變NDV的毒力外，我們示出可如此修飾NDV的抗原組成，從而可產(chǎn)生與NDV野外毒株血清學區(qū)分的毒株。這些所謂的標記疫苗是評價全世界商業(yè)禽類中NDV流行的無價工具。另外，大規(guī)模應用這種標記疫苗并通過加強篩選和除去感染的禽類最終可完全消除NDV。在本說明書中我們示出外源基因可在感染的細胞中以非常高的水平表達，這表明NDV可被用作疫苗載體來表達來自其它(家禽)病原體的抗原。有若干性質(zhì)使得NDV成為抗呼吸道或腸道疾病的接種的理想疫苗載體1)NDV可在含胚卵中容易地培養(yǎng)至非常高的滴度；2)在含胚卵中大量培養(yǎng)NDV相對廉價；3)NDV疫苗相對穩(wěn)定并可通過大量應用方法如添加至飲用水或噴灑或氣霧劑形成而簡便地給藥；4)NDV感染的天然途徑是呼吸道和/或腸道，這也是許多其他家禽病原體感染的主要天然途徑；5)盡管存在循環(huán)的母體抗體，NDV仍能誘導局部免疫性。最后，我們示出活NDV缺失突變體可用反式互補細胞系產(chǎn)生。產(chǎn)生了一種不能表達參與NDV在內(nèi)層細胞膜芽生的基質(zhì)(M)蛋白的NDV缺失突變體。我們示出了一種表型互補的NDV毒株，其不能表達M蛋白，但仍能感染細胞并能通過細胞至細胞傳播而擴散。但是突變病毒在非互補細胞中不能產(chǎn)生感染性子代，這一發(fā)現(xiàn)表明表型互補的NDV缺失突變體可用作安全的自我限制的疫苗，其不會傳播進環(huán)境中。這種不能傳播的疫苗組合了活疫苗的最重要的優(yōu)勢，即效率，和滅活疫苗的最重要優(yōu)勢，即安全性。附圖簡述圖1:轉(zhuǎn)錄載體pOLTV5是Pattnaik等(1992)所述的轉(zhuǎn)錄載體的衍生物，構建過程詳見說明書。該質(zhì)粒含有T7DNA依賴性RNA聚合酶啟動子(黑體顯示)，后接單Stul和Smal限制位點和來自丁型肝炎病毒(HDV)的自催化核酶。DNA片段可克隆在Stul和Smal位點之間并可用T7RNA聚合酶體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。得到的轉(zhuǎn)錄物的5'末端含有不是插入片段編碼的2個額外G殘基。由于核酶的作用，轉(zhuǎn)錄物的3'末端精確地相應于插入片段的最后一個核苷酸。圖2:小基因組質(zhì)粒pOLTV535(圖2A)和pOLTV553(圖2B)的結構。所述小基因組質(zhì)?；谵D(zhuǎn)錄質(zhì)粒pOLTV5(見圖1)并含有側翼于編碼分泌性堿性磷酸酶(SEAP)的基因的NDV毒株LaSota的3，區(qū)(nt1-119)和5，區(qū)(nt14970-15186)。T7RNA聚合酶對pOLTV535的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生基因組RNA(或稱[-]-RNA)。示出了作為病毒轉(zhuǎn)錄起始和終止信號的起始(S)和終止(E)盒。SEAP基因的起始密碼子下劃線。還示出了產(chǎn)生每個長度為1個核苷酸之差的小基因組質(zhì)粒(pOLTV535NO-N5和pOLTV553NO-N5)的插入Clal位點的插入片段(N0—N5)的序列。圖3:NDV毒株LaSota的基因組的核苷酸序列和NDV基因的推導的氨基酸序列。所示序列對應于反基因組鏈并以ssDNA形式由5'至3'方向示出。本圖中所示序列是由完全測序兩個獨立系列的跨越完整NDV基因組的重疊的亞基因組cDNA而確定的共有序列。剩余的歧義(可能由PCR錯誤所致)由測序第三個獨立系列的克隆的相關區(qū)解決。由重疊的亞基因組cDNA克隆組裝的全長cDNA克隆pNDFL+的序列與共有NDV序列在如下位置不同(括號中為共有序列)nt1755，G(A);nt3766,A(G);nt5109，G(A);nt6999,T(C);nt7056，G(A);nt9337,G(A);nt9486,A(T);nt10195，T(C);nt13075，A(G)。這些差異導致3個氨基酸的改變(括號中為共有序列)F蛋白，R189(Q);HN蛋白，S200(P)，L蛋白，N369(1)。圖4:(A)用于從亞基因組重疊cDNA克隆組裝全長NDVcDNA的整體策略。