專利名稱：殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種殼聚糖新城疫疫苗納 米粒的制備方法。
背景技術：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性、致死性傳染病，常呈敗血癥，是危害養禽業的最重要傳染病之一，被國際獸醫局定為I類傳染病。控制ND最根本的措施是進行有效的疫苗接種，目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和滅活疫苗，但二者在實際應用中均存在一定的局限性。ND油乳劑滅活疫苗通過注射免疫雞體后可產生較高水平的血液循環抗體，但在抵抗呼吸道和消化道病原感染的黏膜系統中卻有局限性，很難阻止病原通過黏膜組織侵入動物體內，且對已經進入細胞的病毒很難發揮作用；ND弱毒活疫苗雖然可以產生一定的黏膜免疫和體液免疫，但受免疫方法和途徑影響，產生的循環抗體較低，維持期短。飲水免疫很容易造成疫苗被消化道降解，導致疫苗吸收效率低；滴鼻點眼也只能使疫苗在鼻腔內存在 15min，致使疫苗不能有效進入機體激發有效的黏膜免疫；氣霧免疫產生的黏膜免疫效果較好，但容易誘導慢性呼吸道疫病，且弱毒苗均不能產生較高的血清抗體等。因此，如何提高新城疫疫苗的免疫效果，研制出既能產生較強的體液免疫抗體又能產生高效的局部黏膜免疫的新型疫苗已成為ND疫苗研究的焦點。近年來隨著新型材料學和制劑新技術的發展，迫切需要一種新的疫苗遞送方法以降低傳染病的死亡率。目前，國內外尚未有利用NDV進行納米疫苗研究的報道。

發明內容
本發明提供一種殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法。本發明殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，按以下步驟進行一、將殼聚糖分散于滅菌的蒸餾水中，在磁力攪拌下，加入體積濃度為36%乙酸，繼續攪拌5 15min，用 0. 22 μ m濾器過濾，靜置至氣泡消去，即得到殼聚糖溶液；二、取5mL步驟一制備的殼聚糖溶液，向其中滴加2 3mL病毒含量為IO8 5EID5tl的新城疫L-系病毒液，攪拌混合均勻后，再滴加2 3mL濃度為1. Omg/mL的交聯劑三聚磷酸鈉，然后在常溫、無菌條件下于1000 1400r/min磁力攪拌10 15min，得溶液A ；三、將溶液A于4°C、10000 15000r/min離心 30 40min，取沉淀，將沉淀經無菌水洗3 5次，然后真空冷凍干燥22 25h，即得到殼聚糖新城疫疫苗納米粒(NDV-CS-NPs)；其中步驟一中殼聚糖的質量與蒸餾水的體積比為 Ig 900 920mL，步驟一中殼聚糖的質量與乙酸的體積比為Ig 80 85mL。本發明殼聚糖新城疫疫苗納米粒具有巨大的應用潛力，本發明制備的殼聚糖新城疫疫苗納米粒(NDV-CS-NPs)與傳統疫苗相比，其優勢在于穩定性強、釋藥時間長；同時，在保證藥物作用的前提下，減少了給藥劑量、減輕或避免了毒副反應、可延長免疫保護期，避免了多次反復給藥，且載體材料殼聚糖本身無毒，生物相容性好，可生物降解，可通過體內的水解或酶解反應，最終降解為水和CO2，被人體吸收或排出體外，因而是一種具有廣闊應用前景的新型載體疫苗。本發明制備的殼聚糖納米粒疫苗的免疫途徑不受限制，可肌注、點目艮，也可口服，且能提高機體免疫力，延長藥物在體內作用時間，減少給藥次數。另外，本發明也為新城疫疫苗在臨床上廣泛應用提供了一個免疫效果好和安全性能高的遞藥系統；在此基礎上可將該研究成果應用到更多的動物疫苗和藥物體系中，促進疫苗的在畜牧業和臨床的實際應用。經透射電子顯微鏡觀察本發明制備的NDV-CS-NPs形態規則、外形圓整、表面光滑、分散性好，無明顯粘連、破損、塌陷等現象(如圖1所示)，NDV-CS-NPs粒徑為147. 72 594. 4nm,平均粒徑為371. Inm,粒徑分布較窄，Zeta電位為+2. 84mV。