專利名稱：：結核分枝桿菌粘附素hbha在結核病診斷與治療中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明總體涉及結結核病的診斷、預防和治療，特別的，本發明涉及結核分枝桿菌粘附素HBHA在診斷、預防和治療結核病中的應用。
背景技術：
：結核病是由結核分枝桿菌侵入體，引起的慢性傳染病。人體除了毛發，牙齒和指曱以外，其他任何部位都可以發生結核病，發生在不同器官的結核病就被稱為這一器官的結核病，如結核病發生在骨骼，稱為骨結核；發生有肺部，稱為肺結核。結核病起病較隱匿，病情進展緩慢，病程比較長，是一種慢性消耗性疾病。患病器官的功能因存在結核病變而嚴重破壞。因而對人類的健康和生命危害極大。結核病實驗室診斷目前有細菌學，免疫學，以及分子生物學方法。目前用于臨床免疫學檢測的有以ESAT6、PT63、MPT64、CFP10等為基礎的方法。在結核病治療方面，目前結核分枝桿菌的耐藥性已成為結核病治療的難點，新的抗結核藥物會給結核病治療帶來新希望。因此，本領域需要用于預防、治療和檢測結核病的改進的疫苗和方法。
發明內容細菌粘附素是細菌在其表面表達的一種物質，具有凝集素樣特性，能夠凝集紅細胞，并與宿主細胞表面表達的互補的糖綴生物結合，參與介導-宿主細胞間的相互作用，促進細菌自體凝集。細菌通過粘附素粘附到哺乳動物宿主組織，在介導微生物致病性方面是一種重要的毒力因素。HBHA是結核分枝桿菌分泌的一種粘附素，它是由致病性結核分枝桿菌產生的一種糖蛋白，能通過其賴氨酸豐富的碳末端功能區域非吞噬細胞(如上皮細胞等)上含硫酸乙酰肝素的受體結合，從而介導肺結核和肺外播散性結核的發生。但目前仍未有關于分枝桿菌粘附素HBHA在于預防治療、診斷結核病中的應用方面的研究。3本發明的發明人發現，HBHA是結核分枝桿菌的細胞表面蛋白，在結核患者的血清中存在抗HBHA的抗體，因此可以通過使用預先制備好的HBHA蛋白對血清中是否存在抗HBHA的抗體進行檢測，如果結果為陽性，則說明血清中存在抗HBHA的抗體，進而該患者患有結核病。另外，還可以通過對患者注射HBHA,使患者體內產生抗HBHA的抗體，進而治療結核病，或者達到預防的目的。本發明的發明人進一步發現，HBHA的上述功能是通過其抗原決定簇發揮的。因此，本發明提供了一種多肽，其包含結核桿菌粘附素HBHA的抗原決定簇，其中所述結核桿菌粘附素HBHA的抗原決定簇序列包含Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu(SEQIDNO:4)。除非明確說明外，這里所使用的術語"多肽"包括任何長度的氨基酸鏈，其中的氨基酸殘基由共價鍵肽鍵連接。這樣，所述多肽包含HBHA蛋白的抗原決定簇氨基酸序列，還可以包含附加序列。本領域4支術人員可以理解，所述的附加序列可以來自于天然結合分枝桿菌抗原，因此所述附加序列也可以是免疫原性的。所述"免疫原性"是指在患者(包括人)和/或生物樣品中激發免疫反應(例如，細胞免疫)的能力。例如，所述多肽可以是全長蛋白質的HBHA蛋白。本發明的發明人發現，對HBHA的抗原決定簇進行保守取代仍可達到本發明的目的。所述的保守取代，是指在多肽中的氨基酸被其他氨基酸所取代后，免疫原性并沒有實質性的改變。例如下表中第3列同一行中的氨基酸可以相互替換<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>需要說明的是，本領域技術人員可以理解，對于氨基酸名稱的縮寫有兩種方式，分別使用三個字母與一個字母，這兩種縮寫是——對應的。例如，丙氨酸可以縮寫為"Ala",也可以縮寫為"A"。如在生物化學，王鏡巖/朱圣庚/徐長法2006-10第三版中所描述的。在本發明的一個實施例中，根據本發明實施例中所提供的實驗方法進行驗證，與本發明的多肽或核酸高度同源的多肽或者核酸也可以用于實現本發明的目的。根據本發明，"同源蛋白質"可以被理解為包括蛋白質，該蛋白質含有至少70%氨基酸序列相應于本發明的氨基酸序列，或者該蛋白質由前面所述的多聚核苷酸序列編碼，優選至少80%，更優選至少90%，最優選95%，其中相應被理解為是指相應的氨基酸相同的或者互補的同源氨基酸。同源性，通常可以用已知的軟件或者電腦程序來分析，例如BestFit或者Gap配對比對軟件(GCGWisconsinPackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin53711)。