cDNA組裝在已含有NDV毒株LaSota的3'和5'末端的質(zhì)粒pOLTV535(見圖2)中。得到的質(zhì)粒稱為pNDFL+,用于產(chǎn)生感染性NDV。(B)從亞基因組重疊cDNA克隆組裝全長NDVcDNA的詳細克隆程序。Cm代表氯霉素抗性基因，其被臨時導入作為表型標記(詳見說明書)。(C)產(chǎn)生基因修飾的全長NDVcDNA的詳細克隆程序。修飾由導入F基因的3個核苷酸變化組成，其導致F蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列的修飾(詳見說明書)。圖5:(A)pOLTV535系列用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反基因組RNA(或稱[+]-RNA)，其可直接由細胞翻譯成SEAP蛋白。用輔助病毒感染細胞后(或與編碼NP、P和L蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后)，病毒聚合酶復合物用反基因組RNA合成基因組RNA(或稱[-]-RNA)，病毒聚合酶復合物隨后用基因組RNA合成mRNA(用特異性轉(zhuǎn)錄起始[S]和終止[E]盒)和反基因組RNA。(B)pOLTV553系列用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生基因組RNA(或稱[-]-RNA)，其不能翻譯成SEAP蛋白。用輔助病毒感染細胞后(或與編碼NP、P禾口L蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后)，病毒聚合酶復合物用基因組RNA合成mRNA(用特異性轉(zhuǎn)錄起始[S]和終止[E]盒)和反基因組RNA。圖6:給出NDVLaSota和其他副粘病毒的5'末端核酸系列的對比，NDV與Rubulavirus屬的4個成員，副粘病毒屬3個成員以及麻疹病毒屬3個成員進行序列對比。序列以從L基因終止盒至5'(3'-5'cDNA)示出。NDV，新城疫病毒；hPIV2，人副流感病毒2;MuV，腮腺炎病毒；SV5和SV41，猴病毒5和41;SeV，仙臺病毒；bPIV3和hPIV3，牛和人副流感病毒；CDV，犬瘟熱病毒；MeV，麻疹病毒；RPV，牛瘟病毒。完整基因組的核苷酸(nt)序列如下獲得(登錄號)NDV(細77761);hPIV2(X57559);MuV(AB000388);SV5(AF052755);SV41(X64275);bPIV3(D84095);hHV3(Z11575);CDV(L13194);MeV(X16565);RPV(Z30697)。參考文獻Alexander,DJ(1993).副粘病毒感染，見《鳥類的病毒感染》，McFerran,J.B.andMcNulty，M.S.(eds),pp321-340，Elsevier科學出版公司，阿姆斯特丹。Antin，P.BandOrdahl,C.P.(1991).分離和鑒定禽生肌細胞系，Dev.143:111-121.Baron，M.D.andBarrett,T.(1997).從克隆的cDNA獲得牛瘟病毒，病毒學雜志71:1265-1271.Beach,J.R.(1944).用新城疫免疫血清體外中和禽肺炎腦炎病毒，科學100:361-362.Beard,C.W.andHanson,R.R(1984).新城疫，見M.S.Hofstadetal.(eds)《家禽疾病》，第8版,pp.452-470.衣阿華州立大學出版社，美國。Beaudette，F(xiàn).R.,Bivins，J.A.andMiller,B.R.(1949).用活病毒免疫新城疫，Cor"e〃39:302-334.Boursnell,M.E.G.,Green,P.R,Samson,A.C.R.，Campbell,J丄A.,Deuter,A.，Peters,R.W"Millar,N.S.，Emmerson，P.T.andBi皿s，M.M.(1990).表達新城疫病毒(NDV)的血凝素一神經(jīng)酰胺酶基因的重組禽痘病毒保護雞抗NDV攻擊，病毒學178:297-300.Britton，R,Green,P.Kottier，S.，Mawditt,K丄.，Penzes,Z.，Cavanagh，D.andSkinner,M.(1996).