本發明制備的 NDV-CS-NPs經黏膜免疫能顯著增強T細胞的免疫效果，產生較強的體液免疫和局部的黏膜免疫，且與La Sota活疫苗組相比，NDV-CS-NPs組抗體水平持續時間明顯延長，NDV-CS-NPs 在雞體內起到了緩釋作用；同時克服了常規疫苗在儲存和運輸過程中易失活等缺點，且用本發明方法所制備處的NDV-CS-NPs易于保存，穩定性高、包封率高、毒性小、藥物生物利用度高、成本低、易于工業化生產。使用本發明方法制備的DNA疫苗納米粒在保證DNA疫苗穩定性的條件下具有較高的包封率，包封率為74. O士3.7%，可以保持體內最佳的藥物濃度，并且延長藥物作用的時間。因此，本發明方法制備的DNA疫苗納米粒可實現藥物的緩釋。本發明方法具有工藝簡便、制備成本低、工藝重現性好、樣品需要量少，較好保持了 ND病毒結構蛋白的抗原性等優點，試驗篩選的NDV-CS-NPs制備方法也可放大到生產應用，因而對產業化的應用具有指導意義。本發明制備的NDV-CS-NPs中病毒含量為108_5EID5(1/0. lmL，符合《中華人民共和國獸用生物制品規程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液標準。NDV-CS-NPs可用于雞新城疫免疫，經口服給藥，給藥量為每只雞0. 25mL


圖1為本發明NDV-CS-NPs的透射電子顯微鏡觀察圖；圖2為具體實施方式
一制備的NDV-CS-NPs的粒徑分布圖；圖3為具體實施方式
一制備的NDV-CS-NPs的Zeta電位圖； 圖4為具體實施方式
一中通過Western-blotting分析比較包裹前后納米粒中NDV體外免疫原性圖；其中M為蛋白marker，1為NDV原液，2為從納米粒中回收的NDV。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，按以下步驟進行一、將殼聚糖分散于滅菌的蒸餾水中，在磁力攪拌下，加入體積濃度為36%乙酸，繼續攪拌5 15min，用0. 22 μ m濾器過濾，靜置至氣泡消去，即得到殼聚糖溶液；二、取5mL步驟一制備的殼聚糖溶液，向其中滴加2 3mL病毒含量為108_ 5EID5tl的新城疫 L-系病毒液， 攪拌混合均勻后，再滴加2 3mL濃度為1. Omg/mL的交聯劑三聚磷酸鈉(TPP)，然后在常溫、無菌條件下于1000 1400r/min磁力攪拌10 15min，得溶液A ；三、將溶液A于4°C、 10000 15000r/min離心30 40min，取沉淀，將沉淀經無菌水洗3 5次，然后真空冷凍干燥22 25h，即得到殼聚糖新城疫疫苗納米粒；其中步驟一中殼聚糖的質量與蒸餾水的體積比為Ig 900 920mL，步驟一中殼聚糖的質量與乙酸的體積比為Ig 80 85mL。本實施方式步驟二所述新城疫L-系病毒液中病毒為La Sota株。

本實施方式制備的殼聚糖新城疫疫苗納米粒(NDV-CS-NPs)在_20°C條件下可保存3個月，經透射電鏡觀察，本實施方式方法制備的NDV-CS-NPs粒徑為147. 72 594. 4nm, 平均粒徑為371. Inm(如圖2所示)，粒徑分布較窄，Zeta電位為+2. 84mV(如圖3所示)。取5mL本實施方式制備的NDV-CS-NPs溶液在4°C、13000r/min條件下離心lOmin， 取上清液，記錄體積后，采用考馬斯亮藍法(CBB法)測定上清中游離病毒蛋白濃度，計算 NDV-CS-NPs 包封率EE(%) = [(Wtl-W1)/W。] X 100%，其中W。為加入的總病毒中的蛋白總量A為上清中游離的病毒中的蛋白總量。本實施方式制備的NDV-CS-NPs的包封率為74. O士3. 7%。本實施方式制備的NDV-CS-NPs中病毒含量測定通過測定雞胚半數感染量(EID5tl)來計算病毒含量。取凍干NDV-CS-NPs 100 μ g， 加入至IOmL pH7. 2的PBS緩沖液中，再加入2mL質量濃度為0. 25%的胰酶，置2 8°C冰箱處理72h。