另一方面，本發明還提供了核酸分子，其包含編碼所述HBHA的抗原決定簇的核苷酸序列，以及包含所述核酸分子的表達載體。所述核酸分子和表達載體可以用于轉化或者轉染宿主細胞。因此，本發明還提供了一種宿主細胞，其中所述被核酸分子和表達載體所轉化。本發明還提供了一種治療結核病的藥物組合物，其中所述組合物包含一種或者多種多肽和生理學上可以接受的載體，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇。另一方面，本發明還提供了一種治療結核病的藥物組合物，其中所述組合物包含核酸分子和生理學上可以接受的載體，其中所述核酸分子包含編碼所述HBHA的抗原決定簇的核香酸序列。另一方面，本發明還提供了一種疫苗，所述疫苗包含多肽，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇。另外，在本發明的一個實施例中，所述疫苗還可以含有免疫反應增強劑，所述免疫反應增強劑包括但不限于CpG寡核苷酸。在本發明中所使用的術語"抗原決定簇"是抗原分子表面的特定化學基因，其決定抗原的特異性。因此，抗原決定簇是免疫應答和免疫反應具有特異性的物質基礎。另一方面，在一個實施例中，還可以將編碼外源性抗原的基因直接導入人或動物體內，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產生免疫應答。抗原基因在一定時限內的持續表達，不斷刺激機體免疫系統，達到免疫的目的。因此，本發明還提供了一種疫苗，所述疫苗包含一種或者多種核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼所述HBHA的抗原決定簇的核普酸序列。另外，本發明還提供了一種診斷試劑盒，其中所述試劑盒多肽，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇。另一方面，本發明還提供了一種抗體，是通過使用氨基酸序列中包含HBHA的抗原決定簇的所述多肽對哺乳動物進行免疫而產生的。所述哺乳動物通常是人，但也可以是動物，典型的宿主是可以被分支桿菌天然或人工感染的。宿主可以是哺乳動物，例如靈長類動物、牛、綿羊、豬、獾和嚙齒類動物如大鼠和小鼠。根據本發明的實施例，本發明可以用于治療、診斷和預防的結核病包括但不限于原發性肺結核、血行播散性肺結核、繼發性肺結核、結核性胸膜炎以及其他肺外結核。其中原發性肺結核為原發結核感染所致的臨床病癥，包括原發綜合征及胸內淋巴結結核。血行播散性肺結核包括急性血行播散性肺結核(急性粟粒型肺結核)及亞急性、慢性血行播散性肺結核。繼發性肺結核包括浸潤性、纖維空洞及干酪性肺炎等。結核性胸膜炎包括結核性干性胸膜炎、結核性滲出性胸膜炎、結核性膿胸。其他肺外結核核包括骨關節結核、結核性腦膜炎、腎結核、腸結核等。根據本發明的實施例，可以在本發明中使用的藥物上可以接受的載體是指藥物上可以接受的材料、組合物、媒介物例如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑或溶劑封裝材料，其參與將對象化合物從身體的一個器官或身體部分攜帶或轉送到其他身體的器官或身體部分。載體是"可以接受的，，的意思是與制劑的其他成分兼容，并適合用于患者。能夠作為藥物上可以接受的載體的材料的例子包括但不限于(l)糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素和纖維素醋酸酯；(4)西黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形6劑，諸如椰子油和栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，諸如丙二醇；(ll)多羥基化合物，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁;(15)褐藻酸；(16)無熱源水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution);(19)乙醇；(20)pH緩沖液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)在藥物制劑中采用的其他無毒性的兼容材料。