重組禽痘病毒在禽和哺乳動物細胞中對噬菌體T7RNA聚合酶的表達，普通病毒學雜志77:963-967.Calain,P.andRoux，L.(1993).六核苷酸規(guī)則，仙臺病毒缺陷型干擾RNA的有效復制的基本特征，病毒學雜志67:4822-4830.Chambers,P.，Millar,N.S.，Bingham,R.W.andEmmerson,P.T.(1986).新城疫病毒互補DNA的分子克隆以及編碼血凝素一神經(jīng)酰胺酶和大蛋白的基因之間交界的核苷酸序列分析，普通病毒學雜志67:475-486.Chang，A.C.Y.andCohen,S.N.(1978).衍生自P15A隱蔽性小質(zhì)粒的可擴增多拷貝DNA克隆載體的構建和鑒定，JBacfen'o/.134:1141-1156.Cho,B.R.(1982).在醇成纖維細胞系中網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒的細胞病變效應和灶形成，禽類疾病27:261.Collins,RL.，Hil，M.G，Camargo，E.，Grosfeld,H.，Chanock，R.M.andMurphy,B.R.(1995).從克隆的cDNA產(chǎn)生感染性人呼吸合胞病毒證實來自M2mRNA的5'最近端開放讀框的轉(zhuǎn)錄延長因子在基因表達中的重要作用并提供了開發(fā)疫苗的可能性，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:11563-11567.Conzelmann,K.-K.(1996).非節(jié)段負鏈RNA病毒的基因操作，普通病毒學雜志77:381-389.Cowen，B.S.andBraune,M.O.(1988).禽病毒在日本鶇來源的連續(xù)細胞系(QT35)中的繁殖，禽類疾病32:282-297.Deng,R.，Wang,Z.,Mirza，A.M.andIorio,R.M.(1995),同源融合蛋白刺突對副粘病毒附著蛋白的促進細胞融合所需的結構域的定位，病毒學209:457-496.Doyle,T.M.(1927),由濾過性病毒所致的目前未記錄的疾病，J.Comp.Pathol.Ther.40:144-169.Garcin,D.，Pelet,T.,Calain,P.,Roux,L，Curran，J.andKolakofsky，D.(1995).從cDNA回收感染性仙臺副粘病毒的高度重組性系統(tǒng)產(chǎn)生新拷貝非缺陷型干擾病毒，14:6087-6094.Garten,W.，Berk，W.,nagai，Y.，Rott，R.andKlenk，H.-D.(1980).新城疫病毒糖蛋白F的蛋白酶易感性的突變對致病性的作用，普通病毒學雜志50:135-147.Goldhaft，T.M.(1980).新城疫病毒LaSota毒株來源的歷史，禽類疾病24:297-301.Gough，R.E.andAlexander,D丄(1973).在用活NDV的Bl毒株經(jīng)不同途徑接種的雞中誘導的對攻擊的抗性的速度，及仏92:563-564.Hanson,R.P.(1988).新城疫病毒毒株間的異源性存活的關鍵，見D丄Alexander編輯，《新城疫》，pp.113-130.Kluwer學術出版社，波士頓。Harty,R.N,andPalese,R(1995).仙臺病毒模型RNA的非編碼末端序列中的突變:對報道基因表達的影響，病毒學雜志69:5128-5131.Heckert,R.A.，Riva，J.，Cook，S.，McMillen，J.andSchwartz,R.D.(1996).用表達新城疫病毒融合和血凝素一神經(jīng)酰胺酶抗原的火雞重組皰疹病毒疫苗接種后在雞中引發(fā)保護性免疫，禽類疾病40:770-777.Heuschele，W.P.andEasterday,B.C.(1970).在用新城疫病毒感染后的雞的氣管中的局部免疫性及病毒的存在，II.免疫熒光和組織病理學研究。J121:497-504.Hitchner，S.B.andJohnson,E.P.(1948).用于免疫禽類抗新城疫(禽肺炎腦炎)的低毒力病毒，版MW.43:525-530.Hoffinan，M.A.andBanerjee,A.K.(1997).