之后，以2000r/min離心5min，取上清液用滅菌生理鹽水做10倍系列稀釋， 取10-6、10_7、10-8三個稀釋度，分別接種10日齡SPF雞胚5個，置37°C孵化器繼續孵化，棄去24h內死亡的雞胚，此后每6h照蛋一次，及時將死亡雞胚取出置2 8°C保存，至120h 將雞胚全部取出，逐個檢測雞胚尿囊液的HA效價，HA ^ 71og2判為陽性。按Reed-Muench 法計算EID5tlt5同時，設未接種的10日齡SPF雞胚5個做空白對照。結果是本發明制備的 NDV-CS-NPs中病毒含量為IO8 5EID5tlA). ImL(如表1所示)，符合《中華人民共和國獸用生物制品規程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液標準。表1病毒含量測定結果
權利要求
1.殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，按以下步驟進行一、將殼聚糖分散于滅菌的蒸餾水中，在磁力攪拌下，加入體積濃度為36 %乙酸，繼續攪拌5 15min，用0. 22 μ m濾器過濾，靜置至氣泡消去，即得到殼聚糖溶液；二、取5mL步驟一制備的殼聚糖溶液，向其中滴加2 3mL病毒含量為108_5EID5tl的新城疫L-系病毒液，攪拌混合均勻后，再滴加2 3mL濃度為1. Omg/mL的交聯劑三聚磷酸鈉， 然后在常溫、無菌條件下于1000 1400r/min磁力攪拌10 15min，得溶液A ；三、將溶液A 于4°C、10000 15000r/min離心30 40min，取沉淀，將沉淀經無菌水洗3 5次，然后真空冷凍干燥22 25h，即得到殼聚糖新城疫疫苗納米粒；其中步驟一中殼聚糖的質量與蒸餾水的體積比為Ig 900 920mL，步驟一中殼聚糖的質量與乙酸的體積比為Ig 80 85mL。
2.根據權利要求1所述的殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于步驟一中殼聚糖的質量與蒸餾水的體積比為Ig 917mL。
3.根據權利要求1或2所述的殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于步驟一中殼聚糖的質量與乙酸的體積比為Ig 83mL。
4.根據權利要求3所述的殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于步驟二中取5mL步驟一制備的殼聚糖溶液，向其中滴加2. 5mL病毒含量為108_5EID5tl的新城疫L-系病毒液。
5.根據權利要求4所述的殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于步驟二中滴加2. 5mL濃度為1. Omg/mL的交聯劑三聚磷酸鈉。
6.根據權利要求5所述的殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于步驟二中于UOOr/min磁力攪拌lOmin。
7.根據權利要求6所述的殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，其特征在于步驟三中于 40C、13000r/min 離心 30min。
全文摘要
殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法，涉及一種殼聚糖新城疫疫苗納米粒的制備方法。方法一、將殼聚糖分散于滅菌的蒸餾水中，在磁力攪拌下，加入乙酸攪拌，過濾，靜置至氣泡消去，即得到殼聚糖溶液；二、取殼聚糖溶液，向其中滴加新城疫L-系病毒液，攪拌混合均勻后，再滴加交聯劑，然后在常溫、無菌條件下攪拌得溶液A；三、將溶液A離心取沉淀，將沉淀經無菌水洗滌，然后真空冷凍干燥，即得到殼聚糖新城疫疫苗納米粒。本發明的疫苗納米粒穩定性強、釋藥時間長，在保證藥物作用的前提下，減少了給藥劑量、減輕或避免了毒副反應、可延長免疫保護期。
文檔編號A61P31/14GK102327228SQ20111028879
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者趙凱 申請人:黑龍江大學