本發明的藥物組合物，可以通過以可注射組合物的形式施用，但是也可以配制成眾所周知的藥物遞送系統(例如口服、直腸、胃腸外(靜脈內、肌肉內或者皮下)、池內、陰道內、腹膜內、局部(粉末、軟膏或者滴劑)、或者作為口腔噴霧劑或者鼻腔噴霧劑)。需要說明的是，本發明中所使用的術語"治療，，不必然意味著完全治愈。對不期望癥狀或者疾病病理影響的任何緩解到任何程度，或者疾病進展速度的降低都可以被認為是治療。而且，治療可以包括使患者的整體健康感覺或者外形變差的行為。例如，對癌癥患者進行化學療法，其可能使患者感覺"病情更嚴重"，但仍被認為是治療。在本發明中所使用的術語"預防"是指降低生物體感染或發展出與結核病相關的疾病或癥狀的可能性。在某些情況中，應當將另一種治療藥劑與至少一種這里所述的提取物聯合給藥。僅僅作為例子，如果接受其中一種這里所述提取物治療的患者同時患有高血壓，那么應當與初始治療劑聯合給藥抗高血壓劑。本發明的上述和/或附加的方面和優點從下面結合附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1表示SDS-PAGE檢測分離純化天然與重組的HBHA蛋白。圖2表示Western-blot檢測分離純化的天然與重組的HBHA蛋白。圖3以散點圖的形式表示ELISA方法檢測各實驗組血清HBHA抗體在OD450的吸光^f直分布。圖4表示免疫預防組病理學結果(HE染色，400X)。7圖5表示免疫預防組病理切片抗酸染色結果(抗酸染色，400X)。圖6表示免疫治療組病理學結果(HE染色，400X)。圖7表示免疫治療組病理切片抗酸染色結果(抗酸染色，400X)。下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能解釋為對本發明的限制。具體實施例方式實施例1HBHA抗原決定簇的研究HBHA的基因全長序列為atggctgaaaactcgaacattgatgacatcaaggctccgttgcttgccgcgcttggagcggccgacctggccttggccactgtcaacgagttgatcacgaacctgcgtgagcgtgcggaggagactcgtacggacacccgcagccgggtcgaggagagccgtgctcgcctgaccaagctgcaggaagatctgcccgagcagctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctgcgtaaggccgccgagggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgagcgcggtgaggccgctctagagcggctgcgcagccagcagagcttcgaggaagtgtcggcgcgcgccgaaggctacgtggaccaggcggtggagttgacccaggaggcgttgggtacggtcgcatcgcagacccgcgcggtcggtgagcgtgccgccaagctggtcggcatcgagctgcctaagaaggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggcggcggccaagaaggcgcccgcgaagaaggcggcggccaagaaggtcacccagaagtag(SEQIDNO:1)。其氨基酸序列為MAENSNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRQIDNO:2)申請人確定HBHA抗原決定簇的氨基酸序列為Arg43-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser匿Arg-Val-Glu51。根據固相化學合成法方法，申請人合成了多肽A，經測序，其氨基酸序列為Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu(SEQIDNO:4)。實施例2結核分枝桿菌粘附素HBHA的制備及其在診斷結核病中的應用2.1天然HBHA蛋白的制備(1)BCG菌抹的培養將在固體培養基上培養至對數期的BCG菌抹研磨成均勻菌懸液，適量接種于蘇通培養基中，37。