人副流感病毒3型的感染性克隆，病毒學雜志71:4272-4277.Hofstad，M.S.(1953).用福爾馬林滅活的疫苗免疫雞抗新城疫，爿附.J14:586-589.Ichihara,Y.，andKurosawa,Y.(1993).構建新的T載體用于PCR產(chǎn)物的直接克隆，基因130:153-154.Ishida，N.，Taira，H.，Omata,T"Mizumoto，K.，Hattori，S.，Iwasaki，K.andKawakita，M.(1986).新城疫病毒基因組RNA的3'末端的2617個核苷酸的序列以及病毒NP蛋白的預計的氨基酸序列，Nucl.AcidsRes.14:6551-6564.Kaleta，E.RandBaldauf，C.(1988).獨立生存的和寵物鳥中的新城疫，見D丄Alexander(ed.),《新城疫》，pp.197-246.Kluwer學術出版社，波士頓。Kant，A.，Koch，G.，vanRoozelaar,D丄,balk,F.andterHuurne，A.(1997).在24小時內(nèi)經(jīng)聚合酶鏈反應區(qū)分新城疫病毒的強毒株和無毒株，禽類病理學26:837-849.Kolakofsky,D.,Pelet，T"Garcin,D.，Hausmann,S.，Curran，J.AndRoux,L.(1998).副粘病毒RNA合成及對六聚體基因組長度的需求再論六核苷酸規(guī)則，病毒學雜志72:891-899.Kraneveld，F(xiàn).C.(1926).在荷屬東印地的家禽疾病，/mfoc/z5/.38:448-450.Lamb，R.A.andLolakofsky，D.(1996).副粘病毒病毒及其復制，見《基礎病毒學》，(Fieldsetal.，eds),第20章，p577-604，Lipincott-Raven出版社,費城。Lawson,N.D.,Stillman，E.A.，Whitt,M.A.andRose,J.K.(1995).來自DNA的重組水泡性口炎病毒，5W.USA92:4477—4481,Long,L，Portetelle,D，Ghysdael,J.，Gonze，M.，Burny，A.andMeulemans,G.(1986).抗新城疫病毒血凝素一神經(jīng)酰胺酶和融合糖蛋白的單克隆抗體糖基化和反應性之間的關系，病毒學雜志57:1198-1202.Madansky，C.H.andBratt，M.A.(19"78).新城疫病毒的非細胞致病性突變體，病毒學雜志26:724-729.Madansky，C.H.andBratt,N.A.(1981a).新城疫病毒的非細胞致病性突變體是病毒特異性RNA合成缺陷的，病毒學雜志37:317-327.Madansky，C.H.andBratt，N.A.(1981b).由新城疫病毒的非細胞致病性突變體揭示的病毒傳播、細胞病變作用和獨立之間的關系，病毒學雜志40:691-702.Meulemans，G.，Gonze,M.,Carlier,M.C.，Petit,P"Burny,A.andLong,L.(1986).HN和F糖蛋白特異性單克隆抗體對實驗性新城疫的保護作用，禽類病理15:761-768.Millar,N.S.，Chambers,P,andEmmerson，P.T.(1998).新城疫病毒毒株Ulster的融合和血凝素一神經(jīng)酰胺酶基因的核苷酸序列毒株間致病性差異的分子基礎，普通病毒學雜志69:613-620.Morgan,R.W"GelbJr.,J.，Schreurs，C.S.，Limicken，D.，Rosenberger,J.K.andSondermeijer,P.(1992).用表達新城疫病毒融合蛋白的重組火雞皰疹病毒疫苗保護雞抗新城疫和Marek氏病，禽類疾病36:858-870.Morgan,R.W"GelbJr"J.,Pope,C.R.andSondermeijer,P.(1993).含有新城疫病毒融合基因的火雞皰疹病毒重組疫苗在雞中的效果引發(fā)保護和母體抗體作用Moscovici，C.，Moscovici,M.G，Jimenez,H.，Lai，M.M.,Haymann，M丄andVogt，P.K.(1977).衍生自日本鶉的化學誘導腫瘤的連續(xù)組織培養(yǎng)細胞系，細胞11:95-103.Pattnaik,A.K.,Ball,L.A.，LeGrone，A.W.andWertz，GW.(1992).來自cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物的VSV感染性缺陷型干tfc顆粒，細胞69:1011-1020.Peeples，M.E.(1988).新城疫病毒復制，見D丄Alexander(ed.)，《新城疫》，pp.45-78.Kluwer學術出版社，波士頓。Peeters,B.，N.deWind,M.Hooisma，F(xiàn).Wagenaar，A.Gielkens，andR.Moormann.(1992).假狂犬病病毒包膜糖蛋白gp50和gll對于病毒穿透是必需的，但僅gll參與膜融合，病毒學雜志66:894-卯5.Radecke，F(xiàn).，Spielhofer,P"Schneider,H,，Kaelin，K.,Huber，M.，D6tsch，C.，Christiansen,G,andBilleter,M.A.(1995).從顆粒的DNA獲得麻疹病毒，14:5773-5784.Rott，R.andKlenk,H.-D.(1988).新城疫病毒的感染性和致病性的分子基礎，見D丄Alexander(ed,)，《新城疫》,pp.98-112.Kluwer學術出版社，波士頓。Russell，P.H.,Griffiths.P.C.，Goswami，K.K.A.，Alexander,D丄，Cannon,M丄andRussell,W.C.(1983).抗新城疫病毒的單克隆抗體的鑒定，普通病毒學雜志64:2069-2072.Sambrook，J.,Fritsch，E.R，andManiatis,T.(1989).分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約。Schneider,H.,Sppielhofer,P"Kaelin，K.,D6tsch,C.，Radecke,F.,Sutter,G.andBilleter,M.A.(1997).用復制缺陷型痘苗病毒T7載體獲得麻疹病毒，《/.Fra/.me仇64:57-64.Schnell，M丄，Mebatsion，T.AndConzelmann，K.-K.(1994).來自克隆的cDNA的狂犬病病毒，五MBOJ13:4195-4203.Schijtze，H,,Enzmann,P.-J.，Kuchling,R.，Mundt.，E.，Niemann,H.andMettenleiter,T.C(1995).魚彈狀病毒感染性造血干細胞壞死病毒的完整基因組序列，普通病毒學雜志76:2519-2527.Smith,A丄.，Tignor，G.H.，MifUne,K"andMotohashi，T.(1977).CER細胞中狂犬病血清組病毒的分離和分析，Intervirlogy8:92-99.Spradbrow,RB.(1988).地理分布，見D丄Alexander(ed.),《新城疫》，pp.247-255.Kluwer學術出版社，波士頓。Staiiber，N.，Brechtbiihl,K.,Bruckner,L.andHofinann，M.A.(1995).用聚合酶鏈反應和擴增的DNA的直接測序檢測家禽疫苗中的新城疫病毒，疫苗13:360-364Steward,M.,Vipond，I.B.,Nillar,N.S.andE謹erson，P.丁.(1993》新城疫病毒中的RNA編輯，普通病毒學雜志74:2539-2547.Taylor,J.,Edbauer，C.,Rey-Senelonge，A.，Bouquet,J.，Norton,E.，Goebel，S.,Desmettre，P,andPaoletti,E.(1990).在禽痘病毒重組體中表達的新城疫病毒融合蛋白在雞中賦予保護，病毒學雜志64:1441-1450,Tessier,D.C.，Brousseau，R"andVernet,T.(1986).TRRNA連接酶對單鏈寡脫氧核糖核苷酸的連接，分析生物化學158:171-178.Vieira，J"andMessing,J.(1991).具有不同選擇標記和DNA復制起點的新pUC衍生的克隆載體，基因100:189-194.Vindevogel，H.andDuchatel，J.R(1998).