C培養至穩定期。(2)天然HBHA蛋白的分離純化及其Western-Blot鑒定BCG在2L改良蘇通培養基中37。C培養至穩定期。13000g離心20min,棄上清，沉淀用含有0.05%Tween80的PBS(PBS/TW)洗滌一次，離心棄上清用100mLPBS/TW重懸沉淀，8(TC加熱1h,13OOOg離心20min,棄上清，應用PBS/TW洗滌一次，沉淀重懸于25mL含有lmmol/LPMSF的PBS/TW中，混勻置于冰上間歇超聲25min后，13000g離心20min,收集上清，沉淀進行重復的超聲，離心和收集上清。將收集的上清進行34000g離心3小時，棄去沉淀，取上清500ml通過特異性吸附HBHA的CL-6B層析柱，用100mlPBS緩沖液洗柱，應用含0~500mmol/L的NaCL的PBS洗脫液進行梯度洗脫，流速為1.5ml/min，在洗脫過程中，在波長280nm下監測吸光度，找出最大吸收峰，利用原核表達的HBHA蛋白免疫小白鼠制備的HBHA多抗血清作為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗，進行WestBlot鑒定分離純化的蛋白。結果見圖(1,2)。2.2.重組HBHA蛋白的制備(1)PCR擴增目的基因、連接至T載體、陽性克隆的鑒定及序列分析采用煮沸15mim裂解BCG菌液，取上清進行PCR，引物的設計借助DNAStar軟件，在hbhA基因兩端設計一對PCR引物，由上海生工生物技術有限服務公司合成。上游5'AACGAATTCATGGCTGAAAACTCGAACATT3':下為BamHI酶切位點，下游引物酶切位點為HindIII酶切位點。PCR反應體系為10xBuffer5iu1,DNA模板lpl,5，和3，端引物(10nM)各2p1,TaqDNAPolymerase0.5ju1(5u/ul),MgS04(50mmol/L)2p1，dNTP(2.5mmol/L)4加無菌水至終體積50|ul。退火溫度為55。C。采用膠回收試劑盒回收的目的DNA片段。連接到pMD18-T載體。采用菌落PCR法鑒定陽性克隆后，再進一步雙酶切法(BamHI/HindlII)進行鑒定。鑒定正確的陽性克隆各取兩個送寶生物工程有限公司進行測序。鑒定克隆序列的正確性。測序結果為TTTCAGCC(SEQIDNO:3)。(2)PET-32a(+)表達質粒的構建及陽性菌的小量誘導表達HBHA蛋白質粒提取試劑盒提取裝入T載體的HBHA陽性質粒，酶切后連接到PET-32a(+)表達載體上，然后將經過鑒定的表達載體轉染至BL21大腸桿菌中。挑取單個菌落接種于含有抗生素的LB培養基中(羧芐青霉素100ng/ml)，37。C培養過夜；次日，按l:50擴大培養，37。C培養至菌密度為A600=0.6時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續培養4h。然后進行全菌蛋白的SDS-PAGE電泳分析。并且通過8mol/L尿素裂解菌體后，應用Nisapharose4B特異性吸附柱進行分離純化。洗脫純化產物依次用尿素進行梯度透析(6mol/L,4mol/L,2mol/L，0mol/L)和蛋白的復性。結果見圖(1,2)2.3.HBHA檢測結核病血清抗體水平應用50ul包被液包被天然和重組HBHA蛋白，包被蛋白量0.1jug,以辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體為二抗，對各實驗組血清進行ELISA檢測。結果見圖3，表l。表1HBHA抗原檢測結核分枝桿菌敏感性和特異性血清來源份數敏感性(％)特異性(。/。)天然HBHA重組HBHA天然H朋A重組HBHA肺結核病人4741(87.2'/。)39(83.0%)肺外結核病人4744(93.6%)43(91.5%PPD(+)健康者4746(97.9%)45(95.7%)PPD(-)健康者4745(95.7%)44(93.6W圖3散點圖中顯示(1)天然與重組兩種HBHA蛋白在各組血清樣本抗體檢測中的OD450值分布相近，經統計學檢驗(t爿.069，PX).05)差異沒有顯著性。(2)PPD陽性和PPD陰性健康對照組之間血清抗體水平差異同樣不具有顯著性(t=1.238，P〉0.05)。