鵒中流行的新城疫病毒，見D.J.Alexander(ed,)，《新城疫》，pp.4-184-196.Kluwer學術出版社，波士頓。Whelan，S.P.J"Ball,L.A.,Barr，J.N.andWertz,G.T.W.(1995).完全從cDNA克隆有效回收感染性水泡性口炎病毒，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:8388-8392.Wensvoort,G"Terpstra，C.，Bonstra,J.，Bloemraad，M.andVanZaane，D.(1986).抗豬瘟病毒的單克隆抗體的生產(chǎn)及其在實驗室診斷中的應用，Vet.Microbiol.12:101-108.Yusoff，K.,Millar,N.S.，Chambers,R，andEmmerson,P.T.(1987).新城疫病毒L基因的核苷酸序列分析:與仙臺病毒和水泡性口炎病毒的同源性，Wmc/.力"V^7as.15:3961-3976.表1<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表1(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表1(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表1(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>表2NDV毒株LaSota基因組的3'和5'末端序列<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表2(續(xù))r2601-19ACCAAACAAAGATTTr2601-r2601-2021AACAAGGTGAAGATA.ACCAAACAAAGATTTpGEM4Z克隨克隆序列r3101-r3101-r3101-r3101-r3101-'1617181922ACCAAACAAAGATTTACCAAACAAAGATTT'ACCAAACAAAGATTTACCAAACAAAGATTTACCAAACAAAGATTT共有ACCAAACAAAGATTT表3NDV輔助病毒的小基因組復制A.用p0LTV535和pOLTV553系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CER—C9細胞后的SEAP活性(cps)<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表4CER細胞用已轉(zhuǎn)染有p0LTV553系列質(zhì)粒并已用NDV超感染的FPV—T7感染的CER細胞(見表3)的上清處理后SEAP活性(cps)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pOI/TV553N02.4X103pOLTV553Nl6.2p01/TV553N22.0pOLTV5"53N320.6pOLTV553N42.0p01/TV553N52.1表5pOLTV553系列質(zhì)粒與質(zhì)粒pClneoNP，pClneoP和pClneoL(c)(或作為陰性對照的pClneo)共轉(zhuǎn)染GER細胞后的SEAP活性(cps)質(zhì)粒NP,P&LNP,P&pCIneo比率pOI/TV553NO3.1x10*2.7x10311.7pOL/TV553Nl4.15.27.9pOJLTV553N2.3.13.110.0pO!iTV553N335.93.6100.8pOLTV553N41.94.64.1pOLTV553N51.04.12.權利要求1.禽副粘病毒cDNA，其包含位于其5’末端的相應于圖3中第14973-15186位核苷酸的核酸序列和位于其3’末端的相應于圖3中第1-119位核苷酸的核酸序列，使得能夠產(chǎn)生禽副粘病毒血清型1的感染性拷貝。2、權利要求1的cDNA，包含全長cDNA。3、一種cDNA，其包含相應于新城疫病毒基因組的5'末端的核酸序列和相應于新城疫病毒基因組的3'末端的核酸序列，使得能夠產(chǎn)生復制型禽副粘病毒血清型1小基因組，其中所述3，末端相應于圖3中第1-119位核苷酸，所述5'末端相應于圖3中第14973-15186位核苷酸。