(3)肺結核組與肺外結核組的血清抗體OD值分布在散點圖中顯示差異明顯，肺結核OD450值分布集中分布在0.30-0.40之間，肺外結核OD450值分布在0.350-0.45之間。經統計學檢驗(t42.224,PO.05)結差異具有顯著性。(4)結核組(肺結核，肺外結核)與對照組(PPD陰性，PPD陽性)OD450值分布具有顯著不同。散點圖中很直觀的顯示對照組全部小于0.3，結核組OD值則集中分布于0.30-0.45之間。結核組與健康組之間(t=25.909,P<0.05)血清抗體水平具有顯著性差異。實施例3結核分枝桿菌粘附素hbha在預防中的作用3.1實^r動物分組將實驗動物隨機分為以下5組CpG免疫預防組，HBHA免疫預防組，CpG+HBHA免疫預防組，BCG免疫預防組和對照組。3.2給藥方法CpG免疫預防組腹腔注射每只小鼠CpG30jug，HBHA免疫預防組腹腔注射每只小鼠HBHA5jug，CpG+HBHA免疫預防組腹腔注射CpG30mg和HBHA5jug，給藥后14天攻毒，BCG免疫預防組尾靜脈注射BCG1~=2x105CFU。對照組在攻毒前注射100ul生理鹽水。2周后加強免疫1次。3.3結核病小鼠模型的建立取在改良羅氏培養基上生長良好的結核分枝桿菌H37Rv2周的培養物，用瑪瑙乳缽磨成10mg/3ml的均勻菌懸液，用生理鹽水稀釋成lmg/3ml的菌懸液，從小鼠尾靜脈注射0.3ml(相當于濕菌O.lmg)，含菌量約為106CFU。ii3.4結核分枝桿菌培養與病理檢查攻毒后4周脫頸處死小鼠，其中每組2只小鼠作病理檢查，2只小鼠進行結核分枝桿菌培養。電子天平稱取結核分枝桿菌培養組小鼠體重，立刻無菌解咅'1,稱取肺臟和脾臟重量，將肺臟和脾臟在組織研磨器中磨成均勻的細胞懸液，用生理鹽水按l:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀釋的組織勻漿液100ul，接種于羅氏培養基斜面。每個稀釋度做2個復管。先傾斜10度放置1小時，37。C培養，28天后觀察結果。病理檢查組小鼠處死后，取肺臟和脾臟放入10。/。中性曱醛中固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，分別做HE和抗酸染色。3.5實驗結果小鼠肺脾濕重，結果見表2表2免疫預防組攻毒4周后各研究組小鼠體重與肺脾重量(g)組別體重肺脾CpG20.430.380.67HBHA22.060.360.59CpG+H朋A18.850.310.63BCG預防組16.830.270.23空白對照20.100.320.52本研究每組選擇2只小鼠，稱體重，處死后稱肺脾濕重，取2只小鼠的均值。結果顯示，BCG預防組在小鼠體重和肺脾濕重方面明顯^f氐于其它各對照組。菌落計數結果，本研究每組選擇2只小鼠，處死后取全肺和全脾，磨成勻漿后，以10倍級數稀釋接種于羅氏培養基，4周后觀察結果，以2只鼠的均值計數菌落數。研究發現HBHA免疫預防組菌落數明顯低于對照組，但明顯高于BCG免疫預防組。見表3。病理檢驗結果，從圖4可以看出空白對照組病理損害相當嚴重，見實變壞死及肉芽胂形成。BCG組雖有局部彌散小病變，肺組織結構基本正常，間質輕度充血，病理損害較輕。其它各組病理損害介于對照組和BCG免疫預防組之間。抗酸染色結果，從圖5可以看出空白對照組病理切片有大量的抗酸桿菌存在，其它各組也可見少量抗酸桿菌。提示其它各組都有一定的預防效果。實施例4結核分枝桿菌粘附素HBHA在治療中的作用124.1實驗動物分組將實驗動物隨機分為以下4組CpG免疫治療組，HBHA免疫治療組，CpG+HBHA免疫治療組和對照組。4.2給藥方法攻毒后14天給CpG免疫治療組腹腔注射每只小鼠CpG30jag,HBHA免疫治療組腹腔注射每只小鼠HBHA5mg，CpG+HBHA免疫治療組腹腔注射CpG30mg和hbha5ng，對照組在攻毒后14天注射100ul生理鹽水。2周后加強免疫1次。4.3結核病小鼠模型的建立與實施例3相同。4.4結核分枝桿菌培養與病理檢查與實施例3相同。4.5實驗結果小鼠肺脾濕重，結果見表4表4免疫治療組治療4周后各研究組小鼠體重與肺脾重量(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>研究發現HBHA免疫治療組菌落計數結果優于空白對照組，其他組間差異不顯著病理檢驗結果和抗酸染色結果，從病理組織學圖譜可以明顯地看出，HBHA免疫治療組的組織損害程度明顯低于空白對照組，和CpG組相當。