4、權利要求1、2或3的cDNA，其至少部分衍生于新城疫病毒。5、權利要求4的cDNA，其中所述的新城疫病毒是輕型病毒，優(yōu)選衍生自疫苗株。6、權利要求5的cDNA，其中所述疫苗株是LaSota毒株ATCCVR-699。7、權利要求l、2或3的cDNA，其核酸中額外引入一種修飾。8、權利要求7的cDNA，其中所述核酸編碼修飾的蛋白酶裂解位點。9、權利要求8的cDNA，其中所述裂解位點是融合蛋白的蛋白酶裂解位點。10、權利要求7的cDNA,其中所述核酸編碼雜合病毒包膜蛋白。11、權利要求10的cDNA，其中所述雜合病毒蛋白是血凝素-神經(jīng)酰胺酶蛋白。12、權利要求7的cDNA，其中所述修飾包含編碼一病毒蛋白的核酸中的缺失。13、權利要求12的cDNA，其中所述病毒蛋白是基質(zhì)蛋白。14、權利要求1、2或3的cDNA，其額外包含編碼異源抗原的核酸。15、權利要求14的cDNA，其中所述抗原衍生自家禽病原體。16、權利要求14或15的cDNA，其額外包含編碼免疫刺激蛋白的核酸。17、由權利要求1、2、3、6、9、11或16的cDNA獲得的RNA。18、產(chǎn)生感染性拷貝禽副粘病毒的方法，包括用權利要求l、2、4、6、9、11、15或16的cDNA轉(zhuǎn)染至少一個細胞。19、權利要求18的方法，其中所述細胞至少能表達病毒核衣殼、磷蛋白或大聚合酶蛋白。20、權利要求18或19的方法，進一步包括使得所述病毒的融合蛋白裂解。21、權利要求18-20中任一項的方法，進一步包括將所述細胞在包含蛋白酶解活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。22、權利要求21的方法，其中所述培養(yǎng)基包含尿囊液，所述尿囊液包含所述蛋白酶解活性。23、權利要求18-22中任一項的方法，其中所述細胞衍生自雞細胞。24、由權利要求18-23中任一項的方法獲得的感染性拷貝禽副粘病毒o25、一種包含權利要求24的病毒的疫苗。26、權利要求25的活疫苗。27、權利要求25或26的疫苗，其中所述感染性拷貝禽副粘病毒至少部分衍生于新城疫病毒。28、一種將用權利要求27的新城疫病毒疫苗接種的動物的樣品與被野生型新城疫病毒感染的或用未修飾的中等毒力或輕型新城疫病毒毒株接種的動物的樣品區(qū)分開的方法，該方法包括確定在動物的至少一個樣品中是否存在抗由所述野生型或未修飾的新城疫病毒而非所述疫苗表達的免疫顯性表位或標記的抗體。29、權利要求28的方法，其中所述抗體抗新城疫病毒的血凝素-神經(jīng)酰胺酶或融合蛋白。30、權利要求28或29的方法，其中所述動物選自由家禽組成的—組。31、一種診斷試劑盒，其用于將用權利要求27的新城疫病毒疫苗接種的動物的樣品與被野生型新城疫病毒感染的或用未修飾的中等毒力或輕型新城疫病毒毒株接種的動物的樣品區(qū)分開，所述試劑盒配有由所述野生型或未修飾的新城疫病毒而非所述疫苗表達的免疫顯性表位或標記，和/或抗所述表位或標記的抗體，所述試劑盒進一步配有一種檢測抗體與所述表位或標記結合的手段。32、從復制型禽副粘病毒小基因組產(chǎn)生一種蛋白的方法，包括用權利要求3的cDNA轉(zhuǎn)染至少一種細胞。33、權利要求28或29的方法，其中所述動物為雞。全文摘要本發(fā)明涉及完全從克隆的全長cDNA產(chǎn)生感染性新城疫病毒(NDV)的方法，以及用所述方法產(chǎn)生的和衍生自所述方法的疫苗和診斷分析的應用。所述方法提供了用基因修飾來修飾NDV基因組的可能性并使得能導入突變、缺失和/或插入。所述方法可用于修飾NDV的毒力，由此產(chǎn)生具有改進性質(zhì)的新減毒活疫苗。所述方法還可用于修飾NDV的抗原組成，由此使得能產(chǎn)生可與NDV野外毒株血清學區(qū)分的活NDV標記疫苗。文檔編號C12Q1/70GK101275142SQ20081009214公開日2008年10月1日申請日期1999年6月17日優(yōu)先權日1998年6月19日發(fā)明者伯納德斯·彼得魯斯·許貝特斯·佩特斯,古阿斯·科克,奧拉夫·斯文·德萊烏,阿爾努·萊昂納德·約瑟夫·吉爾肯斯申請人:Id-萊利斯塔德動物育種及動物保健研究所公司