對于病理切片抗酸染色可見空白對照組細菌數明顯多于其它各組。見圖6，7。從圖6病理組織學圖錯可以明顯地看出，HBHA免疫治療組的組織損害程度明顯低于空白對照組，和CpG組相當。對于病理切片抗酸染色可見空白對照組細菌數明顯多于其它各組。從圖可以看出，對照組小鼠肺組織有大片肉芽腫形成，病理損害相當嚴重。其它各組也可見廣泛的肺部病變彌散分布，但病變程度明顯輕于對照組。從圖7可以看出空白對照組病理切片中有大量的抗酸桿菌存在，其它各組也可見少量抗酸桿菌。提示其它各組都有一定的治療效果。另外，申請人使用多肽A重復了上述病理實驗，發現多肽A在診斷、治療以及預防方面具有與結核分枝桿菌粘附素HBHA相當的作用。從研究結果不難看出結含有SEQIDNO:4序列的多肽，如結核分枝桿菌粘附素HBHA在結核病，尤其是肺外結核病的輔助診斷中具有很好的敏感性與特異性。并且在結核病的治療、預防研究中動物實驗結果也顯示比較明顯的治療效果。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型。14序列表<110〉北京市結核病胸部腫瘤研究所〈120〉結核分枝桿菌粘附素HBHA在結核病診斷與治療中的應用<130〉PIDC080022<160〉4<170〉Patentln3.3版<210><211><212〉<213〉1600DNA結核分枝桿菌<400〉13tggCtg3犯actcgaacattgatgacatcaaggctccgttgcttgccgcgcttggagcg60gCCg3CCtggccttggccactgtcaacgsgttg3tC3Cg3acctgcgtgagcgtgcggag120gagactcgtacggacacccgC3gCCgggtCgaggagagccgtgctcgcctgaccaagctg180caggaagatctgCCCg3gC3gctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctg240cgtaaggccgccgsgggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgag300cgcggtgsggCCgCtCt3g3gcggctgcgcagccagcagsgcttcgaggaagtgtcggcg360cgcgccg犯ggCt3Cgtggaccaggcggtggagttgaccc3gg3ggCgUgggtacggtc420gcatcgcagacccgcgcggtcggtgsgcgtgccgccaagctggtcggcatcgagctgcct480aag犯ggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggcca柳ag540gcggcggcca3g犯ggCgCCcgcgaagaaggcggcggccsagaaggtcacccagaagtag600<210>2〈211>199<212>PRT<213>結核分枝桿菌〈400〉2MetAlaGluAsnSerAsnlieAspAsplieLysAlaProLeuLeuAla151015AlaLeuGlyAlaAlaAspLeuAlaLeuAla丁hrValAsnGluLeulie202530ThrAsnLeuArgGluArgAlaGluGluThrArgThrAspThrArgSer354045ArgValGluGluSerArgAlaArgLeuThrLysLeuGinGluAspLeu505560ProGluGinLeuThrGluLeuArgGluLysPheThrAlaGluGluLeu65707580ArgLysAlaAlaGluGlyTvrLeuGluAlaAlaThrSerArgTyrAsn85909^GluLeuValGluArgGlyGluAlaAlaLeuGluArgLeuArgSerGin100105110GinSerPheGluGluValSerAlaArgAlaGluGlyTyrValAspGin115120125AaValGluLeuThrGinGluAlaLeuGlyThrValAlaSerGinThr130135140ArgAlaVal.GlyGluArgAlaAlaLysLeuValGlylieGluLeuPro145150155160LysLysAlaAlaProAlaLysLysAlaAlaProAlaLysLysAlaAla165170175ProAlaLysLysAlaAlaAlaLysLysAlaProAlaLysLysAlaAla180185lbOAlaLvsLysValThrGinLys<210〉3<2U〉598<212〉DNA〈213>人工序列<400〉3ctacttctgggtgaccttcttggccgccgccttcttcgcgggcgccttcttggccgccgc60cttcttggccggagcggccttcUggccggagcggccttcUggccggagcagccttctt120aggcagctcgatgccgeccagcttggcggcacgctcaccgaccgcgcgggtctgcgatgc180g3ccgtacccaacgcctcctgggtcaactccaccgcctggtccacgtagccttcggcgcg240cgccgacacttcctcgaagctctgctggctgcgcsgccgctctageigcggcctcaccgcg300ctcgaccagctcgttgtaccggctagtcgcggcctcgaggtagccctcggcggccttacg360csgctcctcggcggtgaacttctcacgcagctcggtgagctgctcgggcagatcttcctg420cagct.t.ggtcaggcgagcacggctctcctcgacccggctgcgggtgtccgtacgagtctc480ctccgcacgctC3CgC3ggttCgtg3tC33ctcgttgacagtggccaaggccaggtcggc540cgctccaagcgCggC33gC3acggagccttg3tgtcatca3tgttCg3gttttcagcc598〈210>4〈211〉9〈212>PRT〈213〉人丁序列<400>4ArgThrAspThrArgSerArgValGlu1權利要求1.一種多肽，其包含結核桿菌粘附素HBHA抗原決定簇，其中所述結核桿菌粘附素HBHA抗原決定簇的序列包含SEQIDNO4所示的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的多肽，其序列為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.—種核酸，其包含編碼根據權利要求1所述的多肽的核苷酸序列。4.根據權利要求3所述的核酸，其序列為SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。5.—種表達載體，該載體包含根據權利要求3或4所述的核酸。6.—種治療結核病的藥物組合物，其中所述組合物包含權利要求1或2所述的多肽。7.—種疫苗，所述疫苗包含權利要求1或2所述的多肽。8.—種診斷試劑盒，其中所述試劑盒包含權利要求1或2所述的多肽。9.一種抗體，是通過使用權利要求1或2所述的多肽，或者權利要求3或4所述的核酸對哺乳動物進行免疫而產生的。10.—種基因疫苗，所述疫苗包含權利要求3或4所述的核酸。全文摘要本發明公開了一種多肽，其包含結核分枝桿菌肝素結合血凝素(heparin-bindinghaemagglutinin，HBHA)抗原決定簇，其中所述結核分枝桿菌粘附素HBHA抗原決定簇的序列包含Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu；還公開了一種包含編碼所述多肽的核苷酸序列的DNA分子，以及含有所述核酸分子的載體，使用載體轉化的宿主細胞。另外，本發明還公開了用于診斷、治療和預防結核病的藥物組合物、疫苗和診斷試劑盒。另外，本發明還公開了使用所述多肽對哺乳動物進行免疫而產生的抗體。從研究結果不難看出結核分枝桿菌粘附素HBHA在結核病，尤其是肺外結核病的輔助診斷中具有很好的敏感性與特異性。并且在結核病的治療、預防研究中動物實驗結果也顯示比較明顯的治療效果。文檔編號C12N15/31GK101580542SQ20081009731公開日2009年11月18日申請日期2008年5月12日優先權日2008年5月12日發明者張旭霞,李傳友申請人:北京市結核病胸部腫瘤研究所